一种屋尘螨过敏原Derp1的LAMP可视化检测方法与流程

本发明涉及尘螨过敏原检测重组领域，具体是一种屋尘螨过敏原derp1环介导等温扩增可视化检测方法。
背景技术：
：世界变态反应组织（worldallergyorganization，wao）报告指出，全球变态反应性疾病的总患病率高达22％，此类疾病主要包括过敏性哮喘(哮喘)、过敏性鼻炎等，近年来其发病率在逐步增高。研究发现，尘螨是导致呼吸道变态反应性疾病的最重要因素，居住环境灰尘中尘螨过敏原含量是导致性哮喘患者哮喘发作的重要因素。据报道，尘螨抗原皮试阳性者的哮喘评分与居室中derp1含量相关，当室内没有足够的尘螨孳生时患者也不会出现哮喘症状，当减少和清除居室环境孳生的螨类时，患者在低水平（每克室尘中derp1含量低于2g）的尘螨环境中可减轻患者症状和减少发作。因此，需要建立快速、定量检测尘螨过敏原derp1、derp2浓度的方法可检测室尘中尘螨过敏原含量，监测人群暴露水平，对过敏原环境暴露水平进行评估。因此定量监测环境中尘螨过敏原含量，引导人群主动回避过敏原，从而预防尘螨过敏性疾病的发生更有实用价值。目前国内仅有个别实验室在进行科学研究时才进行尘螨过敏原含量检测，多数研究并不检测尘螨的主要过敏原成分。国外已有以酶联免疫方法开发的商品化的试剂盒供应，但因为价格昂贵而未能在我国广泛应用。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种屋尘螨过敏原derp1的lamp可视化检测方法，该方法能够实现屋尘螨过敏原derp1环介导的可视化检测，方法简单，检测结果易于观察。为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种屋尘螨过敏原derp1环介导等温扩增可视化检测方法，包括以下步骤：活屋尘螨经研钵研碎、组织匀浆器制成匀浆后，提取总rna保存备用；内引物（fip和bip）各1.6µm，外引物（f3和b3)各0.2µm，1.4mmdntp，0.8m甜菜碱betaine(sigma)，6.0mmmgso4(sigma)，2.5µl10×thermopolii(mg2+-free)reactionbuffer[20mmtris–hcl,10mmkcl,10mm(nh4)2so4,0.1%tritonx-100]，8ubstdna聚合酶大片段（neb），5uamvreversetranscriptasexl(takara),0.5µlrna模板，加灭菌双蒸水补足25µl；将反应体系于65℃水浴锅中反应60min，然后80℃水浴10min终止反应；在此基础上，对mg2+浓度(2,4,6,8,10,and12mm)进行优化，进一步对反应温度（56,58,60,62,64,and66◦c）和时间（10,20,30,40,50,60,and70min）进行优化。取2µl扩增产物在1.5%普通琼脂糖凝胶上进行电泳。在扩增产物中加入1.0µlsybrgreeni(100×)(lifetechnology)染料，并将溶液置于365nm紫外光下观察有无荧光产生。如果产生绿色为阳性反应，浅棕色则为阴性反应。进一步的，所述内引物和外引物的设计和合成步骤如下：参照genbank数据库中derp1基因全长序列进行比对分析，选择保守区域，利用在线引物设计软件primerexplore4.0进行rt-lamp引物设计与筛选，每一个lamp反应包括1对外引物、和1对内引物，引物由宝生物合成。进一步的，对各浓度rna利用one-steprnapcrkit进行一步rt—pcr扩增：反应体系为：2.5µl10×onesteprnapcrbuffer，5mmmgcl2，1.0mmdntpmixture，20urnaseinhibitor，5uamvreversetranscriptasexl，2.5uamvoptimizedtaq,0.2mlamp外引物(f3andb3)，0.5µltemplaterna，加灭菌双蒸水补足25µl；反应程序为：50◦c反转录30min,94◦c，2min,然后30循环pcr反应(94◦c，30s；53◦c，30s,72◦c，30s).扩增产物在1.5%普通琼脂糖凝胶上进行电泳。本发明的一种屋尘螨过敏原derp1的lamp可视化检测方法，实现屋尘螨过敏原derp1环介导的可视化检测，检测结果肉眼可见。本发明的检测方法，简单易行，检测结果便于观察，且灵敏度高。附图说明图1为derp1基因rt-lamp检测琼脂糖凝胶电泳示意图；图2为derp1基因rt-lamp检测的特异性荧光第一示意图；图3为derp1基因rt-lamp检测的特异性荧光第二示意图；图4为derp1基因rt-lamp(a-c)和rt-pcr(d)灵敏度检测第一示意图；图5为derp1基因rt-lamp(a-c)和rt-pcr(d)灵敏度检测第二示意图；图6为derp1基因rt-lamp(a-c)和rt-pcr(d)灵敏度检测第三示意图；图7为derp1基因rt-lamp(a-c)和rt-pcr(d)灵敏度检测第四示意图。具体实施方式下面结合附图，对本发明提出的一种屋尘螨过敏原derp1环介导等温扩增可视化检测方法进行详细说明。在一个具体的实施例中，本发明的一种屋尘螨过敏原derp1d的lamp可视化检测方法包括以下步骤：1材料与方法1.1尘螨本课题组人工培养的屋尘螨（dermatophagoidespteronyssinus）、粉尘螨、热带无爪螨、腐食酪螨，培养设备为人工气侯箱(宁波江南仪器厂/rxz-280d)，培养条件为：25℃±1℃，相对湿度70%±5。屋尘螨、热带无爪螨培养基均为鱼粉、酵母粉按一定比例配制，粉尘螨和腐食酪螨培养基均为饲料为面粉和酵母粉按一定比例配制。取此人工培养螨，用爬盘法收集活螨约1000只以上，用无菌生理盐水洗涤后，置rna样品保存液中。试剂bstdna聚合酶(大片段)购自newenglandbiolabs公司，mgso4和betain购自sigma公司。amv反转录酶、one-steprnapcrkit、dntp购自takara公司。trizol和sybrgreeni荧光染料购自北京solarbio公司。rna提取试剂reagent购自lifetechnology公司。引物的设计与合成参照genbank数据库中derp1基因全长序列进行比对分析，选择保守区域，利用在线引物设计软件primerexplore4.0（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）进行rt-lamp引物设计与筛选，每一个lamp反应包括1对外引物(f3、b3)和1对内引物(fip、bip)（表1），引物由宝生物合成。表1derp1rt-lamp引物序列引物长度(nt)序列(5′→3′)f320tcgatacgttgcacgagaacb321agcgtgatagtttggttggtafip44tgggtttgagccaaagcttcacggcacaacgtttcggtatctcabip43gcgctattgccgtcattattggccgcgttgaatgattgttcgg1.4总rna的提取活屋尘螨经研钵研碎、组织匀浆器制成匀浆后按trizol说明书提取总rna,于-80℃保存备用。反应体系及其优化内引物（fip和bip）各1.6µm，外引物（f3和b3)各0.2µm，1.4mmdntp，0.8m甜菜碱betaine(sigma)，6.0mmmgso4(sigma)，2.5µl10×thermopolii(mg2+-free)reactionbuffer[20mmtris–hcl,10mmkcl,10mm(nh4)2so4,0.1%tritonx-100]，8ubstdna聚合酶大片段（neb），5uamvreversetranscriptasexl(takara),0.5µlrna模板，加灭菌双蒸水补足25µl。将反应体系于65℃水浴锅中反应60min，然后80℃水浴10min终止反应。在此基础上，对mg2+浓度(2,4,6,8,10,and12mm)进行优化，进一步对反应温度（56,58,60,62,64,and66◦c）和时间（10,20,30,40,50,60,and70min）进行优化。取2µl扩增产物在1.5%普通琼脂糖凝胶上进行电泳。可视化检测在扩增产物中加入1.0µlsybrgreeni(100×)(lifetechnology)染料，并将溶液置于365nm紫外光下观察有无荧光产生。如果产生绿色为阳性反应，浅棕色则为阴性反应。特异性和灵敏度分析利用优化好的rt-lamp反应体系，以屋尘螨，粉尘螨,热带无爪螨，腐食酪螨rna为待检样品进行检测，检验rt-lamp方法的特异性。观察可视化结果，并取2µlrt-lamp反应产物于2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。将制备的屋尘螨rna按10倍递增稀释，并分别为1.0µg、1.0×10−1µg、1.0×10−2µg、1.0×10−3µg、1.0×10−4µg、1.0×10−5µg、1.0×10−6µg、1.0×10−7µg和1.0×10−8µg，用rt-lamp方法进行检测。进一步与常规rt-pcr方法进行灵敏度比较分析。扩增对各浓度rna利用one-steprnapcrkit(takara)进行一步rt—pcr扩增。反应体系为：2.5µl10×onesteprnapcrbuffer，5mmmgcl2，1.0mmdntpmixture，20urnaseinhibitor，5uamvreversetranscriptasexl，2.5uamvoptimizedtaq,0.2mlamp外引物(f3andb3)，0.5µltemplaterna，加灭菌双蒸水补足25µl。反应程序为：50◦c反转录30min,94◦c，2min,然后30循环pcr反应(94◦c，30s；53◦c，30s,72◦c，30s)。扩增产物在1.5%普通琼脂糖凝胶上进行电泳。临床样品分析2014年3-6月份，采集85份床尘样品，并提取rna进行derp1基因rt-pcr和rt-lamp检测，验证rt—lamp方法的可靠性。结果2.1derp1基因rt-lamp检测方法的最佳反应体系和反应条件通过对mg2+浓度，反应温度（56-66°c）和反应时间（10-70min）进行优化，从电泳结果分析获得了derp1基因rt-lamp检测方法的最佳反应体系和反应条件：内引物（prsv-fip和prsv-bip）各1.6µm，外引物（prsv-f3和prsv-b3)各0.2µm，0.8m甜菜碱，8mmmgso4，2.5µl10×thermopolii(mg2+-free)reactionbuffer[20mmtris–hcl，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，0.1%tritonx-100]，8ubstdna聚合酶大片段，5uamvreversetranscriptasexl，0.5µlrna模板，加灭菌双蒸水补足25µl。将反应体系于62°c水浴锅中反应60min，然后80°c水浴10min终止反应。特异性检验利用上述建立的rt-lamp方法进行检测，只有屋尘螨为阳性结果:琼脂糖凝胶电泳呈现特征性梯形条带（图1）,肉眼和紫外灯下都观察绿色荧光（图1至3），而对粉尘螨、热带无爪螨、腐食酪螨rna检测均为阴性：如图1所示，琼脂糖凝胶均没有特征性梯形条带出现，如图2和3所示，肉眼观察可见棕色，在紫外灯下无荧光。图中，m：d2000dnaladder；1：粉尘螨；2：热带无爪螨；3：腐食酪螨；4：屋尘螨。灵敏度检验如图4所示，所建立的rt-lamp对derp1基因的最小检测量为1.0×10−6µg，即肉眼和紫外灯下都观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳呈现特征性梯形条带，而常规rt-pcr方法最小检测量为1.0×10−5µg，如图5至7所示，结果表面：本试验建立的derp1基因rt-lamp敏感性比常规rt-pcr高10倍。图中，m：d2000dnaladder；11：1.0µg；12：1.0×10−1µg；13：1.0×10−2µg；14：1.0×10−3µg；15：1.0×10−4µg；16：1.0×10−5µg；17：1.0×10−6µg；18：1.0×10−7µg;9：1.0×10−8µg。临床样品检验对85份床尘样品抽提rna后直接进行derp1基因rt-lamp检测，结果有11份为阳性，而常规rt-pcr方法检出为阴性，表明本试验建立的derp1基因rt-lamp方法更敏感。表285份床尘样derp1基因rt-lamp检测结果本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。当前第1页12