一种检测秦川牛GBP2基因CNV标记的方法及其应用与流程

本发明属于分子遗传学研究领域，具体涉及一种检测秦川牛gbp2基因拷贝数变异的方法，该方法利用基因组dna实时定量pcr，以btf3基因为参照，根据2^-δδct值从而确定个体的拷贝数变异。

背景技术：

随着基因组学和生物信息学等相关学科的迅猛发展，动物遗传育种的理论和技术也发生了重大的变化，肉牛的育种也由传统的常规表型选育转向分子选育，目前，分子育种的研究主要集中在标记辅助选择(molecularmark-assistselection,mas)，该技术是通过dna分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的dna标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

拷贝数变异(copynumbervariations,cnvs)是指基因组中大于50bp的片段插入、缺失复制和复杂的重组的现象，是一种在基因组亚显微水平上的结构变异，可以通过剂量效应、位置效应、阻断功能基因、融合基因、暴露隐性等位基因和潜在的跃迁效应来影响基因的功能以及个体的表型。研究表明，有些cnv位点位于功能基因的内部，与畜禽的生长性状有相关关系，或与qtl位点重合，对经济性状的一定影响。

目前，cnv常用的检测方法主要分为两类：一类主要用于在全基因组范围内检测未知cnv，包括基因组芯片和高通量测序技术；另一类主要用于定点检测或验证已知cnv。其中芯片方法主要包括比较基因组杂交芯片(comparativegenomichybridization,cgh)和snp芯片，在比较基因组芯片中寡核苷酸探针芯片因其具有高精度、高灵敏度、样本需要量小等特点，被广泛使用。snp芯片在检测时不需要对照样本，通过被检测样本内snp信号强度来进行分析。其主要优点是能同时提供拷贝数和基因型信息，还可以显示杂合性缺失。但是snp芯片上的探针在基因组分布不均衡，很多复杂区域探针设计困难。因此，snp芯片在检测cnv时有一定的局限性。随着新一代测序技术的成熟，直接通过重测序来检测基因组结构变异已经成为当前最有效的检测手段。与杂交技术相比，利用测序技术来检测cnv具备很多优势：提高了cnv的分辨率；可以确定cnv的边界；可以检测出个体cnv的绝对拷贝数；对于结构变化复杂的cnv也有较高检测效力，但这种方法成本较高。

对于已确定的cnv的检测，通常是采用基于pcr技术和杂交技术的一些方法。例如qpcr、qmpsf、mlpa、fish、southernblotting和maph等。其中，实时荧光定量pcr(qpcr、qrt-pcr)最为常用。根据qrt-pcr所使用的荧光化学方法的不同，主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。pcr反应体系中加入过量的sybrgreen染料分子，能特异性地渗入dna双链并发射荧光信号，而游离的染料分子则仅有很低的荧光本底，几乎不发光，从而确保信号的增加与pcr产物的增加同步，可通过检测荧光信号的强度来反映基因组dna的数量。通过对目的基因(具有拷贝数变异)及参考基因(无拷贝数变异)进行相对定量，根据2^-δδct方法统计检测样本候选基因的拷贝数。染料法的优点是实验成本低、无需设计合成探针、使用方便，可以检测目的片段的绝对拷贝数，但不适用于大样本的高通量检测。

gbp2基因是gbp家族中的重要成员，其可结合包括鸟嘌呤核苷酸(gmp，gdp和gtp)的干扰素诱导的蛋白质。编码的蛋白质为gtp酶，将gtp水解为gdp，该蛋白质可以起到鳞状细胞癌的标志物的作用。目前揭示的gbps家族成员的功能主要与细胞增殖和病原体感染有关。关于gbp2基因的功能在人和小鼠上做了一些研究，发现其对细胞生长的调控以及抗病性上有重要影响，但在牛上的报道较少。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测秦川牛gbp2基因cnv标记的方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测秦川牛gbp2基因cnv标记的方法，包括以下步骤：

以秦川牛基因组dna为模板，以引物对gbp2-cnv1和引物对gbp2-cnv2以及引物对r1为引物，分别通过实时定量pcr扩增gbp2基因的拷贝数变异位点cnv1和cnv2以及作为内参的btf3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定秦川牛gbp2基因的拷贝数变异类型；

所述的引物对gbp2-cnv1为：

上游引物f1：5’-ctctcaggcggtatcacagtcaatg-3’

下游引物r1：5’-tccttggcatcattagactctgtat-3’；

所述的引物对gbp2-cnv2为：

上游引物f2：5’-atgggcagcctggactatc-3’

下游引物r2：5’-ggttctccttggacgggtg-3’；

所述的引物对r1为：

上游引物f2：5’-aaccaggagaaactcgccaa-3’

下游引物r2：5’-ttcggtgaaatgccctctcg-3’。

所述的gbp2基因的拷贝数变异位点cnv1位于gbp2基因参考基因组序列nc_007301.6的54593301位至54594300位，共999bp；拷贝数变异位点cnv2位于gbp2基因参考基因组序列nc_007301.6的54636901位至54638000位，共1099bp。

所述的拷贝数变异类型是根据log22^-δδct将定量结果分为的三类：插入型，log22^-δδct>0.5；缺失型，log22^-δδct<-0.5；正常型，log22^-δδct≤|±0.5|。

所述的实时定量pcr所用的扩增体系包括：10ng/μl模板dna1μl、10μmol/l的引物对gbp2-cnv1、引物对gbp2-cnv2或引物对r1所对应的上、下游引物各1μl以及2×sybrgreenqpcrmix6.25μl和ddh2o4.25μl。

所述的实时定量pcr所用的反应程序为：1)95℃预变性5min；2)95℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环。

基于引物对gbp2-cnv1扩增的pcr产物片段大小为147bp，基于引物对gbp2-cnv2扩增的pcr产物片段大小为134bp，基于引物对r1扩增的pcr产物片段大小为166bp。

上述检测秦川牛gbp2基因cnv标记的方法在秦川牛分子标记辅助选择育种中的应用。

所述拷贝数变异类型中，所述的拷贝数变异位点cnv1上具有缺失型拷贝数变异类型的秦川牛个体在生长性状上较优；拷贝数变异位点cnv2上具有缺失型拷贝数变异类型的秦川牛个体在生长性状上较优。

所述生长性状为十字部高、体长、胸宽、尻长、腰角宽、胸深、坐骨端宽、胸围或体重中的至少一种。

与现有技术相比，本发明有以下优点：

(1)本发明提供的秦川牛gbp2基因拷贝数变异检测方法，不受年龄的限制，可用于母牛的早期选育，甚至在刚出生时就可进行选择；

(2)检测牛gbp2基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便；

(3)牛gbp2基因拷贝数变异的检出，为牛生长发育的分子标记辅助选择提供科学依据。

附图说明

图1为gbp2基因cnv及内参基因btf3的pcr扩增产物电泳图；图1中：泳道1为引物gbp2-cnv1，泳道2为引物gbp2-cnv2，泳道3为引物r1，泳道5为marker1。

图2为本发明中进行qpcr绘制的扩增曲线；

图3是本发明中进行qpcr绘制的溶解曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。

本发明利用实时荧光定量pcr对秦川牛gbp2基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，通常包括以下步骤：

(1)利用ncbi数据库找到gbp2基因序列，再用primer5软件进行引物设计，并用普通pcr检测引物；

(2)采用实时荧光定量pcr(qpcr)技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况，筛选到与秦川牛生长性状相关的cnv标记；

(3)利用spss20.0软件将拷贝数变异类型与秦川牛生长性状等进行关联分析；

(4)根据拷贝数变异类型进行生长性状优异的秦川牛选育。

1、牛样本采集

本发明具体以66头秦川牛作为检测对象，其中66头秦川牛的血样样本采集自陕西省秦川牛良种繁育中心(陕西省宝鸡市扶风县段家镇)。

2、血样基因组dna的提取

①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μl血液于1.5ml离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(pbs)混匀，温和摇动，4℃，12000r/min离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈透明色。

②在离心管中加入dna抽提缓冲液500μl，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。

③加蛋白酶k至5μl(20mg/ml)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加10μl蛋白酶k混匀继续消化直至澄清。

④将反应液冷却至室温，加入500μltris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管，重复上述步骤1次。

⑤加入氯仿500ml，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5ml离心管。

⑥加入氯仿、异戊醇混合液(体积比24:1)500ml，充分混合20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5ml离心管中。

⑦加入0.1倍体积的naac缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出。

⑧4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗dna沉淀2次。

⑨4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

⑩干燥后的dna中加入80～100μl的te溶解，4℃保存直至dna完全溶解，利用紫外分光光度仪泳检测其质量，-80℃保存。

3、目标序列及参考序列的扩增

以ncbi数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛gbp2基因序列(genbankaccessionno.nc_007301.6)为参考序列，以牛gbp2基因候选区域chr3:54579273-54670347为候选位点，利用primer5.0设计实时荧光定量pcr引物对检测gbp2基因拷贝数变异，其引物对序列信息如表1所示(拷贝数变异位点cnv1位于gbp2基因参考基因组序列nc_007301.6的54593301位至54594300位，共999bp；拷贝数变异位点cnv2位于gbp2基因参考基因组序列nc_007301.6的54636901位至54638000位，共1099bp)。通过绘制扩增曲线(图2)和溶解峰来确定引物是否适用于qpcr分析。根据绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰(图3)。

表1.实时荧光定量pcr的引物信息

其中，进行实时荧光定量pcr所用的扩增体系以12.5μl计为：10ng/μl模板dna(提取自血样样本的基因组dna)1μl，10pmol/l的上、下游引物各0.5μl，2×sybrgreenqpcrmix6.25μl，ddh2o4.25μl。

pcr扩增：(1)预变性：95℃5min；(2)扩增反应：95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环；(3)绘制溶解曲线：95℃5s，-0.01℃/s，65℃1min。

参见图1，基于引物对gbp2-cnv1扩增的pcr产物片段大小为147bp，基于引物对gbp2-cnv2扩增的pcr产物片段大小为134bp，内参序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，即btf3基因中的一段166bp的序列。

4、拷贝数变异的推断

每个样品分别用目标序列和参考序列的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2^-δδct方法进行拷贝数的分析。其中δδct＝(ct目的基因-ct内参基因)实验组-(ct目的基因-ct内参基因)对照组。ct即cyclethreshold，为pcr扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。实验组即为待检测有无cnvs的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的样本。2^-δδct表示的是实验组目标序列的拷贝数相对与对照组的倍数。然后将基因的表达丰度进行对数转化(以2为底2^-δδct的对数)使之符合正态分布，进行方差齐性检验后，统计检验各组间的差异。

当目标序列为正常型(median)序列时，根据2^-δδct计算出归一化值为0左右(log22^-δδct≤|±0.5|)。当目标序列为缺失型(loss)序列时，log22^-δδct计算出归一化值log22^-δδct<-0.5。当目标序列为插入型(gain)序列时，log22^-δδct计算出归一化值log22^-δδct>0.5。

5、gbp2基因cnv1和cnv2位点与生长性状的关联分析

生产数据(生长性状)：体高(最终分析结果为无关联)、十字部高、体长、胸宽、尻长、腰角宽、胸深、坐骨端宽、胸围、体重。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用spss20软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

yijk＝μ+ai+cnvj+eijk

其中：yijk为性状观察值，μ为总体均值，ai为第i头个体的年龄，cnvj为第j个拷贝数变异类型的固定效应，eijk为随机误差。各组数据间的差异性采用lsd多重比较进行检验，试验结果以mean±se形式表示，参见表2和表3。

表2.秦川牛gbp2基因cnv1拷贝数变异与生长性状的关联性分析

表3.秦川牛gbp2基因cnv2拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：表2、3中，平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(p>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(p<0.05)。^*p<0.05。括号里面的数值表示拷贝数类型的频率。

关联分析结果表明(见表2、3)：cnv1上具有缺失型拷贝数变异类型的秦川牛个体在生长性状上较优。cnv2上具有缺失型拷贝数变异类型的秦川牛个体在生长性状上较优。说明gbp2基因两个cnv位点都可以作为一个提高秦川牛生长性状的候选分子遗传标记。

6、上述cnv标记在牛选育中的应用

获得的cnv可作为候选分子遗传标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响牛生长性状的数量性状基因座，以对秦川牛进行分子标记辅助选择，从而加快秦川牛品种改良的选育进程。

<110>西北农林科技大学

<120>一种检测秦川牛gbp2基因cnv标记的方法及其应用

<160>6

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

ctctcaggcggtatcacagtcaatg25

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

tccttggcatcattagactctgtat25

<210>3

<211>19

<212>dna

<400>3

atgggcagcctggactatc19

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

ggttctccttggacgggtg19

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>5

aaccaggagaaactcgccaa20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>6

ttcggtgaaatgccctctcg20