微量样本中人类基因组DNASRY基因的TaqMan探针实时荧光PCR检测的引物的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及微量样本中人类基因组dnasry基因的taqman探针实时荧光pcr检测的引物，还涉及包括上述引物的试剂盒。
背景技术：
：sry基因是位于y染色体yp11.3睾丸决定因子的最佳候选基因，在胚胎发育早期决定性别的分化和睾丸的形成，是性别分化关键基因。在性别发育异常的遗传病中，主要临床特征是染色体核型性别与性腺性别相反，表现为生殖器发育异常、身体表型与性别存在差异、体内激素水平异常和生理活动异常等症状，造成这种结果可能的原因包括sry基因在胚胎发育期发生染色体的易位、插入或缺失。在性发育异常的患者中检测sry基因，可以为其提供诊断和治疗的依据。目前已有一些sry基因检测的技术，但他们的检测灵敏度有限，特别对于微量样本检测，检测灵敏度过高易产生假阳性结果，而检测灵敏度过低易产生假阴性结果。在法医鉴定、母体胎儿检测中，这类样本多为微量样本，检测结果的准确性要求十分严格，因此开发出灵敏、准确的检测方法十分重要。taqman探针实时荧光pcr法是分子诊断领域应用的一种技术，该方法灵敏度高、可实时检测，是适合临床大规模使用的方法。该技术原理是当taqman探针水解后会释放一定的荧光基团，实时荧光pcr仪可以通过荧光基团释放的波长捕捉到荧光信号强度，然后记录下来，最后将每个循环荧光信号强度变化的趋势表现出来，根据荧光强度变化趋势判断是否产生扩增产物。然而，将taqman探针实时荧光pcr法应用于sry基因检测目前仍未见报道。技术实现要素：技术问题：为了解决现有技术的问题，本发明提供了微量样本中人类基因组dnasry基因的taqman探针实时荧光pcr检测的引物，以及包括该引物的试剂盒，该引物在检测微量样本如血斑、头发、母体游离血浆dna等中能够大大提高sry基因检出率和准确度，同时为在医疗诊断等领域提供有效的检测方法。技术方案：本发明提供的微量样本中人类基因组dnasry基因的taqman探针实时荧光pcr检测的引物，其特征在于：包括sry基因保守区域引物对、sry基因探针、内标基因保守区域引物对和内标基因探针；其中，sry基因保守区域引物对包括sry基因正向引物和sry基因反向引物：sry基因正向引物的序列为：5’ttgtcgcactctccttgttt3’，sry基因反向引物的序列为：5’gagagcgggaatattctcttg3’；sry基因探针的序列为：fam-caacagcgatgattacagtccagctg-tamra；内标基因保守区域引物对包括内标基因正向引物和内标基因反向引物：内标基因正向引物的序列为：5’agctcactggcatggccttc3’，内标基因反向引物的序列为：5’cgcctgcttcaccaccttct3’；内标基因探针的序列为：fam-cggcaggtcaggtccaccactgacacg-tamra。本发明还提供了微量样本中人类基因组dnasry基因的taqman探针实时荧光pcr检测的试剂盒，包括权利要求1所述的微量样本中人类基因组dnasry基因的taqman探针实时荧光pcr检测的引物。作为优选，所述sry基因保守区域引物对和sry基因探针的终浓度分别为2-4μm，所述内标基因保守区域引物对和内标基因探针的终浓度分别为1-3μm。本发明还提供了微量样本中人类基因组dnasry基因的taqman探针实时荧光pcr检测方法，利用上述试剂盒，其中，反应体系为：当检测阳性质控品工作液时，实时荧光pcr反应体系为：12.5μl的pcr扩增酶反应混合液，1.5μlsry基因及内标基因保守区域taqman探针引物对混合液，1μl阳性质控品工作液，10μl无菌双蒸水，反应总体系为25μl；当检测人类基因组dna时，实时荧光pcr反应体系为：12.5μl的pcr扩增酶反应混合液，1.5μlsry基因及内标基因保守区域taqman探针引物对混合液，11μl待测基因组dna，反应总体系为25μl；其中，sry基因及内标基因保守区域taqman探针引物对混合液为sry基因保守区域引物对、sry基因探针、内标基因保守区域引物对和内标基因探针的混合液；反应程序为：每个放入待测样本的反应孔设置的检测荧光信号为fam和joe；反应温度时间为：(1)95℃预变性5min，循环数为1；(2)95℃变性15s，60℃退火延伸45s，循环数为50；总的扩增时间为90min；反应程序(2)中每个循环在60℃退火延伸时接收荧光信号；结果判定：阳性质控品工作液中sry基因检测结果的ct值和内标基因检测结果的ct值均为0-50；阴性质控品中sry基因检测结果的ct值和内标基因检测结果的ct值均为0；阳性结果的判定标准为：实验结果判定sry基因检测ct内参基因检测ct阳性结果<50<50阴性结果0<50样品问题00可疑，需重复<500有益效果：本发明提供的微量样本中人类基因组dnasry基因的taqman探针实时荧光pcr检测的引物及试剂盒制备工艺简单、成本低廉、特异性强，灵敏度高，能够大大提高微量样本如血斑、头发、母体游离血浆dna等中sry基因检出率和准确度，为医疗诊断等领域提供了一种有效的检测方法。本发明使用的探针为taqman探针，使用实时定量pcr的方法可以准确检测出sry基因的存在，同时试剂盒中加入内标基因保守区域探针和引物可以有效监控实验反应中反应条件对反应结果的影响。本发明中的实时荧光pcr反应体系中检测样本11μl的加入量和实时荧光pcr反应程序中循环数为50，可以有效提高微量样本的sry基因检出率。本发明方法配合试剂盒中特异性的引物和探针，保证检测结果的特异性强，灵敏度高。附图说明图1为sry基因阳性质控品灵敏度实时荧光pcr检测结果图。其中1为4号阳性质控品工作液检测结果的扩增曲线，2为3号阳性质控品工作液检测结果的扩增曲线，3为2号阳性质控品工作液检测结果的扩增曲线，4为1号阳性质控品工作液检测结果的扩增曲线。图2为sry基因检测特异性实时荧光pcr检测结果图。其中1为阳性样本的sry基因检测结果的扩增曲线，2为阳性样本的内标基因检测结果的扩增曲线，3为阴性样本的内标基因检测结果的扩增曲线。图3为sry基因检测敏感性实时荧光pcr检测结果图。1为未稀释孕妇怀孕为男性游离血浆基因组dna中的sry基因检测结果的扩增曲线，2为未稀释孕妇怀孕为男性血浆游离基因组dna中的gadph基因检测结果的扩增曲线，3为稀释5倍孕妇怀孕为男性血浆游离基因组dna中的sry基因检测结果的扩增曲线，4为稀释5倍孕妇怀孕为男性血浆游离基因组dna中的gadph基因检测结果的扩增曲线。稀释与未稀释孕妇怀孕为男性血浆游离基因组dna是从同一个人中得到。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。以下实施中所使用的溶解基因组dna或质粒dna的溶液都是te(tris-edta)缓冲液(ph8.0，购自qiagen公司)。pcr扩增酶反应混合液购自neb公司。实施例1用于微量样本人类基因组dna的sry基因taqman探针实时荧光pcr检测试剂盒的引物和探针的制备sry基因全长887bp，无内含子，编码204个氨基酸的蛋白质。根据ncbi数据库公布的sry基因(基因序列号：nm_003140，更新于2016.10.7)序列，设计特异性引物和探针，见表1。设计sry基因检测的引物探针时，选取sry基因保守区域，同时避开sry基因上多态性位点区域，保证引物探针的特异性。表1用于检测sry基因的特异性引物探针组合其中sryf是正向引物，sryr是反向引物，扩增sry基因区域。sryp为5’端标记fam信号和3’端标记tamra信号的检测探针，能与扩增片段结合。gadph作为内标基因，它是人体内的管家基因，具有高度保守性的特点。根据ncbi数据库公布的gadph基因(基因序列号：nm_001289746，更新于2016.10.7)序列，设计特异性引物探针，见表2。表2用于检测内标基因的特异性引物探针组合其中gadphf是正向引物，gadphr是反向引物，扩增内标gadph基因区域。gadphp为5’端标记joe信号和3’端标记tamra信号的检测探针，能与扩增片段结合。以基因工程技术构建sry基因质粒为模板，作为阳性质控品，质粒合成由苏州金维智公司完成。阳性质控品可以监控实验过程中反应条件或反应试剂对实验结果产生的影响，保证实验过程的准确性。将表1和表2中的sry基因引物探针和内标基因的引物探针混合到一起，成为sry基因及内标基因保守区域taqman探针引物对混合液。混合液中sry基因引物探针终浓度为3μm，内标基因的引物探针终浓度为2μm。实施例2微量样本人类基因组dna的sry基因taqman探针实时荧光pcr检测试剂盒检测前的样本准备(1)获取待测样本基因组dna(以人类外周血血浆游离基因组dna为例)使用天隆公司的核酸提取试剂盒(磁珠法)(ex-dna血清/血浆游离)提取怀孕女性外周血血浆游离基因组dna，用于检测母体内胎儿的sry基因。提取按照说明书中的操作步骤完成。将抽提好的dna样本，用紫外分光光度计检测浓度和dna质量，dna的浓度要求为>5ng/μl，dna的质量od260/280在1.8～2.0之间。定量后，母液-20℃保存。(2)溶解并稀释阳性质控品在苏州金维智公司合成的sry基因阳性质控品质粒为粉末状，总量为2μg，12000转/分钟离心1分钟，用100μl的te缓冲液进行溶解，溶解后的浓度为20ng/μl，制作成阳性质控品原液。计算溶解后阳性质控品质粒的拷贝数，公式如下：质粒拷贝数/μl＝(6.02×1023拷贝数/mol×20ng/μl×10-9)/(dna长度×660)然后根据阳性质控品原液总拷贝数将质粒稀释到3拷贝数/μl、30拷贝数/μl、300拷贝数/μl和3000拷贝数/μl，作为一组阳性质控品工作液。其中1号阳性质控品工作液浓度为3拷贝数/μl，2号阳性质控品工作液浓度为30拷贝数/μl，3号阳性质控品工作液浓度为300拷贝数/μl，4号阳性质控品工作液浓度为3000拷贝数/μl。优选30拷贝数/μl的阳性质控品工作液，该阳性质控品工作液可以在-20℃保存6-12个月，反复冻融次数<5次。推荐用te缓冲液稀释质粒dna。(3)阴性质控品为：无菌双蒸水。实施例3微量样本人类基因组dna的sry基因taqman探针实时荧光pcr检测试剂盒的检验方法(1)微量样本人类基因组dna的sry基因taqman探针实时荧光pcr检测试剂盒的灵敏度实验试剂组成：pcr扩增酶反应混合液；实施例1的sry基因及内标基因保守区域taqman探针引物对混合液；实施例2的阳性质控品工作液组、阴性质控品。其中阳性质控品工作液组作为本次检测的目标样本。反应体系：每个反应中加入12.5μl的pcr扩增酶反应混合液，1.5μl实施例1的sry基因及内标基因保守区域taqman探针引物对混合液，1μl阳性质控品工作液，10μl无菌双蒸水，反应总体系为25μl。分别检测1号阳性质控品工作液、2号阳性质控品工作液、3号阳性质控品工作液和4号阳性质控品工作液。反应程序：使用实时荧光pcr仪，将加好的待测样本混合液管放入仪器相应位置。设置实时荧光pcr反应程序，每个放入待测样本的反应孔设置的检测荧光信号为fam和joe，反应温度时间为：(1)95℃预变性5min，循环数为1；(2)95℃变性15s，60℃退火延伸45s，循环数为50。总的扩增时间为90min。反应程序(2)中每个循环在60℃退火延伸时接收荧光信号。检测结果分析：检测结果见图1，结果显示1号阳性质控品工作液检测的ct值为30.03，2号阳性质控品工作液检测的ct值为26.29，3号阳性质控品工作液检测的ct值为22.99，4号阳性质控品工作液检测的ct值为19.35，这一组4个阳性质控品工作液均生产了扩增曲线，其中拷贝数最低的1号阳性质控品工作液检测的ct值为30.03。上述结果表明：实施例1中设计的sry基因taqman探针引物对、反应体系和反应条件在实时荧光pcr检测中具有很高的灵敏度。(2)微量样本人类基因组dna的sry基因taqman探针实时荧光pcr检测试剂盒特异性实验试剂和样本组成：pcr扩增酶反应混合液；实施例1中sry基因及内标基因保守区域taqman探针引物对混合液；实施例2中阳性质控品工作液组、阴性质控品；按照实施例2方法提取的怀孕女性外周血血浆游离基因组dna，其中已知一名怀孕女性胎儿为男性，另一名怀孕女性胎儿为女性，将这两个提取的dna作为检测样本，1号样本为怀孕女性胎儿为男性，提取后用紫外分光光度计检测浓度为8.47ng/μl，2号样本为怀孕女性胎儿为女性，提取后用紫外分光光度计检测浓度为18.33ng/μl。反应体系：每个反应中加入12.5μl的pcr扩增酶反应混合液，1.5μl实施1中探针引物混合液，11μl的检测样本，反应总体系为25μl。分别检测1号样本和2号样本。反应程序：使用实时荧光pcr仪，将加好的待测样本混合液管放入仪器相应位置。设置实时荧光pcr反应程序，每个放入待测样本的反应孔设置的检测荧光信号为fam和joe，反应温度时间为：(1)95℃预变性5min，循环数为1；(2)95℃变性15s，60℃退火延伸45s，循环数为50。总的扩增时间为90min。反应程序(2)中每个循环在60℃退火延伸时接收荧光信号。检测结果分析：检测结果见图2，结果显示1号样本的sry基因检测的ct值为34.44，1号样本的内标基因检测的ct值为24.75；2号样本的内标基因检测的ct值为22.02，2号样本未检测到sry基因的荧光信号。上述结果表明：实施例1中设计的sry基因taqman探针引物对、反应体系和反应条件在实时荧光pcr检测人体样本时具有特异性。(3)微量样本人类基因组dna的sry基因taqman探针实时荧光pcr检测试剂盒敏感性实验试剂和样本组成：pcr扩增酶反应混合液；实施例1的sry基因及内标基因保守区域taqman探针引物对混合液；实施例2的阳性质控品工作液组、阴性质控品；按照实施2中方法提取的怀孕女性外周血血浆游离基因组dna，已知一名怀孕女性胎儿为男性，将该样本提取的dna作为检测样本，1号样本为该样本提取后的原液基因组dna，用紫外分光光度计检测浓度为19.63ng/μl，2号样本为1号样本稀释5倍后的基因组dna。反应体系：每个反应中加入12.5μl的pcr扩增酶反应混合液，1.5μl实施1中探针引物混合液，11μl的检测样本，反应总体系为25μl。分别检测1号样本和2号样本。反应程序：使用实时荧光pcr仪，将加好的待测样本混合液管放入仪器相应位置。设置实时荧光pcr反应程序，每个放入待测样本的反应孔设置的检测荧光信号为fam和joe，反应温度时间为：(1)95℃预变性5min，循环数为1；(2)95℃变性15s，60℃退火延伸45s，循环数为50。总的扩增时间为90min。反应程序(2)中每个循环在60℃退火延伸时接收荧光信号。检测结果分析：检测结果见图3，结果显示1号样本的sry基因检测的ct值为30.45，1号样本的内标基因检测的ct值为22.02；2号样本的sry基因检测的ct值为35.48，2号样本的内标基因检测的ct值为27.48。上述结果表明：实施例1中设计的sry基因taqman探针引物对、反应体系和反应条件在实时荧光pcr检测人体样本时具有敏感性。实施例4将表1和表2中的sry基因引物探针和内标基因的引物探针混合到一起，成为sry基因及内标基因保守区域taqman探针引物对混合液。混合液中sry基因引物探针终浓度为4μm，内标基因的引物探针终浓度为3μm。试剂组成：pcr扩增酶反应混合液；本实施例的sry基因及内标基因保守区域taqman探针引物对混合液；实施例2的阳性质控品工作液组、阴性质控品。其中阳性质控品工作液组作为本次检测的目标样本。反应体系：每个反应中加入12.5μl的pcr扩增酶反应混合液，1.5μl实施例1的sry基因及内标基因保守区域taqman探针引物对混合液，1μl2号阳性质控品工作液，10μl无菌双蒸水，反应总体系为25μl。反应程序：使用实时荧光pcr仪，将加好的待测样本混合液管放入仪器相应位置。设置实时荧光pcr反应程序，每个放入待测样本的反应孔设置的检测荧光信号为fam和joe，反应温度时间为：(1)95℃预变性5min，循环数为1；(2)95℃变性15s，60℃退火延伸45s，循环数为50。总的扩增时间为90min。反应程序(2)中每个循环在60℃退火延伸时接收荧光信号。检测结果分析：2号阳性质控品工作液检测的ct值为26.55。实施例5将表1和表2中的sry基因引物探针和内标基因的引物探针混合到一起，成为sry基因及内标基因保守区域taqman探针引物对混合液。混合液中sry基因引物探针终浓度为2μm，内标基因的引物探针终浓度为1μm。试剂组成：pcr扩增酶反应混合液；本实施例的sry基因及内标基因保守区域taqman探针引物对混合液；实施例2的2号阳性质控品工作液组、阴性质控品。其中阳性质控品工作液组作为本次检测的目标样本。反应体系：每个反应中加入12.5μl的pcr扩增酶反应混合液，1.5μl实施例1的sry基因及内标基因保守区域taqman探针引物对混合液，1μl2号阳性质控品工作液，10μl无菌双蒸水，反应总体系为25μl。反应程序：使用实时荧光pcr仪，将加好的待测样本混合液管放入仪器相应位置。设置实时荧光pcr反应程序，每个放入待测样本的反应孔设置的检测荧光信号为fam和joe，反应温度时间为：(1)95℃预变性5min，循环数为1；(2)95℃变性15s，60℃退火延伸45s，循环数为50。总的扩增时间为90min。反应程序(2)中每个循环在60℃退火延伸时接收荧光信号。检测结果分析：2号阳性质控品工作液检测的ct值为26.16。sequencelisting<110>谱天福信（天津）分子诊断技术有限公司<120>用于微量样本中人类基因组dnasry基因的taqman探针实时荧光pcr检测的引物及应用<130>sc20170224001<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>sry基因正向引物<220><221>misc_feature<222>(1)..(20)<400>1ttgtcgcactctccttgttt20<210>2<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>sry基因反向引物<220><221>misc_feature<222>(1)..(21)<400>2gagagcgggaatattctcttg21<210>3<211>26<212>dna<213>artificial<220><223>sry基因探针<220><221>misc_feature<222>(1)..(26)<400>3caacagcgatgattacagtccagctg26<210>4<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>内标基因正向引物<220><221>misc_feature<222>(1)..(20)<400>4agctcactggcatggccttc20<210>5<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>内标基因反向引物<220><221>misc_feature<222>(1)..(20)<400>5cgcctgcttcaccaccttct20<210>6<211>27<212>dna<213>artificial<220><223>内标基因探针<220><221>misc_feature<222>(1)..(27)<400>6cggcaggtcaggtccaccactgacacg27当前第1页12