三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理及样本检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及代谢组学的技术领域，具体说是一种Ξ抱布拉氏霉菌代谢组的样品前 处理及样本检测方法。
【背景技术】
[0002] 随着人类基因组测序工作完成，基因功能的研究成为热点，各种"组学"相继出现， 代谢组学继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后应运而生。代谢物组学的研究对象是生 物体内整体代谢物的变化，为了更加全面、系统地了解运种变化，代谢物分析方法应依据代 谢物物理化学参数的差异，采用不同的分析方法，力求满足高选择性、高灵敏度、高通量、多 维、动态、多参量的特点。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种Ξ抱布拉氏霉菌代谢组的样品前处理及样 本检测方法。
[0004] 本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是： 本发明的Ξ抱布拉氏霉菌代谢组的样品前处理方法，包括W下步骤： (1) 培养Ξ抱布拉氏霉菌： 曰、种子培养:将Ξ抱布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL^角瓶中，培养基装液量 lOOmL，培养溫度为27 °C，摇床转速220巧m，培养时间为48-5化； 种子培养基按质量百分比组包括：玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉2.3%、KH2P04 0.15%、 MgS04'7肥0 0.01%、工业玉米浆1%、豆油0.5%，其余为水； b、发酵培养:将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β-胡萝h素；向 发酵过程中流加混菌发酵液； 发酵培养基中按质量百分比包括:玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.0%、Κ也P〇4 0.25%、MgS〇4 · 7出0 0.02%、豆油3.0%、工业玉米浆2.0%、维生素 B1 0.005%、巧樣酸Ξ钢0.3%、曲拉通 0.1%、ΒΗΤ 0.05%、混菌发酵液10%，其余为水； (2) 样品制备： 分别取12h、48h、72h的样品进行代谢样品制备； A:利用不同提取液对相同样品进行提取，提取剂为:-40°C预冷的60% v/v乙醇水、2: 2:lv/v的氯仿：乙醇：水、60% v/v沸乙醇、60% v/v冷甲醇； B:样品衍生化 .友取200化提取液加10化的1 mg/mL 丫-氨基下酸，真空冷冻干燥后，加50化浓度 为20 mg/mL的甲氧基锭盐酸盐/化晚溶液，充分溶解样品，置于40°C水浴中，反应80 min; 雪加80化N-甲基-Ν-(Ξ甲基硅烷)Ξ氣乙酷胺，混合均匀，置于40° C水浴中，反应80 mi打； 霉将衍生后的样品10 000 r/min离必5 min;取上清液100化加入进样瓶中，并编号， 于室溫放置2 h。
[0005] 本发明的Ξ抱布拉氏霉菌代谢组样品的检测方法，对样品进行GC-MS检测； GC条件:Agi len地P530m X 0.25mm X 0.25皿毛细管柱;进样口溫度:280° C;升溫程序:初 始溫度70° C保持2 min，W5° C/min程序升溫至290° C保持5 min;载气:高纯氮气，恒压模式 91 kPa;进样量1 柱后分流比10:1; MS条件:接口溫度:280 C;电罔方式:EI;电罔方式：电子轰击电罔（EI+);罔子源溫度： 250°。电子轰击能量:70 eV;电子电流:40 μΑ;扫描质量范围：50-800 m/z。
[0006] 本发明具有的优点和积极效果是： 本发明的Ξ抱布拉氏霉菌代谢组的样品前处理及样本检测方法中，利用PDA培养基培 养Ξ抱布拉氏霉菌，培养4d后收集菌丝，液氮灭活后超低溫冰箱保存备用;冷冻研磨破碎菌 丝样品，代谢组提取采用冷冻过的甲醇水混合物W使酶失活;真空冷冻干燥后，经过朽化或 腺化、硅烷化两步衍生化反应后用于GC-MS检测。本发明还提供了利用GC-MS对上述样品 的检测方法，检测条件如下：选用Agi len地P530m X 0.25mm X 0.25WI1毛细管柱;进样量化L ;程序升溫；离子源溫度250°C，全扫描范围m/z50~800。采用本发明能得到重现性较好 的代谢组检测结果。
【附图说明】
[0007] 图1是采用-40°C预冷的60%v/v乙醇水作为提取剂时的GC-MS TIC总离子流图； 图2是采用2:2: Iv/v的氯仿：乙醇:水溶液作为提取剂时的GC-MS TIC总离子流图； 图3是采用60% v/v沸乙醇作为提取剂时的GC-MS TIC总离子流图； 图4是采用60% v/v冷甲醇作为提取剂时的GC-MS TIC总离子流图。
【具体实施方式】
[0008] W下通过附图和具体实施例对本发明中的技术方案进行详细说明： 实施例1: 本发明的Ξ抱布拉氏霉菌代谢组的样品前处理方法，包括W下步骤： (1) 培养Ξ抱布拉氏霉菌： 曰、种子培养:将Ξ抱布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL^角瓶中，培养基装液量 lOOmL，培养溫度为27 °C，摇床转速220巧m，培养时间为4她； 种子培养基按质量百分比组包括：玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉2.3%、KH2P04 0.15%、 MgS04'7肥0 0.01%、工业玉米浆1%、豆油0.5%，其余为水； b、发酵培养:将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β-胡萝h素；向 发酵过程中流加混菌发酵液； 发酵培养基中按质量百分比包括:玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.0%、Κ此Κ)4 0.25%、MgS化· 7出0 0.02%、豆油3.0%、工业玉米浆2.0%、维生素 B1 0.005%、巧樣酸Ξ钢0.3%、曲拉通 0.1%、BHT 0.05%、混菌发酵液10%，其余为水； (2) 样品制备： 分别取12h、48h、72h的样品进行代谢样品制备； A:利用不同提取液对相同样品进行提取，提取剂为:-40°C预冷的60% v/v乙醇水； B:样品衍生化 是取200化提取液加10化的1 mg/mL 丫-氨基下酸，真空冷冻干燥后，加50化浓度 为20 mg/mL的甲氧基锭盐酸盐/化晚溶液，充分溶解样品，置于40°C水浴中，反应80 min; 惡加80化N-甲基-Ν-(Ξ甲基硅烷)Ξ氣乙酷胺，混合均匀，置于40° C水浴中，反应80 mi打； ;霉;将衍生后的样品10 000 r/min离必5 min;取上清液100化加入进样瓶中，并编号， 于室溫放置2 h。
[0009]本发明的Ξ抱布拉氏霉菌代谢组样品的检测方法，对样品进行GC-MS检测； GC条件:Agi len地P530m X 0.25mm X 0.25皿毛细管柱;进样口溫度:280° C;升溫程序:初 始溫度70° C保持2 min，C/min程序升溫至290° C保持5 min;载气:高纯氮气，恒压模式 91 kPa;进样量1 柱后分流比10:1; MS条件:接口溫度:280° C;电离方式:EI;电离方式：电子轰击电离(EI+);离子源溫度： 250°。电子轰击能量:70 eV;电子电流:40 μΑ;扫描质量范围：50-800 m/z。
[0010] 所得GC-MS TIC总离子流图如图1所示。
[0011] 实施例2: 本发明的Ξ抱布拉氏霉菌代谢组的样品前处理方法，包括W下步骤： (1) 培养Ξ抱布拉氏霉菌： 曰、种子培养:将Ξ抱布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL^角瓶中，培养基装液量 lOOmL，培养溫度为27 °C，摇床转速22化pm，培养时间为52h; 种子培养基按质量百分比组包括：玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉2.3%、KH2P04 0.15%、 MgS04'7肥0 0.01%、工业玉米浆1%、豆油0.5%，其余为水； b、发酵培养:将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β-胡萝h素；向 发酵过程中流加混菌发酵液； 发酵培养基中按质量百分比包括:玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.0%、Κ此Κ)4 0.25%、MgS化· 7出0 0.02%、豆油3.0%、工业玉米浆2.0%、维生素 B1 0.005%、巧樣酸Ξ钢0.3%、曲拉通 0.1%、BHT 0.05%、混菌发酵液10%，其余为水； (2) 样品制备： 分别取12h、48h、72h的样品进行代谢样品制备； A:利用不同提取液对相同样品进行提取，提取剂为:2:2:1 v/v的氯仿：乙醇:水； B:样品衍生化 憑取200化提取液加10化的1 mg/mL 丫-氨基下酸，真空冷冻干燥后，加50化浓度 为20 mg/mL的甲氧基锭盐酸盐/化晚溶液，充分溶解样品，置于40°C水浴中，反应80 min; 惡加80化N-甲基-Ν-(Ξ甲基硅烷)Ξ氣乙酷胺，混合均匀，置于40° C水浴中，反应80 min； 2将衍生后的样品10 000 r/min离屯、5 min;取上清液100化加入进样瓶中，并编号， 于室溫放置2 h。
[0012] 本发明的Ξ抱布拉氏霉菌代谢组样品的检测方法，对样品进行GC-MS检测； GC条件:Agi len地P530m X 0.25mm X 0.25皿毛细管柱;进样口溫度:280° C;升溫程序:初 始溫度70° C保持2 min，W5° C/min程序升溫至290° C保持5 min;载气:高纯氮气，恒压模式 91 kPa;进样量1 柱后分流比10:1; MS条件:接口溫度:280 C;电罔方式:EI;电罔方式：电子轰击电罔（EI+);罔子源溫度： 250°。电子轰击能量:70 eV;电子电流:40 μΑ;扫描质量范围：50-800 m/z。
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