一种利用阻断巴氏盐藻代谢通路生产番茄红素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用阻断巴氏盐藻代谢通路生产番茄红素的方法，包括如下步骤：(1)配制杜氏藻基本培养液，向培养液中加入A5微量元素溶液，调节pH，灭菌、冷却至室温；(2)将杜氏藻细胞加入培养液中，置于光照培养箱中培养，待OD600达到0.7的时候加入阻断剂三乙胺200-800ppm，继续培养24～72小时，然后提取色素，得到番茄红素。本发明相对传统从番茄表皮提取番茄红素的方法，提取方法更加简单、方便快捷，提取周期短。相对于利用三孢布拉氏霉等自养微生物，更利于大规模养殖，养殖所需环境要求简单，符合工业化大规模生产的标准。
【专利说明】一种利用阻断巴氏盐藻代谢通路生产番茄红素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品科学【技术领域】。具体涉及利用一种阻断剂阻断杜氏盐藻的代谢通 路来生产番茄红素的方法。
【背景技术】
[0002] 杜氏盐藻（Dunaliella salina)是一种嗜盐的绿色微藻，是一种嗜盐的单细胞真 核藻类，是迄今为止发现的最耐盐的真核生物之一。它属于高盐逆境生物，适应性很强，繁 殖快，其自然生活环境多为盐池、盐湖等地方，特殊的环境造就了独特的生长机制。杜氏盐 藻属于光合自养生物，含有丰富的油脂、胡萝卜素。蛋白质、多糖等，同时含有较高的Ca、P、 Zn等矿物质，还含有包括人类必须氨基酸在内的18中氨基酸，累积的甘油为干重的40%? 50%。在适当条件下，体内合成的β -胡萝卜素可达细胞干重的14%以上，远远高于其他 动物和植物体内的含量，是β -胡萝卜素极好的天然产源，具有很大的开发应用价值。β -胡萝卜素可以作为维生素 Α的前提，能使皮肤和黏膜细胞正常化并可以维持视网膜正常的 功能。
[0003] 番茄红素是一种类胡萝卜素，作为植物所含的一种天然色素，主要存在于茄科植 物西红柿的成熟果实中。研究证明番茄红素具有提高人体免疫力、抗癌、抗氧化、降血脂、 保护皮肤等功效。随着人们越来注重绿色、健康，番茄红素不断受到人们的广泛关注。但 是作为功能性天然色素的番茄红素，人类自身不能合成，需要通过膳食等方式补充。据美国 CPM (客户管理关系）国际公司预测，番茄红素产品销售将年增35 %，预计两三年内到达200 亿美元的销售量，世界跨国医药巨头和国内的医药巨头们纷纷进军番茄红素产业。
[0004] 当前番茄红素的生产方法主要有天然提取、化学合成、微生物发酵等。目前，已证 实天然番茄红素比化学合成的番茄红素更易吸收。而且，化学合成化学物残留的存在，因 此，近年来已转向天然产品的开发。目前两种主流生产番茄红素的方法，一是番茄表皮中提 取，二是利用三孢布拉氏霉生产。然而从番茄表皮中提取，提取效率低，提取工艺繁琐，需要 耗费大量的番茄，非常浪费；三孢布拉氏霉属于异养霉菌类微生物，养殖所需碳源、氮源以 及生长环境要求高，难以工业化大规模生产，且生产成本较高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的利用一种阻断剂，阻断杜氏盐藻的代谢通路中由番茄红素向β -胡 萝卜素的环化反应，实现了利用杜氏盐藻生产番茄红素的突破。
[0006] 本发明的技术方案概述如下：
[0007] -种利用阻断巴氏盐藻代谢通路生产番茄红素的方法，包括如下步骤：
[0008] (1)配制杜氏藻基本培养液，向培养液中加入Α5微量元素溶液，调节pH，灭菌、冷 却至室温；
[0009] (2)将杜氏藻细胞加入培养液中，置于光照培养箱中培养，培养过程中用分光光度 计测定藻液的光密度（0D值），待0D600达到0. 7的时候加入阻断剂三乙胺200-800ppm，继 续培养24?96小时，然后提取色素，得到番茄红素。
[0010] 所述杜氏藻基本培养液，其成分为：NaN030 . 420g/L，NaC187. 69g/L， NaH2P04 · 2H200. 156g/L, NaHC030. 840g/L, KC10. 074g/L, MgS04 · 7H201. 230g/L, CaCl2 · 2H200. 044g/L，0· 1 % EDTA 铁 0· 5ml/L，调 pH 至 7. 5。
[0011] 所述的 A5 微量元素溶液，其成分如下：H3B03286, MnCl2 · 4H20181，ZnS04 · 7H2022， CuS04 · 5Η207· 9,（NH4)6Mo7024 · 4Η203· 9,单位均为 mg/100ml，加入的量为 lml/L。
[0012] 所述的灭菌条件：压力102. 9kPa，温度121°C，时间20min。
[0013] 所述的培养箱的培养条件为：在光照度为6000Lx，光暗周期为14h:10h，温度为 26°C，以转速50r/min的转速震荡培养。
[0014] 所述的阻断剂三乙胺的加入量为500ppm。
[0015] 所述的提取色素的方法为：取l〇ml藻液在lOOOOrpm转速下离心lmin，弃上清液， 向藻泥中加入2ml丙酮，润旋分散，8000rpm转速下离心lmin，取上清转移到新的离心管中， 加入0· 2ml60% K0H，去除叶绿素，过0· 45um的滤膜。
[0016] 加入阻断剂后继续培养48?72小时。
[0017] 本发明的藻种来源：
[0018] 所涉及的巴氏杜氏藻（Dunaliella bardawil FACHB-847)购于中国科学院典型培 养物保藏委员会淡水藻种库（湖北武汉），并采用液体培养基弱光保存。
[0019] HPLC测定本发明中藻液番茄红素的含量，表明加入阻断剂前后番茄红素是一个从 无到有的变化，另外在阻断剂加入后的一段时间内，番茄红素的含量不断积累并在48h? 72h时达到最大值，其中加入三乙胺的量在500ppm时，番茄红素产量最高。
[0020] 本专利的发明效果在于：加入三乙胺后能够有效抑制环化酶的活性，阻断巴氏杜 氏藻代谢通路中番茄红素向β -胡萝卜素的进一步转化，将仅仅作为巴氏杜氏藻代谢通路 中的中间产物的番茄红素作为终产物出现在培养基中，是一种新的生产番茄红素的方法。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0022] (1)本发明相对传统从番茄表皮提取番茄红素的方法，提取方法更加简单、方便快 捷，提取周期短，产量也相对较高。
[0023] (2)巴氏杜氏藻属于真核自养微生物，在养殖过程中，无需碳源、氮源等有机物，相 对于目前两种主流生产番茄红素的方法成本更低。
[0024] (3)本发明中利用的巴氏杜氏藻相比于三孢布拉氏霉，更利于大规模养殖，养殖所 需环境要求简单，符合工业化大规模生产的标准。
[0025] (4)本发明在高盐、强光、缺氮等极端环境的胁迫下，番茄红素会有更高的产率，获 得更高的收益。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为杜氏盐藻中番茄红素的代谢途径，抑制代谢路径中的番茄红素环化酶，将 终产物停留在番茄红素；图中的英文缩写示意：MEP:2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸；PDS: 八氢番茄红素脱氢酶；ZIS0: ζ -胡萝卜素异构酶；ZDS: ζ -胡萝卜素脱氢酶；CRTIS0:类胡 萝卜素异构酶。
[0027] 图2为加入500ppm三乙胺阻断12小时后的液相图谱，没有番茄红素峰。
[0028] 图3为加入500ppm三乙胺阻断24小时后的液相图谱，峰8为番茄红素峰。图2 和图3的比对说明，确实是三乙胺起到的阻断效果，产生的番茄红素。
[0029] 图4为加入500ppm三乙胺阻断48小时后的液相图谱，峰9为番茄红素峰。
[0030] 图5为加入500ppm三乙胺阻断72小时后的液相图谱，峰15为番茄红素峰。
[0031] 图6为图4中峰9的波段扫描图。
[0032] 图7为番茄红素标准品全波段扫描图。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1
[0034] (1)杜氏藻培养液配制
[0035] 配制盐藻培养液：NaN030 . 42〇g/L，NaCl87· 69g/L，NaH2P04 · 2Η200· l56g/L， NaHC030 . 840g/L，KC10. 074g/L，MgS04 · THAI. 230g/L，CaCl2 · 2Η200· 044g/L，0. 1% EDTA 铁 0. 5ml/L。向培养液中加入A5微量元素溶液lml/L，调pH至7. 5。A5微量元素溶液，其成分 如下：H3B03286, MnCl2 · 4H20181，ZnS04 · 7H2022, CuS04 · 5Η207· 9,（ΝΗ4)6Μ〇Α4 · 4Η203· 9,单 位均为mg/100ml。盐藻培养液按100ml每瓶分装至500ml的三角瓶中，四层纱布封口，在 lOOkPa大气压下高温灭菌20min。室温冷却后使用。
[0036] (2)接种培养
[0037] 将处于代数生长期的藻液于5000r/min下离心lOmin，弃除培养液，按1%的接种 量将藻细胞加入装有新鲜培养液的三角瓶中，用四层纱布包裹瓶口。将三角瓶置于光照培 养箱中，在光照度为6000Lx (光暗周期为14h: 10h)，温度为26°C，以转速50r/min的转速震 荡培养。培养过程中用分光光度计测定藻液的光密度（0D值），当其0D600达到0. 7时加入 三乙胺500ppm，继续培养4天。
[0038] (3)色素的提取
[0039] 加入阻断剂后每个12小时，取10ml藻液在lOOOOrpm转速下离心lmin，弃上清液， 向藻泥中加入2ml丙酮，润旋分散，8000rpm转速下离心lmin，取上清转移到新的离心管中， 加入0. 2ml60% K0H，去除叶绿素的影响。过0. 45um的滤膜待测液相。
[0040] (4)含量测定
[0041] 利用高效液相（HPLC)来测定番茄红素的含量
[0042] 液相条件：流动相：45%乙腈45%异丙醇10%甲醇，流速1.21111/1^11，柱温251：， 色谱柱 Welch Ultimate XB-C18。
[0043] 加入三乙胺12小时，没有番茄红素的峰。（见图2)
[0044] 加入三乙胺24小时，番茄红素的峰高0· 974mAU。（见图3)
[0045] 加入三乙胺48小时，番茄红素的峰高11. 020mAU。（见图4)
[0046] 其中在加入阻断剂72小时番茄红素的峰高度达到最大值为16. 203mAU(见图5)。
[0047] 实施例2
[0048] (1)杜氏藻培养液配制（同实施例1)
[0049] (2)接种培养
[0050] 同实施例1，不同之处在于加入阻断剂的量不同，本实施例加入三乙胺的量为 200ppm〇
[0051] (3)含量测定（同实施例1)
[0052] 加入三乙胺12小时，没有番茄红素的峰。
[0053] 加入三乙胺24小时，番茄红素的峰高1. 938mAU。
[0054] 加入三乙胺48小时，番茄红素的峰高7. 224mAU。
[0055] 加入三乙胺72小时，番茄红素的峰高6. 310mAU。
[0056] 其中在加入阻断剂48小时番茄红素的峰高度达到最大值为7. 224mAU。
[0057] 实施例3
[0058] (1)杜氏藻培养液配制（同实施例1)
[0059] (2)接种培养
[0060] 同实施例1，不同之处在于加入阻断剂的量不同，本实施例加入三乙胺的量为 800ppm〇
[0061] ⑶含量测定（同实施例1)
[0062] 加入三乙胺12小时，没有番茄红素的峰。
[0063] 加入三乙胺24小时，番茄红素的峰高1. 598mAU。
[0064] 加入三乙胺48小时，番茄红素的峰高4. 357mAU。
[0065] 其中在加入阻断剂72小时番茄红素的峰高度达到最大值为7. 570mAU。
【权利要求】
1. 一种利用阻断巴氏盐藻代谢通路生产番茄红素的方法，其特征在于，包括如下步 骤： (1) 配制杜氏藻基本培养液，向培养液中加入A5微量元素溶液，调节pH，灭菌、冷却至 室温； (2) 将杜氏藻细胞加入培养液中，置于光照培养箱中培养，待0D600达到0. 7的时候加 入阻断剂三乙胺200-800ppm，继续培养24?96小时，然后提取色素，得到番茄红素。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杜氏藻基本培养液，其成分为： NaN030 . 420g/L, NaC187. 69g/L, NaH2P04 · 2H200. 156g/L, NaHC030 . 840g/L, KC10. 074g/L, MgS04 · 7H20L 230g/L，CaCl2 · 2H200. 044g/L，0· 1 % EDTA 铁 0· 5ml/L，调 pH 至 7. 5。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的A5微量元素溶液，其成分如下： H3B03286, MnCl2 · 4H20181，ZnS04 · 7H2022, CuS04 · 5Η207· 9,（ΝΗ4)6Μ〇7024 · 4Η203· 9,单位均为 mg/100ml，加入的量为lml/L。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的灭菌条件：压力102. 9kPa，温度 121°C，时间 20min。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养箱的培养条件为：在光照度为 6000Lx，光暗周期为14h:10h，温度为26°C，以转速50r/min的转速震荡培养。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的阻断剂三乙胺的加入量为500ppm。
7. 根据权利要求1?6任意一项所述的方法，其特征在于，所述的提取色素的方法为： 取10ml藻液在lOOOOrpm转速下离心lmin，弃上清液，向藻泥中加入2ml丙酮，润旋分散， 8000rpm转速下离心lmin，取上清转移到新的离心管中，加入0. 2Π 11601% K0H，去除叶绿素， 过0. 45um的滤膜。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（2)加入阻断剂后继续培养48?72 小时。
【文档编号】C12R1/89GK104087617SQ201410267336
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】姜建国, 李一萌 申请人:华南理工大学