一株表面具有Galα1-4Galβ1-4GlcNAc结构的工程菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种表面具有Galα1-4Galβ1-4GlcNAc结构的工程菌，该工程菌为重组大肠杆菌，菌株命名为大肠杆菌(E.coli)W3110-lgtb-lgtc，是通过在大肠杆菌(E.coli)W3110中表达β-1,4-半乳糖基转移酶基因lgtb和α-1,4-半乳糖基转移酶基因lgtc基因获得。本发明还公开了所述工程菌在制备抗志贺氏毒素感染药物中的应用，利用本发明提供的工程菌能够发酵获得表面具有Galα1-4Galβ1-4GlcNAc三糖结构的志贺氏毒素受体模拟菌，其在抗志贺氏毒素感染药物开发和相关疾病预防治疗中具有良好的应用前景。
【专利说明】—株表面具有Ga I α 1 -4Ga I β 1-4G IcNAc结构的工程菌及
其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株表面具有Gal a l_4Gal β l-4GlcNAc结构的工程菌及其构建方法以及该菌株在制备抗志贺氏毒素感染药物中的应用，属于生物技术、基因工程和微生物发酵领域。
【背景技术】
[0002]许多人类病原菌触发疾病是通过连接它们的微生物黏附蛋白到宿主细胞粘膜表面糖复合物的糖链上。例如，产志贺氏毒素大肠杆菌(STEC)产生的志贺氏毒素(Stx)与宿主肠细胞表面的寡糖链globotriose (Gal a l_4Gal β l_4Glc)结合,然后Stx通过转位跨过肠屏障而进入宿主的循环系统，从而引起痢疾，甚至是危及生命的溶血性尿毒综合征(HUS)。
[0003]由于志贺氏毒素Stx对人类的危害，许多实验组对发展抗志贺氏毒素感染策略进行了大量研究。特别的，Stx与globotriose的相互作用为抗Stx感染策略的开发提供了突破点。例如，Synsorb-Pk,—种由globotriose和硅胶构成的缀合物,具有抑制Stx对人类肾腺癌细胞侵染的作用。在另一个实验组中，globotriose被结合到了壳聚糖上，这种globotriose-壳聚糖复合物能够高效的吸收并中和非洲绿猴肾细胞上的Stx。构建Stx受体模拟菌也是一种有效的抗Stx感染的设计。这种对抗肠道感染的方法是发展一种无害菌，使它具有和宿主肠细胞表面相似的寡糖结构globotriose。这种Stx受体模拟菌(Stxreceptor-mimic bacteria)可以竞争地结合Stx,从而阻止宿主肠细胞对Stx的吸收。但是，以往研究表明，用GlcNAc替换Glc时，即Pl三糖(Gal a l-4Gal β l_4GlcNac)对Stx具有更强的吸收能力。大肠杆菌(E.coli)W3110的脂多糖(LPS)上的O-抗原天然截短，终止在N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。利用这个特点有望开发具有高效抑制志贺氏毒素感染的受体模拟菌，但检索发现关于表面具有Gal a l-4Gal β l_4GlcNAc结构的工程菌还未见报道。
【发明内容】
[0004]针对现有方法的不足，本发明要解决的问题是提供一株表面具有Gal a l-4Gal β l-4GlcNAc结构的工程菌及其构建方法以及该菌株在制备抗志贺氏毒素感染药物中的应用。
[0005]本发明所述表面具有Gala l-4Gal0 l_4GlcNAc结构的工程菌，其特征在于:所述工程菌为重组大肠杆菌，该菌株命名为大肠杆菌(E.cOli)W3110-lgtb-lgtc，其能够发酵获得表面具有Gala l_4Gali3 l_4GlcNAc三糖结构的志贺氏毒素受体模拟菌，所述大肠杆菌(E.coli)W3110-lgtb-lgtc是通过在大肠杆菌(E.coli)W3110中表达β _1，4-半乳糖基转移酶基因Igtb和α-1,4-半乳糖基转移酶基因Igtc基因获得，其基因型为W3110/p-lgtb+p-lgtc ;其中，所述Igtb和Igtc基因来源于脑膜炎双球菌(Neisseriameningitides)MC58, Igtb 基因的载体为 pACT3, Igtc 基因的载体为 pET15b。[0006]上述表面具有Gal a l_4Gal β l_4GlcNAc结构的重组大肠杆菌的构建方法，步骤是:
[0007]将来源于脑膜炎双球菌(Neisseria meningitides)MC58的Igtb基因构建到载体PACT3上,得到重组质粒pACT3-lgtb,通过CaCl2化学转化法转化pACT3_lgtb到大肠杆菌(E.coli)W3110 中，得到大肠杆菌(E.coli)W3110_lgtb。
[0008]将来源于脑膜炎双球菌(Neisseria meningitides)MC58的Igtc基因构建到载体pET15b上，得到重组质粒pET15b-lgtc，通过CaCl2化学转化法转化pET15b_lgtc到上述大肠杆菌(E.coli)W3110-lgtb中，得到目标重组大肠杆菌菌株，该菌株命名为大肠杆菌(E.coli)W3110-lgtb_lgtc,其基因型为 W3110/p-lgtb+p_lgtc。
[0009]本发明所述表面具有Gal a l_4Gal β l_4GlcNAc结构的工程菌在制备抗志贺氏毒素感染药物中的应用。
[0010]其中:所述抗志贺氏毒素感染是利用上述工程菌E.coli W3110-lgtb-lgtc发酵获得表面具有Gal a l-4Gal β l-4GlcNAc三糖结构的志贺氏毒素受体模拟菌，使其在宿主肠道内竞争性结合进入宿主肠道的志贺氏毒素，达到抑制志贺氏毒素与宿主肠表皮细胞结合的效果，从而实现抑制志贺氏毒素对宿主的侵染。
[0011]其中:所述利用上述工程菌E.coli W3110-lgtb-lgtc发酵制备表面具有Gal a l-4Gal β l_4GlcNAc三糖结构的志贺氏毒素受体模拟菌的方法是:
[0012]通过发酵培养大肠杆菌(E.coli)W3110-lgtb-lgtc并施加IPTG诱导，β -1, 4-半乳糖基转移酶LgtB和α -1, 4-半乳糖基转移酶LgtC在大肠杆菌(E.coli)W3110-lgtb-lgtc体内表 达，催化半乳糖基(Gal-)连接到N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上，摇瓶发酵最终获得表面具有Gala l_4Gal0 l_4GlcNAc三糖结构的志贺氏毒素受体模拟菌3.5g/L。
[0013]具体步骤是:
[0014]挑取所构建的重组大肠杆菌(E.coli)W31 IO-1gtb-1gtc单菌落至50mL的LB (Luria-BertaniMedium)液体培养基中,氨节青霉素终浓度为100 μ g/mL,氯霉素终浓度为 30 μ g/mL, 37°C，200-220r/min,培养 12h。
[0015]将上述培养的菌液按照0.5-5% (v/v)的接种量接入1.5L的LB液体培养基中，氨苄青霉素终浓度为0.5-0.2mM，氯霉素终浓度为0.5-0.2mM，37°C，200_220r/min。
[0016]待菌液0D600 = 0.4-0.8时，加入终浓度为0.5-0.2mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，16-370C，170-220r/min,培养 18_24h。
[0017]上述加入IPTG后，发酵温度优选16°C，培养时间优选20h。
[0018]然后收集20g上述经IPTG诱导20h的大肠杆菌(E.coli) W3110-lgtb_lgtc细胞沉淀，用200mL50% (w/v)苯酌在65°C下萃取15min ;然后4°C下10，OOOg离心30min ;收集上清溶液，用三蒸水透析去除苯酚，并冻干透析液；冻干的粉末溶于20mL0.02M醋酸钠(PH=7.0)中，分别用DNase、RNase和蛋白酶K在37°C处理2h ;4°C下10，OOOg离心30min去除沉淀，然后溶液用110，OOOg超高速离心4°C 12h;离心所得胶状物用三蒸水溶解，冻干可制备纯的脂多糖(LPS)。
[0019]利用MALD1-T0F检测提取的重组脂多糖(LPS)，结果见图4。
[0020]本发明利用大肠杆菌(E.coli)W3110脂多糖(LPS)的特点，即大肠杆菌(E.coli)W3110的脂多糖上的O-抗原天然截短，终止在N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。采用在大肠杆菌(E.coli) W3110 中表达来源于脑膜炎双球菌(Neisseria meningitides)MC58 的 α -1, 4-半乳糖基转移酶LgtC和β -1, 4-半乳糖基转移酶LgtB，催化半乳糖基(Gal-)连接到N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上，最终发酵获得了表面具有Gal a l-4Gal β l-4GlcNAc三糖结构的志贺氏毒素受体模拟菌，这种受体模拟菌能够在宿主肠道内竞争性结合进入宿主肠道的志贺氏毒素，达到抑制志贺氏毒素与宿主肠表皮细胞结合的效果，从而有效的抑制志贺氏毒素对宿主的侵染。明显体现了本发明公开的重组大肠杆菌及其在制备抗志贺氏毒素感染药物中具有非常重要的价值。并且，利用本发明提供的重组大肠杆菌发酵制备抗志贺氏毒素感染药物，步骤简单，生产周期短，成本低，可以应用于制备志贺氏毒素受体模拟菌药物的大规模生产，是一种有效的抗志贺氏毒素感染策略，在药物开发和疾病预防治疗中具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1E.coli W3110-lgtb-lgtc志贺氏毒素受体模拟菌构建原理示意图。
[0022]图2菌落PCR验证大肠杆菌E.coli W3110-lgtb_lgtc中重组质粒pACT3_lgtb和pET15b_lgtc。
[0023]图3双酶切验证大肠杆菌E.coli W3110-lgtb-lgtc中重组质粒pACT3_lgtb和pET15b_lgtc。
[0024]图4MALD1-T0F检 测提取的重组脂多糖(LPS)。
【具体实施方式】
[0025]—般性说明:如下实施例所涉及的酶均购自Thermo公司，质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒购自BIOMIA公司，操作完全按照相应说明书进行。质粒构建中基因测序由华大基因公司完成。出发菌大肠杆菌(E.coli)W3110来源于ATCC (美国典型菌种保藏中心)；DH5a感受态细胞购自全式金生物技术有限公司。实施例中的其他实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。
[0026]所述LB液体培养基为:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC15g/L。
[0027]实施例1、重组质粒pACT3_lgtb的构建
[0028](I) β -1, 4-半乳糖基转移酶Igtb基因的克隆
[0029]根据NCBI数据库里提供的Igtb基因序列来设计引物:
[0030]Igtb-F:
[0031 ] 5，-CCTC GC TCTAGA ATGCAAAACCACGTTATCAGCTTAGC-3，
[0032]Igtb-R:
[0033]5，-CGC CCC AAGCTT TTATTATTGGAAAGGCACAATGA-3 ’
[0034]PCR (聚合酶链式反应)反应体系如下。
[0035]其中，引物浓度为20ymol/L，总共50 μ L的反应体系。
[0036]
【权利要求】
1.一种表面具有Gal a l-4Gal β l_4GlcNAc结构的工程菌， 其特征在于: 所述工程菌为重组大肠杆菌，该菌株命名为大肠杆菌(E.cOli)W3110-lgtb-lgtc，其能够发酵获得表面具有Gal a l-4Gal β l-4GlcNAc三糖结构的志贺氏毒素受体模拟菌； 上述大肠杆菌(E.coli)W3110-lgtb-lgtc是通过在大肠杆菌(E.coli)W3110中表达β -1, 4-半乳糖基转移酶基因Igtb和α -1, 4-半乳糖基转移酶基因Igtc基因获得，其基因型为W3110/p_lgtb+p_lgtc ;其中，所述Igtb和Igtc基因来源于脑膜炎双球菌(Neisseriameningitides)MC58, Igtb 基因的载体为 pACT3, Igtc 基因的载体为 pET15b。
2.权利要求1所述表面具有Gala l-4Gal β l_4GlcNAc结构的工程菌在制备抗志贺氏毒素感染药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于:所述抗志贺氏毒素感染是利用权利要求1所述工程菌E.coli W3110-lgtb-lgtc发酵获得表面具有Gal a l_4Gal β l_4GlcNAc三糖结构的志贺氏毒素受体模拟菌，使其在宿主肠道内竞争性结合进入宿主肠道的志贺氏毒素，达到抑制志贺氏毒素与 宿主肠表皮细胞结合的效果，从而实现抑制志贺氏毒素对宿主的侵染。
【文档编号】C12N1/21GK104017765SQ201410267157
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】陈敏, 赵雪尔, 张厚程, 王鹏 申请人:山东大学