专利名称：三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶序列及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域。特别涉及来源于三孢布拉氏霉菌的异戊二烯焦磷酸异构酶基因、其编码蛋白及其在产类胡萝卜素的大肠杆菌基因工程菌中的应用。
背景技术：
在生物代谢途径中，异戊二烯焦磷酸异构酶(IPI，EC 5. 3. 3. 2)催化异戊二烯焦磷酸(IDP)转变为二甲基丙烯焦磷酸酯(DMAPP)。IDP和DMAPP经酶促反应缩合为法呢基焦磷酸(FPS)。FPS是类胡萝卜素、人参皂苷、薄荷醇和甘草素等许多具有保健和药用价值的天然产物的共同前体。研究表明，IPI是上述途径的关键代谢酶。因此，克隆和研究IPI的编码基因，对使用基因工程法生产上述天然产物具有重要意义。
类胡萝卜素具有抗氧化、抗癌和调节免疫系统等重要功能，而人体不能自行合成类胡萝卜素，必须通过饮食摄入。与化学合成和直接提取法相比，发酵法生产的类胡萝卜素具有安全无毒和成本低廉等优势。接合菌三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)在生长过程中可以积累大量￠-胡萝卜素，是目前唯一用于商业生产番茄红素和￠-胡萝卜素的真菌。本发明克隆了三孢布拉氏霉菌的异戊二烯焦磷酸异构酶基因ipi的全长cDNA序列，为利用基因工程发酵生产类胡萝卜素等高附加值萜烯类物质提供了新的基因来源。
发明内容
本发明提供了一个异戊二烯焦磷酸异构酶基因的全长cDNA序列，将其克隆至产 胡萝卜素的基因工程大肠杆菌中，可以显著提高￠-胡萝卜素的产量。
生三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶的氨基酸序列，所述氨基酸序列如序列表I所示。生三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶cDNA序列，包括5'非翻译区、编码区、3/非翻译区和多聚腺苷酸尾巴，所述cDNA的序列如序列表2所示。所述的cDNA序列，该cDNA序列可以用于构建表达三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶的大肠杆菌表达载体。所述的cDNA序列，该cDNA序列可以用于增强产类胡萝卜素的基因工程大肠杆菌
的胡萝卜素产量。本发明利用基因库中已有的三孢布拉氏霉菌ATCC 14272 (_)异戊二烯焦磷酸异构酶基因ipi的EST序列(GenBank收录号JK017326)，分别进行5'和3'末端快速扩增。将所得序列测序后拼接，获得了含有743bp的三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶基因的全长cDNA序列。该cDNA序列含有624bp的编码区，26bp的5丨非翻译区，71bp的3'非翻译区，以及一个22bp的多聚腺苷酸尾巴。该cDNA编码一个207个氨基酸的蛋白，该蛋白的等电点为5. 46，分子量为24. IkDa0将本发明所克隆的ipi基因cDNA编码区连接至pET22b表达载体，转入带有胡萝卜素合成酶质粒pACCAR16AcrtX的大肠杆菌中。发酵培养48小时后，提取P -胡萝卜素，使用高效液相色谱测定β-胡萝卜素含量。结果表明，ipi的转入使得β-胡萝卜素提高46. 7%。本发明为基因工程法生产甲羟戊酸途径下游的次生代谢产物提供了新的基因来源。
图I不同物种异戍ニ烯焦磷酸异构酶的进化树分析。蛋白编号来自WWW. uniprot.Org0图2三孢布拉氏霉菌异戊ニ烯焦磷酸异构酶基因ipi在大肠杆菌中的表达。M为蛋白分子量Marker ；1泳道为对照用品；2泳道为表达ipi的样品。图3三孢布拉氏霉菌异戊ニ烯焦磷酸异构酶基因ipi在产类胡萝卜素的大肠杆菌中表达。图4高效液相色谱测定表达和不表达三孢布拉氏霉菌异戊ニ烯焦磷酸异构酶基 因ipi的基因工程大肠杆菌中的类胡萝卜素含量。
具体实施例方式I三孢布拉氏霉菌异戊ニ烯焦磷酸异构酶基因ipi的克隆使用末端快速扩增技术进行基因克隆。提取三孢布拉氏霉菌的总RNA后，以核酸序列V -CTCGGTGCCAAATAATGAATACG-3 '作为引物进行反转录。将得到的cDNA第一链纯化后，使用末端脱氧核苷酸转移酶在cDNA的5'末端加寡聚胞嘧啶。根据三孢布拉氏霉菌ipi基因的EST序列(Genbank收录号JKO17326)，设计特异性引物。5 ^末端快速扩增PCR进行两轮。第一轮PCR以V -ACGATACACTCCAGAGCGAATG (14)-3 '和5 ' -CTCGGTGCCAAATAATGAATACG-3 '为上、下游引物。将产物稀释500倍后作为模板，进行第二轮PCR。第二轮PCR以5 ' ACGATACACTCCAGAGCGAAT-3 '和5' -CATCTGCTGTATTTAAGGGGTGAGA-3'作为上、下游引物。PCR产物纯化后连接pMD18_T载体进行测序。在进行3 '末端快速扩增时，以 5 ' -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGT(18)-3 ;作为反转录引物。3'末端快速扩增PCR进行两轮，第一轮以5 ' -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3 '和 5 ' -TCTCACCCCTTAAATACAGCAGATG-3 '作为上、下游引物。将PCR产物稀释500倍后作为模板，进行第二轮PCR。第二轮PCR以5 ' -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3 '和 5 ' -CGTATTCATTATTTGGCACCGAG-3 '作为上、下游引物。PCR产物纯化后连接pMD18-T载体进行测序。将核心EST序列、5'和3'末端快速扩增测序结果进行拼接，得到了三孢布拉氏霉菌异戊ニ烯焦磷酸异构酶基因ipi的全长cDNA序列。图I显示了核酸序列、对应氨基酸序列以及酶活性位点。2三孢布拉氏霉菌异戊ニ烯焦磷酸异构酶基因ipi编码序列的分析将所克隆的三孢布拉氏霉菌异戊ニ烯焦磷酸异构酶基因ipi的cDNA编码序列在http://www. ncbi. nlm. nih. gov 和 http://cn. expasy. org 进行分析，表明所克隆 cDNA 编码的蛋白属于nudix水解酶超家族。该蛋白含有207个氨基酸，等电点为5. 46，分子量为24. IkDa0进化树显示三孢布拉氏霉菌的异戍ニ烯焦磷酸异构酶(BtIPI)与其他真菌的该酶具有较高同源性(图2)。
3三孢布拉氏霉菌异戊ニ烯焦磷酸异构酶基因ipi在大肠杆菌中的表达及酶活测定以三孢布拉氏霉菌总cDNA为模板，使用引物5' -GGAATTCCATATGTGTATTGTGATTGATAAAGATGATA-3'和 5' -CGCGGATCCTTAAAAGCCTAAGCGATGAATG-3'对 ipi 的编码区进行扩増。将扩增产物用限制性内切酶NdeI和BamHI酶切回收后，连接至表达载体pET22b，所构建载体命名为pET22b-BtIPI。载体pET22b-BtIPI转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，使用氨苄霉素作为筛选标记。将阳性克隆接种于Luria-Bertani (LB)液体培养基上，37度培养，然后转接到30ml LB培养基中培养至0D600约O. 4，加入O. 2mM的IPTG诱导4小时，30度培养。取样进行蛋白电泳，将带有空载体pET22b的大肠杆菌BL21 (DE3)作为对照。如图3所示，IPI蛋白成功地被诱导表达。样品在提取液(50mMM0PS,20mM MgCl2, 5% (v/v)甘油和 2mM DTT，pH 7. 5)中超声破碎，离心取上清。得到IPI粗酶液。将88 μ I粗酶液、2 μ I IM的MgCl2和 ομ I的2. 5mMIDP 加入反应液(50mM MOPS, 20mM MgCl2, 5%甘油(v/v)，pH 7· 5)，在 30°C温浴 90min。加入10 μ I 85%的H3PO4, 70°C加热90min，使用气相色谱测定DMADP释放出的异戊ニ烯含量。蛋白浓度测定按Bradford法进行。结果表明粗酶液姆mg蛋白可以通过上述反应姆秒释放I. 8pmol的异戍ニ烯,而转入空载的对照组仅释放O. 05pmol的异戍ニ烯。该结果证明本发明中的IPI的cDNA序列能够编码具有异戊ニ烯焦磷酸异构酶活性的蛋白。4三孢布拉氏霉菌异戊ニ烯焦磷酸异构酶基因ipi在产生类胡萝卜素的大肠杆菌中的表达载体pET22b-BtIPI转化进入带有质粒pACCAR16 Δ crtX的大肠杆菌BL21 (DE3)中。将阳性克隆接种于固体Luria-Bertani (LB)琼脂培养基上，使用氯霉素和氨苄霉素作为筛选标记。如图3所示，在25°C培养4天后，我们发现表达BtIPI的基因工程菌的菌体颜色要明显黄于未表达BtIPI的大肠杆菌。同时，将1%体积的过夜培养物接种于LB液体培养基，28°C培养48小时，使用高效液相色谱测定β_胡萝卜素含量。结果如图4所示，与未表达BtIPI的大肠杆菌相比，表达BtIPI的基因工程菌的β -胡萝卜素含量提高了 46. 7%。权利要求
1.三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶的氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列如序列表I所示。
2.三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶cDNA序列，包括5'非翻译区、编码区、3'非翻译区和多聚腺苷酸尾巴，其特征在于，所述cDNA的序列如序列表2所示。
3.如权利要求2所述的cDNA序列，其特征在于，该cDNA序列可以用于构建表达三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶的大肠杆菌表达载体。
4.如权利要求2或3所述的cDNA序列，其特征在于，该cDNA序列可以用于增强产类胡萝卜素的基因工程大肠杆菌的￠-胡萝卜素产量。
全文摘要
本发明公开了三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶序列及其用途。该cDNA序列为743bp，含有624bp编码区，26bp 5′非翻译区，71bp 3′非翻译区，以及22bp的多聚腺苷酸尾巴。该cDNA编码一个207个氨基酸的蛋白，该蛋白的等电点为5.46，分子量为24.1kDa。将本发明所克隆的cDNA连接至pET22b表达载体，转入带有胡萝卜素合成酶质粒pACCAR16ΔcrtX的大肠杆菌中。该基因的转入可以使β-胡萝卜素的产量提高46.7%。本发明为基因工程法生产甲羟戊酸途径下游的次生代谢产物提供了新的基因来源。
文档编号C12N15/70GK102747061SQ201210225148
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者孙新晓, 孙杰, 袁其朋 申请人:北京化工大学