专利名称：一种卡拉胶降解菌及其发酵方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新土地杆菌属的细菌，特别是一种卡拉胶降解菌及其发酵方法与应用。
背景技术：
卡拉胶是从某些的红藻中提取酸性的线性多聚糖，属于亲水性的线性硫酸化半乳糖家族。它们主要由交替的3-连接的β-D-吡喃半乳糖(G-单元)和4-连接的α-D-吡喃半乳糖(D-单元)或4-连接的3，6-内醚-a -D-吡喃半乳糖(DA_单元)，形成重复的二糖单元组成。
卡拉胶因具有优良的热可逆凝胶化、抗蛋白凝结、亲水无毒等性能而广泛应用于食品工业中。卡拉胶还用于医药行业，如作为微生物培养基、缓释胶囊/片剂、药膏基、鱼肝油乳化剂等。卡拉胶寡糖是卡拉胶的降解产物，分子量较小，溶解性较好，同时因糖链上的活性基团充分暴露出来，使其活性较卡拉胶显著提高，拓宽了医药上的应用领域。研究发现卡拉胶寡糖具有特殊的医药疗效，它对许多重要病毒病原(如疱疹病毒、粘液病毒、HPV等) 具有广谱抑制活性，有许多证据表明卡拉胶寡糖能够在抗HIV上提供保护。卡拉胶寡糖还对免疫系统具有持续性作用，能有效的抗胃蛋白酶活、抗溃疡、抗凝血、抗栓物质。
目前降解卡拉胶的方法有物理法、化学法、酶解法。其中酶解法以其降解过程容易控制，反应条件温 和，对环境没有污染等优点而倍受青睐。虽然目前已在很多种微生物中发现卡拉胶酶，但由于酶活不高，产酶量小等缺点，不能满足对卡拉胶寡糖日益增长的需求， 因此寻找具有能分泌降解卡拉胶能力酶的菌种是十分需要的。发明内容
本发明的目的在于提供一种能分泌卡拉胶降解酶的新菌种，并提供该新菌种的分离培养方法和降解卡拉胶生成寡糖的方法。(以下部分与权利要求一致)
本发明所述的卡拉胶降解菌(Pedobacter hainanensis sp. ) 13-Q菌株(CGMCC NO. 5564)分离自海南省海口市黎安镇麒麟菜晾晒处的土壤中，经一系列形态学、生理生化、 16S rRNA、脂肪酸组分分析、醌型分析表明它属于土地杆菌属，但又区别于土地杆菌属中的其它种，定名为卡拉胶降解菌(Pedobacter hainanensis sp. )13_Q。该菌分类位置比较独立，申请人已针对该菌发展了一套培养技术，能从该菌稳定生产具有降解卡拉胶能力的酶。 该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期2011年12月9日，其保藏编号为CGMCC NO. 5564。
所述卡拉胶降解菌菌株的生物化学特征为
菌落形态特征为
在卡拉胶固体培养基上生长良好，菌落黄色，圆形，表面略凸起，光滑，反光，不透明，边缘整齐，直径约为1. Omm ;
菌体形态特征为
细胞杆状，O. 3^0. 5 μ mX1. 3^2. O μ m,单个或成对排列，革兰氏染色阴性，不生孢，运动；
主要生理生化特征
在卡拉胶液体培养基中可产生卡拉胶降解酶；好氧；可以利用L-阿拉伯糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、鼠李糖、α -甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-葡萄糖胺、熊果苷、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、龙胆二糖、D-松二糖、葡萄糖酸盐。但是葡萄糖和阿拉伯糖产酸。该菌的氧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、酯酶(C4)、类脂酯酶 (CS)反应为阳性；不呈现脲酶、色氨酸脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶活性；该菌不能水解淀粉、明胶、酪素、菊糖等；不生成吲哚和硫化氢；硝酸盐还原呈阴性反应；在麦康凯培养基上不能生长。
脂肪酸组分特征
主要脂肪酸及比例为iso-C15:0 (40. 4%), Iso-C15 : 0 2-0Η and/or C16ll ω 7c (18. 9%) and iso-C17:。3_0Η(18·4%)。
醌型特征
主要优势醌为甲基萘醌Κ7 (ΜΚ-7)，含量大约为92.9%。
DNA G+C mol% 含量特征
DNA G+C mol% 含量为 42. 7%。
遗传学特征
所述卡拉胶降解菌(Pedobacterhainanensis sp. )13_Q 菌株的 16S rRNA 全基因序列。菌株16S rRNA全基因序列(139lbp) (Genbank登录号为JQ083404)为
I gtcgaggggc agcggggact ttcgggttcg ccggcgaccg gcgcacgggt gcgtaacgcg
61 tatgcaacct acctttatca gggggatagc ccggagaaat ccggattaac accgcataaa
121atcacagtaccgcatggtataatgatcaaatatttataggataaagatgggcatgcgtgt
181cattagctagttggagaggtaacggctcaccaaggcgacgatgactaggggatctgagag
241gatgaccccccacactggtactgagacacggaccagactcctacgggaggcagcagtaag
301gaatattggtcaatggagggaactctgaaccagccatgccgcgtgcaggaagactgccct
361atgggttgtaaactgcttttgtatgggaataaaccctggtatgtataccaggctgaatgt
421accataagaataaggatcggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggaggatcca
481agcgttatccggatttattgggtttaaagggagcgtaggcggcctgttaagtcaggggtg
541aaagacggtggctcaaccatcgcagtgcctttgatactgataggcttgaatatagttgag
601gtaggcggaatgtgacaagtagcggtgaaatgcatagatatgtcacagaacaccgattgc
661gaaggcagctatattgacgctgaggctcgaaagcgtggggatcaaacagg
721attagataccctggtagtccacgccctaaacgatgataactcgatgttagcgatatacag
781ttagcgtccaagcgaaagcgttaagttatccacctggggagtacgcccgcaagggtgaaa
841ctcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggaggagcatgtggtttaattcgatgata
901cgcgaggaaccttacccgggcttgaaagttactgcattactcagagatgagtaagacctt
961cgggacaggaaactaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgccgtgaggtgttgggtt
1021 aagtcccgca acgagcgcaa cccctatgtt tagttgccag catttaaggt ggggactcta
1081 aacagactgc ctgcgcaagc agagaggaag gatgggacga cgtcaagtca tcatggccct
1141 tacgtccggg gctacacacg tgctacaatg gtcggtacag agggccgcta cccagcgatg
1201 ggatgccaat ctcaaaaagc cgatcacagt tcggatcggg gtctgcaact cgaccccgtg
1261 aagttggatt cgctagtaat cgcgtatcag caatgacgcg gtgaatacgt tcccgggcct
1321 tgtacacacc gcccgtcaag ccatggaagt tgggggtgcc taaagtccgt aaccgcaagg 1381 atcggcctag g
根据《Bergey’sManual of Deteminative Bacteriology (Ninth Edition)》(John G. Holt et al. 1994)和MIDI公司Sherlock全自动细菌鉴定系统脂肪酸成份分析以及形态和生理生化特征，本发明菌株与土地杆菌属有相似性，用Phylip软件包对其16S rRNA序列进行系统学分析，并用邻接法(Neigbor-Joining)构建系统树表明本菌株与土地杆菌属属于同一类群，关系最紧密。16S rRNA序列分析表明，与Genbank国际基因序列数据库记录的最相似的菌株 Pedobacter terricola DS-40T (EF446146)的相似性为 95. 2%。
卡拉胶降解菌的发酵方法
I)将卡拉胶降解菌划线于卡拉胶固体培养基上，在25-35摄氏度培养72_96小时；
2)将固体培养基种子接1-3环于种子培养基的试管中，于25-35摄氏度下以 150-210rpm转速培养48-72小时。
3)按体积比为l/5(Tl. 5/5将种子培养基接入发酵培养基中，25_35摄氏度下以 150-210rpm转速培养48-96小时。获取发酵物。
所述卡拉胶固体培养基(g/L):琼脂粉7_15，蛋白胨3_8，酵母浸出粉0. 5_5，卡拉胶1-10，氯化钠:0 -20, FeSO4 · 7H20 :0. 01-0. 05 ；MgS04 · 7H20 :0. 2-1. O ；CaCl2 :0. 1-0. 5 ； KH2PO4 0. 5-4，余量为水，pH 6. 0-8. O。
所述种子培养基(g/L):酵母浸膏0. 5-5，蛋白胨2_10，卡拉胶1_10，余量为水， 氯化钠0-20，pH6. 0-8. O。
所述发酵培养基(g/L):卡拉胶0. 2-1，蛋白胨2-8，酵母浸出粉0. 5-5, FeSO4 · 7H20 0. 01-0. 05 ；MgS04 · 7H20 :0. 2-1. 0 ；CaCl2 :0. 1-0. 5 ；KH2PO4 :0. 5-4,用水补足 1000ml, pH 6.0-8. 0。所述卡拉胶降解菌13-Q可用于发酵生产具有降解卡拉胶能力的酶。本发明的优点本发明所述的卡拉胶降解菌(Pedobacter hainanensis sp. )13_Q CGMCC NO. 5564
的优点
1.在此之前没有报道过土地杆菌属中能生产卡拉胶降解酶的细菌，该发明为首次发现土地杆菌属中该菌还可以进一步遗传选育或改良得到更优良的工业生产用菌；对目前卡拉胶降解酶日益增加的需求，本发明为之找到了一条新的生产途径。
2.具有生产降解卡拉胶能力的酶的用途，该菌能稳定的产生含量较高的卡拉胶降解酶。
3.可应用该菌发酵得到的卡拉胶降解酶制备与其它细菌不同聚合度的卡拉胶寡糖。
图1.脂肪酸组分及比例图2.醌型分析结果图3.卡拉胶降解菌(Pedobacter hainanensis sp. )13_Q 菌株 CGMCC NO. 5564 酶解卡拉胶聚糖得到的高效液相色谱图。
图4.卡拉胶降解菌(Pedobacter hainanensis sp. )13_Q 菌株 CGMCC NO. 5564 酶解卡拉胶聚糖得到的质谱图。
卡拉胶降解菌，命名为卡拉胶降解菌13-Q,即Pedobacter hainanensis sp. 13-Q, 该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称中国普通微生物菌种保藏管理中心，简称CGMCCJia :中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2011年12月9日，其保藏编号为CGMCC NO. 5564。
表1.卡拉胶降解菌(Pedobacter hainanensis sp. )13_Q 菌株 CGMCC NO. 5564 的 16S rRNA 序列。
具体实施方式
实施例1
卡拉胶降解菌( Pedobacterhainanensis sp. ) 13-Q 的分离和纯化。
1、菌株的分离
(I)采集样品
采集海南省海口市黎安镇麒麟菜晾晒处的土壤后，取10g，加无菌水90ml，制成土壤悬浮液。
(2)菌株分离
取菌液1ml，用无菌水依次稀释10_3_10_6倍，于卡拉胶固体培养基上划线，卡拉胶固体培养基配方(g/L):琼脂粉7-15，蛋白胨3-8，酵母浸出粉0. 5-5，卡拉胶1_10，氯化钠:0-20, FeSO4 *7H20 0. 01-0. 05 ;MgS04 · 7Η20 :0. 2-1. O ；CaCl2 :0. 1-0. 5 ；KH2PO4 :0. 5-4, pH 6. 0-8. 0，余量为水。
(3)菌株的纯化
按照微生物纯种分离的常规方法，将上述培养基于30°C放置3-5天。挑取多个单菌落，接种到新的卡拉胶固体培养基上，至少重复10次，纯化菌落。再在液体培养基中进行发酵检验，结果得到一株卡拉胶酶产量较高的菌株。
所述种子培养基(g/L):酵母浸膏0. 5-5，蛋白胨2_10，卡拉胶1_10，氯化钠 0-20，ρΗ6· 0-8. 0，用水不足 IOOOml0
所述发酵培养基(g/L):卡拉胶0. 2-1，蛋白胨2-8，酵母浸出粉0. 5-5, FeSO4 · 7H20 0. 01-0. 05 ；MgS04 · 7H20 :0. 2-1. 0 ；CaCl2 :0. 1-0. 5 ；KH2PO4 :0. 5-4,用水补足 1000ml，pH 6. 0-8. 0。
实施例2
卡拉胶降解菌(Pedobacter hainanensis sp. ) 13-Q菌株的分离的鉴定。
(I)卡拉胶降解菌(Pedobacter hainanensis sp. ) 13-Q菌株的菌体及菌落形态特征
卡拉胶降解菌(Pedobacterhainanensis sp. ) 13-Q 菌株为杆状，0.3^0. 5 μ mX1. 3^2. O μ m,单个或成对排列，革兰氏染色阴性，不生孢，运动；在卡拉胶固体培养基上生长良好，菌落黄色，圆形，表面略凸起，光滑，反光，不透明，边缘整齐，直径约为1.Omnin
(2)卡拉胶降解菌(Pedobacter hainanensis sp. ) 13-Q菌株的生理生化特征
好氧，可以利用L-阿拉伯糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、鼠李糖、 α_甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-葡萄糖胺、熊果苷、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、 海藻糖、龙胆二糖、D-松二糖、葡萄糖酸盐。但是葡萄糖和阿拉伯糖产酸。该菌的氧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(CS)反应为阳性；不呈现脲酶、色氨酸脱氨酶、 鸟氨酸脱羧酶活性；该菌不能水解淀粉、明胶、酪素、菊糖等；不生成吲哚和硫化氢；硝酸盐还原呈阴性反应；在麦康凯培养基上不能生长。
(3)脂肪酸组分特征
主要脂肪酸及比例为iso-C15:Q(40. 4 % ), iSo-C15 ； Q 2-0H and/or C16 ； ^7c(18. 9% )and iso_C17:。3_0Η(18· 4% )(图· I)。
醌型特征
主要优势醌为甲基萘醌K7 (MK-7)，含量大约为92. 9% (图· 2)。
DNA G+C mol%含量特征
DNA G+C mo I % 含量为 42. 7%。
遗传学特征
16S rRNA喊基序列(表· I);菌株16S rRNA全基因序列共1391bp (Genbank登录号为 JQ083404)。
表I
I gtcgaggggc agcggggact ttcgggttcg ccggcgaccg gcgcacgggt gcgtaacgcg
61 tatgcaacct acctttatca gggggatagc ccggagaaat ccggattaac accgcataaa
121atcacagtaccgcatggtataatgatcaaatatttataggataaagatgggcatgcgtgt
181cattagctagttggagaggtaacggctcaccaaggcgacgatgactaggggatctgagag
241gatgaccccccacactggtactgagacacggaccagactcctacgggaggcagcagtaag
301gaatattggtcaatggagggaactctgaaccagccatgccgcgtgcaggaagactgccct
361atgggttgtaaactgcttttgtatgggaataaaccctggtatgtataccaggctgaatgt
421accataagaataaggatcggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggaggatcca
481agcgttatccggatttattgggtttaaagggagcgtaggcggcctgttaagtcaggggtg
541aaagacggtggctcaaccatcgcagtgcctttgatactgataggcttgaatatagttgag
601gtaggcggaatgtgacaagtagcggtgaaatgcatagatatgtcacagaacaccgattgc
661gaaggcagctatattgacgctgaggctcgaaagcgtggggatcaaacagg
721attagataccctggtagtccacgccctaaacgatgataactcgatgttagcgatatacag
781ttagcgtccaagcgaaagcgttaagttatccacctggggagtacgcccgcaagggtgaaa
841ctcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggaggagcatgtggtttaattcgatgata
901cgcgaggaaccttacccgggcttgaaagttactgcattactcagagatgagtaagacctt
961cgggacaggaaactaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgccgtgaggtgttgggtt0108] 1021 aagtcccgca acgagcgcaa cccctatgtt tagttgccag catttaaggt ggggactcta0109]1081aacagactgcctgcgcaagcagagaggaaggatgggacgacgtcaagtcatcatggccct0110]1141tacgtccggggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggccgctacccagcgatg0111]1201ggatgccaatctcaaaaagccgatcacagttcggatcggggtctgcaactcgaccccgtg0112]1261aagttggattcgctagtaatcgcgtatcagcaatgacgcggtgaatacgttcccgggcct0113]1321tgtacacaccgcccgtcaagccatggaagttgggggtgcctaaagtccgtaaccgcaagg1381 atcggcctag g
实施例3
种卡拉胶降解菌((Pedobacterhainanensis sp. ) 13-Q 菌株 CGMCC :5564 的发酵工艺
I)将卡拉胶降解菌划线于卡拉胶固体培养基上，在25摄氏度培养4天；
2)将固体培养基种子接1-3环于种子培养基中，于25摄氏度下以150rpm转速培养48小时。
3)按体积比为l/5(Tl. 5/5将种子培养基接入I升发酵培养基中，25摄氏度下以 150转速培养4天。获取发酵物。
所述卡拉胶固体培养基(g/L):琼脂粉7_15，蛋白胨3_8，酵母浸出粉O. 5-5，卡拉胶1-10，氯 化钠:0-20, FeSO4 · 7H20 :0. 01-0. 05 ；MgS04 · 7H20 :0. 2-1. O ；CaCl2 :0. 1-0. 5 ； KH2PO4 0. 5-4，余量为水，pH 6. 0-8. O。
所述种子培养基(g/L):酵母浸膏0. 5-5，蛋白胨:2-10,卡拉胶:1-10,蒸馏水 1000ml，氯化钠:0-20，余量为水，ρΗ6· 0-8. O。
所述发酵培养基(g/L):卡拉胶O. 2-1，蛋白胨2-8，酵母浸出粉0. 5-5, FeSO4 · 7H20 0. 01-0. 05 ；MgS04 · 7H20 :0. 2-1. 0 ；CaCl2 :0. 1-0. 5 ；KH2PO4 :0. 5-4,用水补足 1000ml, pH 6.0-8. 0。
实施例4
一种卡拉胶降解菌(Pedobacter hainanensis sp. )13_Q 菌株 CGMCC :5564 的发酵工艺
I)将卡拉胶降解菌接种于卡拉胶固体培养基上，在30摄氏度培养4天；
2)将固体培养基种子接于种子培养基的试管中，于30摄氏度下以ISOrpm转速培养48小时。
3)按体积比为1/5 1. 5/5将种子培养基接入5升发酵培养基中，30摄氏度下以 180转速培养4天。获取发酵物。
所述卡拉胶固体培养基(g/L):琼脂粉7_15，蛋白胨3_8，酵母浸出粉O. 5-5，卡拉胶1-10，氯化钠:0-20, FeSO4 · 7H20 :0. 01-0. 05 ；MgS04 · 7H20 :0. 2-1. O ；CaCl2 :0. 1-0. 5 ； KH2PO4 0. 5-4，用水补足 1000ml, pH 6. 0-8. 0。
所述种子培养基(g/L):酵母浸膏0. 5-5，蛋白胨2_10，卡拉胶1_10，氯化钠 0-20，用水补足 1000ml, ρΗ6· 0-8. O。
所述发酵培养基(g/L):卡拉胶O. 2-1，蛋白胨2-8，酵母浸出粉0. 5-5, FeSO4 · 7H20 0. 01-0. 05 ；MgS04 · 7H20 :0. 2-1. 0 ；CaCl2 :0. 1-0. 5 ；KH2PO4 :0. 5-4,用水补足 1000ml, pH 6.0-8. 0。
实施例5
一种卡拉胶降解菌(Pedobacter hainanensis sp. )13_Q 菌株 CGMCC :5564 的发酵工艺
I)将卡拉胶降解菌接种于卡拉胶固体培养基上，在35摄氏度培养4天；
2)将固体培养基种子接1-3环于种子培养基的试管中，于35摄氏度下以210rpm 转速培养48小时。
3)按体积比为1/5 1. 5/5将种子培养基接入I升发酵培养基中，35摄氏度下以 210转速培养4天。获取发酵物。
所述卡拉胶固体培养基(g/L):琼脂粉7_15，蛋白胨3_8，酵母浸出粉O. 5-5，卡拉胶1-10，氯化钠:0-20, FeSO4 · 7H20 :0. 01-0. 05 ；MgS04 · 7H20 :0. 2-1. O ；CaCl2 :0. 1-0. 5 ； KH2PO4 0. 5-4，用水补足 1000ml, pH 6. 0-8. 0。
所述种子培养基(g/L):酵母浸膏0. 5-5，蛋白胨2_10，卡拉胶1_10，氯化钠0-20，用水补足 1000ml, ρΗ6· 0-8. O。
所述发酵培养基(g/L):卡拉胶O. 2-1，蛋白胨2-8，酵母浸出粉0. 5-5, FeSO4 · 7H20 0. 01-0. 05 ；MgS04 · 7H20 :0. 2-1. 0 ；CaCl2 :0. 1-0. 5 ；KH2PO4 :0. 5-4,用水补足 1000ml, pH 6.0-8. 0。
实施例6
按照常规方法进行卡拉胶酶的制备，制 备过程参考文献《Statistical optimization of medium components for K -carrageenase production by Pseudomonas elongata)), Yasmin Khambhaty 等人。
卡拉胶降解菌(Pedobacter hainangensis sp. 13-Q)在实施例1的基础上制备卡拉胶酶的方法。
I)将培养3-4天的发酵液在4°C条件下IOOOOg离心25分钟以去除菌体，留上清液备用。
2)上清液经60%饱和硫酸铵在4摄氏度搅拌过夜，12000g离心30分钟，收集沉淀， 用一定量的PBS缓冲液(0. 02-0. 05M，pH 7. 0-8. 0)重新溶解沉淀，再用相同缓冲液透析除盐，得粗酶液。
实施例7
利用卡拉胶降解菌(Pedobacterhainanensis sp. ) 13-Q 菌株 CGMCC NO. 5564 制备卡拉胶寡糖。
将实施例6中得到的粗酶液加入卡拉胶底物中，使1000ml体系中卡拉胶底物质量为5-20g、粗酶液2-10ml、余量为水，于30_40°C，pH 7. 0-8. O条件下酶解反应3_9小时，将反应器置于沸水10-15分钟终止反应。制得的卡拉胶寡糖溶液粗产品去除蛋白质后 (Sevage法),经真空旋蒸仪蒸发除去水分,烘干,得到卡拉胶寡糖产物。
所述卡拉胶降解菌发酵产生的卡拉胶降解酶生产卡拉胶寡糖的特征
寡糖产物经过高效液相色谱(图.3)和电喷雾离子质谱(图.4)分析说明聚合度在 2-8之间。
利用卡拉胶降解菌(Pedobacterhainanensis sp. ) 13-Q 菌株 CGMCC NO. 5564 制备卡拉胶寡糖高效液相色谱和电喷雾离子质谱分析
用实施例7中得到的卡拉胶寡糖配制0. 1-0. 5%的溶液经0. 45 μ m滤膜过滤，经高效液相色谱和电喷雾离子质谱分析，卡拉胶寡糖聚合度为 2-8。
权利要求
1.一种卡拉胶降解菌，其特征在于命名为卡拉胶降解菌13-Q,即Pedobacter hainanensis sp. 13-Q,该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏单位名称中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期2011年12月9日，其保藏编号为 CGMCC NO. 5564。
2.按照权利要求1所述卡拉胶降解菌，其特征在于菌落形态特征为在卡拉胶固体培养基上生长良好，菌落黄色，圆形，表面略凸起，光滑，反光，不透明，边缘整齐，直径约为1. Omm;菌体形态特征为细胞杆状， O. 3-0. 5 μ mX1. 3-2. O μ m，单个或成对排列，革兰氏染色阴性，不生孢，运动；主要生理生化特征在卡拉胶液体培养基中可产生卡拉胶降解酶；好氧；可以利用L-阿拉伯糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、鼠李糖、α -甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-葡萄糖胺、熊果苷、 七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、龙胆二糖、D-松二糖、葡萄糖酸盐。但是葡萄糖和阿拉伯糖产酸。该菌的氧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(CS) 反应为阳性；不呈现脲酶、色氨酸脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶活性；该菌不能水解淀粉、明胶、酪素、菊糖等；不生成吲哚和硫化氢；硝酸盐还原呈阴性反应；在麦康凯培养基上不能生长，脂肪酸组分特征主要脂肪酸及比例为 iso-C15:Q (40.4%)，iso-C15:。2-0H and/or C16:丨 ω 7c (18. 9% ) and iso-C17:。3_0Η(18· 4% )(图· 1)，醌型特征主要优势醌为甲基萘醌K7 (1 -7)，含量大约为92.9% (图.2)，DNA G+C mo I %含量特征DNA G+C mo I % 含量为 42. 7%，遗传学特征所述卡拉胶降解菌(Pedobacter hainanensis sp. )13_Q菌株的16S rRNA全基因喊基序列(表.1);菌株16S rRNA全基因序列共1391bp (Genbank登录号为JQ083404)；与Genbank国际基因序列数据库记录的最相似的菌株Pedobacter terricola DS-40T(EF446146)的相似性为 95. 2% 0
3.—种权利要求1所述卡拉胶降解菌的酶解产物，其特征在于卡拉胶降解菌的酶解方法，1)将卡拉胶降解菌划线于卡拉胶固体培养基上，在25-35摄氏度培养72-96小时；2)将固体培养基种子接于种子培养基的试管中，接种1-3环，于25-35摄氏度下以 150-210rpm转速培养48-72小时；3)按体积比为l/5(Tl.5/5将种子培养基接入发酵培养基中，25-35摄氏度下以 150-210rpm转速培养48-96小时，获取发酵物。
4.按照权利3所述卡拉胶降解菌的发酵方法，其特征在于所述卡拉胶固体培养基(g/L):琼脂粉7-15，蛋白胨3-8，酵母浸出粉O. 5-5，卡拉胶:1-10,氯化钠:0-20, FeSO4 · 7H20 :0. 01-0. 05 ；MgS04 · 7H20 :0. 2-1. O ；CaCl2 :0. 1-0. 5 ； KH2PO4 0. 5-4，pH 6. 0-8. 0，余量为水；所述种子培养基(g/L):酵母浸膏0. 5-5，蛋白胨2-10，卡拉胶1-10，氯化钠0_20，pH6. 0-8. O，余量为水；所述发酵培养基(g/L):卡拉胶O. 2-1，蛋白胨2-8，酵母浸出粉0. 5-5，FeSO4 · 7H20 O.01-0. 05 ；MgS04 · 7H20 0. 2-1. 0 ；CaCl2 :0. 1-0. 5 ；KH2PO4 :0. 5-4,用水补足 1000ml, pH. 6.0_8· O0
5.一种权利要求3所述卡拉胶降解菌的酶解产物在生产卡拉胶寡糖中的应用，其特征在于利用卡拉胶降解菌的酶解产物中产生的卡拉胶降解酶生产卡拉胶寡糖，也可称之为卡拉胶降解菌(Pedobacter hainanensis sp. ) 13-Q用于生产卡拉胶寡糖；1)收集发酵粗酶液将按照权利要求3得的发酵液，经IOOOOg离心10分钟去除菌体， 上清液经60%饱和硫酸铵在4摄氏度搅拌过夜，12000g离心30分钟，收集沉淀，用PBS缓冲液(O. 02-0. 05M, pH 7. 0-8. O)重新溶解沉淀，再用相同缓冲液透析除盐，得粗酶液；酶解底物于反应器中进行反应，将粗酶液加入卡拉胶底物中，使IOOOml体系中卡拉胶底物质量为5-20g、粗酶液2-10ml、余量为水，于30_40°C，pH 7. 0-8. O条件下酶解反应 3-9小时，将反应器置于沸水10-15分钟终止反应；得的卡拉胶寡糖溶液粗产品；2)分离产物所得的卡拉胶寡糖溶液粗产品，经过除去酶蛋白质(Sevage法)后，于真空旋转蒸发仪中去除水分，或经喷雾干燥或冷冻干燥去除水分，得到卡拉胶寡糖产物。
全文摘要
本发明涉及一种新土地杆菌属的细菌，具体的说是一种降解卡拉胶的新菌及其发酵的方法和应用，其命名为卡拉胶降解菌13-Q，即Pedobacter hainanensis sp.13-Q，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期2011年12月9日，其保藏编号为CGMCC NO.5564。本发明还对该菌发展了一套培养技术，能从该菌稳定生产具有降解卡拉胶能力的酶。
文档编号C12R1/01GK102994408SQ20121022399
公开日2013年3月27日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者杜昱光, 孟彦羽, 傅赟彬, 赵勇, 尹恒, 王文霞, 拓亚琴 申请人:中国科学院大连化学物理研究所