专利名称：一种发酵制备天然番茄红素的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及类胡萝卜素的制备方法，尤其是指一种采用丝状真菌三孢布拉氏霉进行发酵制备天然番茄红素的工艺。
背景技术：
番茄红素是类胡萝卜素的一种，已被证明是一种天然抗氧化剂。据国外一些机构的研究报道表明，该产品对于预防和治疗心血管类疾病、动脉硬化、肿瘤和男性不育等多种成人疾病，以及对增强人体免疫功能具有重要的生理意义。目前国内对番茄红素的生产尚属空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵制备天然番茄红素的工艺。这种方法比较简单，产量高，成本低，对环境无污染。
本专利包括a.一级种培养；b.二级种培养；c.发酵；d.提取，其特征是一级种培养时，将保藏在土豆葡萄糖琼脂培养基斜面上能代谢产生番茄红素的三孢布拉霉两性菌种，分别接入装有种子培养基的三角烧瓶中，在24～30℃、160～180转/分钟条件下，进行振荡培养44～48小时；在二级种的培养特时，将分别培养好的三孢布拉霉两性菌种的一级种按1∶1的比例混合后，接入种子罐内进行扩大培养，作为发酵用的种子，培养条件为温度24～30℃，通风量1∶1，培养时间为24～48小时。
一级种与二级种的种子培养基为葡萄糖1～2％，淀粉2～4％，玉米浆3～7％及少量的微量元素，其余为水，单位为重量百分数，PH6.0～6.4。
在发酵时，采用普通发酵罐，将二级种通过无菌移种管道接入发酵罐中，温度24～30℃，风量1∶1.5，在400～600转/分搅拌的情况下，发酵96～120小时，在发酵至48小时时加入一些胺类或杂环类氮化合物抑制番茄红素的环化。
胺类或杂环类氮化合物为砒啶或咪唑或烟碱或其衍生物类代谢阻断剂。
发酵用的培养基为淀粉2～4％，豆饼粉2～4％，玉米浆3～7％及少量的微量元素，其余为水，单位重量百分数，PH6.4～6.7。
在提取时，先收集菌体采用离心或板框压滤技术收集湿菌体，湿菌体经70～80℃加热真空干燥，获得富含天然番茄红素的干菌粉，再利用萃取剂萃取按萃取剂与干菌粉之比为1∶10的比例进行回流萃取；然后结晶。
所述萃取剂为植物油或有机溶剂。
所述有机溶剂为6#溶剂油或丙酮或乙醚或石油醚或环己烷或正己烷或二硫化碳或乙酸乙酯。
将萃取浓缩液加入1倍体积的乙醇，置于0～10℃、经24小时析出含40％番茄红素的结晶粗品，将所得的粗品用氯仿溶解过滤后，加入2倍体积无水乙醇，在0～10℃的温度下重结晶，得到含量在60～70％以上的番茄红素纯品，经多次重结晶得到含量在90％以上的番茄红素精品。
一级种采用摇瓶培养；二级种培养及发酵工序均采用普通生物反应器。
本发明的优点是1.创造一种生产番茄红素的新方法——发酵生产番茄红素。
2.克服了普通搅拌罐在发酵过程中搅拌轴对菌丝产生的剪切力，造成菌丝的断裂、菌体自溶，发酵无法进行的弊端。
3.克服了丝状真菌高粘度发酵时，由于氧的传递与利用困难导致产量极低的弊端。
4.采用普通搅拌罐对高粘度的丝状真菌进行发酵，不仅大大降低了生产成本，也扩大了该项技术的推广及应用的范围。
5.本发明采用摇瓶一级种，接罐进行二级种的扩大培养后，再接入发酵罐中进行发酵生产番茄红素的生产工艺，一方面减少了生产设备；另一方面缩短了发酵时间，降低了发酵过程中的能耗和生产成本；提高了设备的利用率。
具体实施例方式
实例1采用30升普通搅拌罐发酵制备天然番茄红素1.一级种培养基为葡萄糖1％，淀粉3％，玉米浆7％及少量的微量元素硫酸镁，其余为水，单位均为重量百分数，PH6.0，将保藏能合成番茄红素的斜面三孢布拉霉两性菌种，分别接入装有种子培养基的250m升三角烧瓶中，在24℃、160转/分的条件下，进行振荡培养48小时。
2.二级种培养基为葡萄糖2％，淀粉4％，玉米浆3％及少量的微量元素磷酸二氢钾，PH6.0，其余为水，单位为重量百分数，将培养好的一级种按(+)/(-)＝1∶1的比例混合，1％的种量接入装有种子培养基的1000m升三角烧瓶中，在24℃、160转/分的条件下，进行振荡培养48小时。
3.发酵发酵培养基淀粉2％，豆饼粉2％，玉米浆7％及少量的微量元素磷酸二氢钾，其余为水，单位为重量百分数，PH6.4，发酵罐为30升的普通搅拌罐，装20升培养基，120℃灭菌40分钟，按10％的种量接入已培养好的二级种，罐压0.05兆帕，通风量1∶1，温度24℃，搅拌转速400转/分，发酵120小时。在发酵至48小时时加入砒啶或其衍生物类代谢阻断剂。
4.提取发酵液离心收集湿菌体，70℃真空干燥，得干菌粉900克。干菌粉用10升乙酸乙酯进行萃取，萃取液减压浓缩后，加入无水乙醇进行冷冻结晶，2000转/分离心收集粗结晶35.64克。将此粗品用5升氯仿溶解，并用砂芯漏斗过滤，加入2倍滤液体积的无水乙醇，冷冻结晶24小时，4000转/分离心收集得到含有85％的番茄红素纯品13.42克。
实例2.采用50升普通搅拌罐发酵制备天然番茄红素1.一级种培养基为葡萄糖2％，淀粉4％，玉米浆3％及少量的微量元素硫酸镁，其余为水，单位为重量百分数，PH6.4，将保藏能代谢产生番茄红素的斜面三孢布拉霉两性菌种，分别接入装有种子培养基的250m升三角烧瓶中，在30℃、180转/分的条件下，进行振荡培养44小时。
2.二级种培养基为葡萄糖1％，淀粉2％，玉米浆7％及少量的微量元素硫酸镁，其余为水，单位为重量百分数，PH6.4，将培养好的一级种按(+)/(-)＝1∶1的比例混合，5％的种量接入10升种子罐中。种子罐中培养基装量7升，120℃灭菌30分钟，在30℃、搅拌转速170转/分，通风量1∶1，罐压0.05兆帕的条件下，进行搅拌培养44小时。
3.发酵发酵培养基淀粉3％，豆饼粉4％，玉米浆3％及少量的微量元素硫酸镁，其余为水，单位为重量百分数，PH6.7，发酵罐为50升的普通搅拌罐，装35升培养基，120℃灭菌40分钟，按15％的种量接入已培养好的二级种，罐压0.05兆帕，通风量1∶1.5，温度30℃，搅拌转速600转/分，发酵96小时。在发酵至48小时时加入咪唑或其衍生物类代谢阻断剂。
4.提取同实例1。发酵液离心收集湿菌体，80℃真空干燥，得干菌粉1470克。干菌粉用15升石油醚进行回流萃取，萃取液减压浓缩后，加入无水乙醇在10℃条件下结晶，2000转/分离心收集粗结晶58.22克。将此粗品用10升氯仿溶解，并用砂芯漏斗过滤，加入2倍滤液体积的无水乙醇，冷冻结晶24小时，4000转/分离心收集得到含有85％的番茄红素纯品21.93克。
实例3米用30升普通搅拌罐发酵制备天然番茄红素1.一级种培养基为葡萄糖1.5％，淀粉2％，玉米浆5％及少量的微量元素磷酸二氢钾，其余为水，单位均为重量百分数，PH6.2，将保藏能合成番茄红素的斜面三孢布拉霉两性菌种，分别接入装有种子培养基的250毫升三角烧瓶中，在27℃、170转/分的条件下，进行振荡培养46小时。
2.二级种培养基为葡萄糖1.5％，淀粉3％，玉米浆5％及少量的微量元素磷酸二氢钾，PH6.2，其余为水，单位为重量百分数，将培养好的一级种按(+)/(-)＝1∶1的比例混合，3％的种量接入装有种子培养基的1000毫升三角烧瓶中，在26℃、180转/分的条件下，进行振荡培养46小时。
3.发酵发酵培养基淀粉3％，豆饼粉3％，玉米浆5％及少量的微量元素磷酸二氢钾，其余为水，单位为重量百分数，PH6.5，发酵罐为30升的普通搅拌罐，装20升培养基，120℃灭菌40分钟，按12％的种量接入已培养好的二级种，罐压0.05兆帕，通风量1∶1，温度28℃，搅拌转速500转/分，发酵110小时。在发酵至48小时加入烟碱或其衍生物类代谢阻断剂。
4.提取发酵液离心收集湿菌体，75℃真空干燥，得干菌粉900克。干菌粉用10升丙酮进行萃取，萃取液减压浓缩后，加入无水乙醇进行冷冻结晶，3000转/分离心收集粗结晶35.64克。将此粗品用5升氯仿溶解，并用砂芯漏斗过滤，加入2倍滤液体积的无水乙醇，冷冻结晶24小时，4000转/分离心收集得到含有85％的番茄红素纯品13.42克。
实例4采用30升普通搅拌罐发酵制备天然番茄红素1.一级种培养基为葡萄糖2％，淀粉2％，玉米浆6％及少量的微量元素磷酸二氢钾，其余为水，单位均为重量百分数，PH6.3，将保藏能合成番茄红素的斜面三孢布拉霉两性菌种，分别接入装有种子培养基的250m升三角烧瓶中，在26℃、165转/分的条件下，进行振荡培养47小时。
2.二级种培养基为葡萄糖2％，淀粉4％，玉米浆4％及少量的微量元素磷酸二氢钾，PH6.1，其余为水，单位为重量百分数，将培养好的一级种按(+)/(-)＝1∶1的比例混合，4％的种量接入装有种子培养基的1000m升三角烧瓶中，在28℃、175转/分的条件下，进行振荡培养45小时。
3.发酵发酵培养基淀粉4％，豆饼粉4％，玉米浆7％及少量的微量元素磷酸二氢钾，其余为水，单位为重量百分数，PH6.4，发酵罐为30升的普通搅拌罐，装20升培养基，120℃灭菌40分钟，按14％的种量接入已培养好的二级种，罐压0.05兆帕，通风量1∶1.2，温度25℃，搅拌转速550转/分，发酵110小时。在发酵至48小时时加入砒啶。
4.提取发酵液离心收集湿菌体，78℃真空干燥，得干菌粉900克。干菌粉用10升植物油或6#溶剂油进行萃取，萃取液减压浓缩后，加入无水乙醇进行冷冻结晶，3500转/分离心收集粗结晶35.64克。将此粗品用5升氯仿溶解，并用砂芯漏斗过滤，加入2倍滤液体积的无水乙醇，冷冻结晶24小时，4000转/分离心收集得到含有85％的番茄红素纯品13.42克。
权利要求
1.一种发酵制备天然番茄红素的工艺，包括a.一级种培养；b.二级种培养；c.发酵；d.提取，其特征是一级种的培养时，将保藏在土豆葡萄糖琼脂培养基斜面上能代谢产生番茄红素的三孢布拉霉两性菌种，分别接入装有种子培养基的三角烧瓶中，在24～30℃、160～180转/分钟条件下，进行振荡培养44～48小时；在二级种的培养特时，将分别培养好的三孢布拉霉两性菌种的一级种按1∶1的比例混合后，接入种子罐内进行扩大培养，作为发酵用的种子，培养条件为温度24～30℃，通风量1∶1，培养时间为24～48小时。
2.根据权利要求1所述的发酵制备天然番茄红素的工艺，其特征是一级种与二级种的种子培养基为葡萄糖1～2％，淀粉2～4％，玉米浆3～7％及少量的微量元素，其余为水，单位为重量百分数，PH6.0～6.4。
3.根据权利要求1所述的发酵制备天然番茄红素的工艺，其特征是在发酵时，采用普通发酵罐，将二级种通过无菌移种管道接入发酵罐中，温度24～30℃，风量1∶1.5，在400～600转/分搅拌的情况下，发酵96～120小时，在发酵至48小时时加入一些胺类或杂环类氮化合物抑制番茄红素的环化。
4.根据权利要求3所述的发酵制备天然番茄红素的工艺，其特征是胺类或杂环类氮化合物为砒啶或咪唑或烟碱或其衍生物类代谢阻断剂。
5.根据权利要求1所述的发酵制备天然番茄红素的工艺，其特征是发酵用的培养基为淀粉24％，豆饼粉2～4％，玉米浆3～7％及少量的微量元素，其余为水，单位重量百分数，PH6.4～6.7。
6.根据权利要求1所述的发酵制备天然番茄红素的工艺，其特征是在提取时，先收集菌体采用离心或板框压滤技术收集湿菌体，湿菌体经70～80℃加热真空干燥，获得富含天然番茄红素的干菌粉，再利用萃取剂萃取按萃取剂与干菌粉之比为1∶10的比例进行回流萃取；然后结晶。
7.根据权利要求6所述的发酵制备天然番茄红素的工艺，其特征是萃取剂为植物油或有机溶剂。
8.根据权利要求7所述的发酵制备天然番茄红素的工艺，其特征是有机溶剂为6#溶剂油或丙酮或乙醚或石油醚或环己烷或正己烷或二硫化碳或乙酸乙酯。
9.根据权利要求7所述的发酵制备天然番茄红素的工艺，其特征是将萃取浓缩液加入1倍体积的乙醇，置于0～10℃、经24小时析出含40％番茄红素的结晶粗品，将所得的粗品用氯仿溶解过滤后，加入2倍体积无水乙醇，在0～10℃的温度下重结晶，得到含量在60～70％以上的番茄红素纯品，经多次重结晶得到含量在90％以上的番茄红素精品。
10.根据权利要求1所述的发酵制备天然番茄红素的工艺，其特征是一级种采用摇瓶培养；二级种培养及发酵工序均采用普通生物反应器。
全文摘要
本发明涉及类胡萝卜素的制备方法，尤其是指一种采用丝状真菌三孢布拉霉进行发酵制备天然番茄红素的工艺。本方法包括a.一级种培养；b.二级种培养；c.发酵；d.提取，其特征是一级种培养时，将保藏在土豆葡萄糖琼脂培养基斜面上能代谢产生番茄红素的三孢布拉霉两性菌种，分别接入装有种子培养基的三角烧瓶中，在24～30℃、160～180转/分钟条件下，进行振荡培养44～48小时；在二级种的培养特时，将分别培养好的三孢布拉霉两性菌种的一级种按1∶1的比例混合后，接入种子罐内进行扩大培养，作为发酵用的种子，培养条件为温度24～30℃，通风量1∶1，培养时间为24～48小时。本方法工艺简单，生产成本低，对环境无污染，适合于大规模工业化生产。
文档编号C12P5/00GK1528906SQ0313507
公开日2004年9月15日 申请日期2003年9月30日 优先权日2003年9月30日
发明者单志萍, 孟妤, 陆茂林, 胡幼敏 申请人:江苏省微生物研究所