专利名称：适应全悬浮无血清培养的mdck细胞系及其在培养流感病毒、生产流感病毒疫苗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种MDCK细胞系及其应用，特别涉及一种适应全悬浮无血清培养的MDCK细胞系及其在培养流感病毒、生产流感疫苗中的应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术：
流感病毒疫苗的制备经过了从动物组织器官到细胞培养的规模化发展过程，动物流感病毒的培养也经历了从鸡胚向哺乳细胞大规模培养，从哺乳动物细胞的微载体悬浮培养到全悬浮培养，从动物源血清的培养到无动物源血清或成分的培养的发展过程，并结合 离心纯化以及柱层析纯化，使动物流感病毒或抗原生产方法的可控性提高，也减少了疫苗注射引起的应急反应。从采用的培养基上看，无动物源血清或成分的培养基使得在病毒培养或疫苗生产中遭受外源污染的风险降低。尽管这样，常用的用于培养流感病毒的细胞系仍存在各种缺点，因此仍无法满足目前生产流感病毒疫苗的需求，例如MDCK具有致癌性，Vero, PER-C6的病毒产量较低。因此研究一种安全，高产的细胞基质将是现行流感疫苗工艺研究的重要问题。
发明内容
本发明提供了一株适应全悬浮无血清培养的MDCK细胞系，还提供了利用所述的细胞系培养流感病毒的方法。具体的，本发明采用了以下技术手段本发明的一株适应全悬浮无血清培养的MDCK细胞系，命名为MDCK-ZL2012，分类命名为狗肾细胞，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 6210，保藏日期为2012年6月14日。本发明还提供了所述的MDCK细胞系在培养流感病毒和生产流感病毒疫苗中的应用。本发明的一种培养流感病毒的方法，其特征在于包括以下步骤(I)将所述的MDCK细胞系接种于无血清培养基中进行悬浮培养，得到MDCK细胞悬浮培养液；(2)当MDCK细胞悬浮培养液中的细胞密度达到I. OX IO6 7. OX IO7个/ml时，按照MOI O. 01-0. I接种流感病毒；(3)病毒液在32°C培养3-4天收获病毒上清液，即得流感病毒液。在本发明中的一种培养流感病毒的方法中，其特征在于所述的流感病毒为人流感病毒、马流感病毒、禽流感病毒、猪流感病毒或犬流感病毒。与现有技术相比，本发明的有益之处在于I、本发明的一种适应全悬浮培养的细胞系能够在无其它任何载体的情况下实现细胞的悬浮培养，因此实现了细胞培养密度的最大化，也减少了细胞培养的体积，减少了后续处理的劳动强度，使得各个细胞的产能等同或高出一般的贴壁培养，故而使生产流感病毒的效率提闻，减少了时间和成本。2、本发明的一种细胞系能够在无动物源性的血清或成分的培养基中生长，因而降低了培养动物流感病毒时的外源因子污染的风险和在疫苗使用引起的应急反应，也使后续病毒处理如澄清、微滤、超滤、纯化等步骤更加简单易行，减少了工作量，更易纯化。
图I为MDCK-ZL2012的细胞生长曲线图；图2为不同感染复数接种流感病毒后流感病毒复制的情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本实施例涉及的材料来源I、细胞MDCK细胞购自ATCC ；2、病毒禽流感病毒H5N2、禽流感病毒H1N1，A/盐山/01/2012H5N1、A/唐山/02/2012，H5N1A/邢台/03/2012购自中国疾病控制中心病毒病控制所。培养基MEM HAM和F12培养基购买自Invitogen公司，酵母或豆类提取物购买自Invitogen 公司实施例I适应全悬浮无血清培养的MDCK细胞系的制备I、MDCK细胞在无血清或无动物源性的成分的培养基进行适应和驯化，培养基是MEM HAM和F12培养基的混合物，其中加入I. 5g/L Na2CO3无机盐以及4. Og/L (O. 5_8g/L都可)的酵母或豆类提取物。2、MDCK细胞以方瓶、转瓶按照1:4或1:6的方式扩大培养，37°C培养5飞天，氧饱和度20%ο3、传代2-4代，得到明显适应无血清培养的MDCK细胞，用O. 25%胰蛋白酶+0. 02%的EDTA在室温消化分散。4、分散后的MDCK细胞生长推迟，代次周期延至7_9天，传至30_50代次细胞趋于稳定，细胞生长曲线如图I所示。5、生物反应器中细胞培养密度的测定(个/ml)。用胰酶消化细胞培养液并用细胞计数器对细胞密度进行测定，实验共进行了 3次，其结果如表I所示表I全悬浮细胞培养密度的测定
权利要求
1.一株适应全悬浮无血清培养的MDCK细胞系，命名为MDCK-ZL2012，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 6210。
2.权利要求I所述的MDCK细胞系在培养流感病毒中的应用。
3.权利要求I所述的MDCK细胞系在生产流感病毒疫苗中的应用。
4.一种培养流感病毒的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)将权利要求I所述的MDCK细胞系接种于无血清培养基中进行悬浮培养，得到MDCK细胞悬浮培养液；(2)当MDCK细胞悬浮培养液中的细胞密度达到I.OX IO6 7. OX IO7个/ml时，按照MOIO.01-0. I接种流感病毒； (3)病毒液在32°C培养3-4天收获病毒上清液，即得流感病毒液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的流感病毒为人流感病毒、马流感病毒、禽流感病毒、猪流感病毒或犬流感病毒。
全文摘要
本发明公开了一株适应全悬浮培养的MDCK细胞系及其在培养流感病毒、生产流感病毒疫苗中的应用，属于生物技术领域。本发明的一株适应全悬浮培养的MDCK细胞系，命名为MDCK-ZL2012，其菌种保藏编号为CGMCC No.6210。本发明还提供了利用所述的细胞系培养流感病毒的方法。本发明所提供的MDCK细胞系实现了MDCK细胞在无血清培养基中的全悬浮培养，因而采用本发明的MDCK细胞系进行流感病毒的培养，一方面增加了流感抗原病毒的产量，降低了流感病毒生产的成本，另一方面也降低了培养流感病毒时的外源因子污染的风险和在疫苗使用引起的应急反应，也使后续病毒处理如澄清、微滤、超滤、纯化等步骤更加简单易行。
文档编号C12N7/00GK102816732SQ20121022440
公开日2012年12月12日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者张澍, 吕宏亮 申请人:北京健翔和牧生物科技有限公司, 山西隆克尔生物制药有限公司