一种绿色荧光蛋白基因标记鳢源舒伯特气单胞菌的方法与流程

本发明涉及生物监测领域，特别是指一种绿色荧光蛋白基因标记鳢源舒伯特气单胞菌的方法。

背景技术：

鳢科鱼类(Channidae)是我国重要的淡水经济鱼类，在我国分布广泛，其肉质细嫩，味道鲜美，具有较高的营养价值，其中斑鳢(Channa maculata)和乌鳢(Channa argus)和以斑鳢为母本，乌鳢为父本杂交获得杂交鳢(Channa maculata♀×C.argus♂)均是我国重要的养殖品种，也是我国外贸出口的重要淡水经济鱼类。随着我国池塘鳢科鱼类高密度养殖的发展，养殖鳢科鱼类病害的问题越来越严重，导致鳢科鱼类发病病原包括嗜水气单胞菌、诺卡氏菌、舒伯特气单胞菌等。鳢内脏类结节病是近年来新暴发的鳢科鱼类细菌性病，该病的特点是病鱼体表无明显变化，肝、脾、肾等内脏组织出现白色类结节症状，死亡率可达45％以上，通过分离鉴定确定该病的致病菌为舒伯特气单胞菌。自2009年首次报道以来，鳢内脏类结节病在全国范围内均有发生，近几年该病导致湖北省养殖乌鳢、广东省养殖斑鳢和杂交鳢大面积死亡，造成严重的经济损失。目前国内外还没有鳢源舒伯特气单胞菌致病机理研究报道较少。而研究细菌致病机理不可避免地要涉及细菌与宿主之间的关系。使用标记基因是检测细菌在宿主内生长、繁殖及其与宿主相互作用关系的有效手段。

技术实现要素：

本发明提出一种绿色荧光蛋白基因标记鳢源舒伯特气单胞菌的方法，简单直观。

本发明的技术方案是这样实现的：一种绿色荧光蛋白基因标记鳢源舒伯特气单胞菌的方法，包括以下步骤：

(1)分离出鳢源舒伯特气单胞菌：

(2)制备启动子片段：启动子(SEQ ID NO:1)以质粒PRUAL为模板，引物：

ppS：5'CGCCTAGGATACGCACACCGTGGAAAC3'，

ppA：5'CCTTGCTCACCATTTTTTCTTCCTCCA3'，PCR扩增后产物进行电泳以及胶回收；

(3)制备GFP片段：绿色荧光蛋白GFP(SEQ ID NO:2)以质粒PEGFP-N3为模板，引物序列为：

GFPS：5'AGGAAGAAAAA ATGGTGAGCAAGGGCGA3'，

GFPA：5'CGTTCGAA TTACTTGTACAGCTCGTCCA3’；PCR扩增后产物进行电泳以及胶回收；

(4)启动子与GFP连接：将步骤(2)中回收的启动子与步骤(3)中回收的GFP混合作为模板，进行PCR，电泳后进行胶回收；

(5)PCR产物的T/A连接、转化与鉴定：将步骤(4)中纯化的PCR产物与pMD18-T Vector克隆载体(购买自TaKaRa公司)进行连接，转化后进行扩增，并测序鉴定得到的pMDGFP；

(6)制备鳢源舒伯特气单胞菌感受态；

(7)载体pMDGFP的获取、连接与转化：提取测序鉴定正确菌株的质粒pMDGFP，使用电转法转入到制备的鳢源舒伯特气单胞菌感受态中；

(8)荧光菌株观察。

进一步，步骤(4)中，启动子与GFP按照1:1进行混合，并以ppS、GFPA作为上下游引物。

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)能够自身催化形成发色结构并在蓝光激发下发出绿色荧光。作为报告基因，GFP是不需要外源底物或辅助因子，就能在活细胞中表达的发光蛋白，GFP作为荧光标记分子既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害，因此可实现在体内实时检测标记菌株的情况，能很好地进行菌体跟踪研究。本研究建立了GFP标记的鳢源舒伯特气单胞菌强毒株，便于以后通过荧光显微镜观察鳢源舒伯特气单胞菌侵染宿主的动态过程,为研究鳢源舒伯特气单胞菌与宿主的相互作用关系奠定基础。

本发明的所述绿色荧光蛋白基因标记鳢源舒伯特气单胞菌的方法，通过巧妙的引物设计，实现了pMDGFP的制备，并转入到制备的鳢源舒伯特气单胞菌感受态中，实现荧光菌株观察，方法简便直观，极大的降低了实验的成本，同时，质量的稳定性也非常高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中得到的pMDGFP质粒示意图；

图2为本发明中显微镜下观察的荧光蛋白。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种绿色荧光蛋白基因标记鳢源舒伯特气单胞菌的方法，包括以下步骤：

(1)分离出鳢源舒伯特气单胞菌：

(2)制备启动子片段：

按照常规方法进行PCR反应。模板为质粒PRUAL(SEQ NO:1)，上下游引物分别为ppS、ppA。PCR反应体系见表1，PCR反应条件见表2，PCR产物经1％琼脂糖电泳后用Gel Extraction Kit进行胶回收：

ppS：5'CGCCTAGGATACGCACACCGTGGAAAC3'，

ppA：5'CCTTGCTCACCATTTTTTCTTCCTCCA3'。

(3)制备GFP片段：

按照常规方法进行PCR反应。模板为质粒PEGFP-N3(SEQ NO:2)，上下游引物分别为GFPS、GFPA。PCR反应体系见表1，PCR反应条件见表2。PCR产物经1％琼脂糖电泳后用Gel Extraction Kit进行胶回收：

GFPS：5'AGGAAGAAAAAATGGTGAGCAAGGGCGA3'，

GFPA：5'CGTTCGAA TTACTTGTACAGCTCGTCCA3’。

(4)启动子与GFP连接：

由于设计时引物ppA和GFPS有一段重复序列，因而它们的PCR扩增启动子片段和GFP片段也有一段重复序列，这样便于用PCR方法连接启动子和GFP片段。以回收的启动子和GFP片段1：1混合作为模板，ppS、GFPA作为上下游引物进行PCR，PCR反应体系见表1，PCR反应条件见表2。PCR产物经1％琼脂糖电泳后用Gel Extraction Kit进行胶回收。

(5)PCR产物的T/A连接、转化与鉴定：

将步骤(4)纯化的PCR产物与pMD18-T Vector克隆载体进行连接，连接体系见表3。16℃连接过夜。常规方法转化感受态大肠杆菌DH5α,涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板(含氨苄青霉素50μg/mL)上,37℃孵箱培养16h。挑取阳性克隆,扩增培养,经PCR鉴定的重组质粒pMDGFP进行测序鉴定。

(6)制备鳢源舒伯特气单胞菌感受态：方法如下：

(a)接种WL-2菌到BHI液体培养基中，28℃，280rpm摇床培养过夜

(b)按1:500的量转接到含500ml BHI液体培养基中，280rpm，2.5-3.5h，培养至OD600为0.6；

(c)立刻置冰水浴中骤冷：可以选择在一个大的装有冰水混合物的容器，放在摇床上快速旋转摇动，尽快使培养物温度降下来；

(d)随后在250ml预冷的离心杯中离心，4℃，4000rpm，30min；

(e)弃上清后，用预冷的灭菌双蒸水洗：先加少量水悬浮菌体，菌体悬浮后再把水加至500mL，4000rpm，20min，弃上清；

(f)再用10％的预冷甘油500mL洗1次，4000rpm，20min；将两个离心管中的细菌混合，10％的预冷甘油100mL洗1次，4000rpm，20min

(g)最后一次倒尽甘油后(尽量去干净)，加1mL甘油悬浮细胞，每80μl分装到1.5mL EP管(EP管要-80度预冷)，-80℃保存备用。

(7)载体pMDGFP的获取、连接与转化：

提取测序鉴定正确菌株的质粒pMDGFP，使用电转法转入到制备的鳢源舒伯特气单胞菌感受态中。电转化方法如下：

(A)从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；

(B)取1μl纯化后的质粒(200ng)于1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。

(C)将80ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。

(D)打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。

(E)将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；

(F)将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1ml的BHI液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。

(G)37℃，220－250rpm复苏1小时。

(H)取200μl转化产物涂布于含氨苄青霉素的BHI琼脂平板(含氨苄青霉素50μg/mL)，放于28℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。

通过上述方法构建质粒的图谱如图1所示，重组质粒的序列、启动子序列、pMDGFP序列见SEQ ID NO:3所示：

表1PCR扩增体系

表2PCR扩增程序

表3连接体系

(8)荧光菌株观察。

构建好的菌株用无菌水稀释后涂到载玻片上，使用荧光显微镜，在40×10的放大倍数下观察，能稳定高效的表达绿色荧光蛋白，如图2。

构建了pMDGFP重组载体,并导入到舒伯特气单胞菌强毒株WL-2中。在荧光显微镜下观察,菌体呈现绿色荧光。稳定性试验表明,WL2GFP传至30代,质粒稳定率可达100％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。