一种猪等孢球虫qRT‑PCR定量检测构建方法与流程

本发明涉及生物基因工程技术领域，更具体的说，涉及一种猪等孢球虫qrt-pcr定量检测构建方法。

背景技术：

我国的母猪存栏量占全球50％以上，稳居全球第一位，是全球最大的养猪市场和猪肉消费市场，猪球虫病可引起仔猪严重腹泻甚至死亡，其仔猪发病率可高达50％，死亡率高达75％以上，严重危害养猪业发展，目前对该病的检测诊断主要为传统的镜检及普通pcr方法，误差较大，且不能精确定量分析，易造成猪球虫病发生的错误风险评估，因此建立新型的猪球虫病定量检测方法将为猪球虫病爆发风险评估提供理论依据，对养猪业的发展具有重要意义。猪等孢球虫病是引起仔猪严重腹泻甚至死亡的原虫病，目前对该病的检测主要为传统镜检及普通pcr方法，误差较大，且不能精确定量分析，易造成猪球虫病发生的错误风险评估。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种猪等孢球虫qrt-pcr定量检测构建方法，该方法利用在前期研究中克隆获得is-its2序列，拟以猪等孢球虫为研究对象，建立实时荧光定量pcr(qrealtimepcr,qrt-pcr)检测方法，检测临床样品评价应用效果，预期结果为猪球虫病爆发风险评估提供理论依据。

本发明所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现。

一种猪等孢球虫qrt-pcr定量检测构建方法，它包括：

步骤一，构建markergene-pmd18-t质粒：利用全长为3957bp的is-hn18srrna-its1-5.8s-its2-28s基因序列，对基因序列进行生物信息学分析确定全长为433bp的its2基因序列为猪等孢球虫所特有的核糖体rna基因序列，选择its2基因为markergene，以前期所构建的is-hn18srrna-its1-5.8s-its2-28s-pmd18-t质粒为模板，对is-hnits2基因进行pcr扩增，同时以ddh2o为模板作为阴性对照。配制50μlpcr反应体系(2×taqpcrmastermix:25μl；上游引物:5’-tgtctctgaagtgtcaagttctgtc-3’,下游引物:5’-ttaagttcagcgggtaatctcg-3’各0.5μl，终浓度为1μm；质粒模板1μl；添加ddh2o至50μl)；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，72℃延伸10min，35个循环，取pcr反应产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，阳性产物经胶回收试剂盒纯化回收，产物连接至pmd18-t载体，再将连接产物转化入e.colidh5α感受态细胞，挑取转化子进行菌落pcr鉴定，阳性菌进行测序，测序正确后提取质粒，并测定浓度保存待用。

步骤二，筛选及优化qrt-pcr引物及探针：根据测序is-its2基因序列，设计qrt-pcr引物及探针，摸索引物浓度，将引物分别稀释成终浓度为50nm、100nm、150nm、200nm和400nm，分别进行pcr扩增，pcr反应条件为：95℃30秒，以下共进行40循环(95℃15sec，60℃15sec，72℃30sec)，16℃终止反应。使用3％的琼脂糖电泳检测pcr产物；将探针分别稀释成终浓度为50nm、100nm、200nm和400nm，分别进行qrt-pcr，pcr反应条件为：program1(预变性)：95℃30sec，1cycle；program2(扩增程序)：95℃5sec，60℃20sec，40cycles。

步骤三，建立标准曲线：根据质粒浓度10倍梯度稀释，分别稀释为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl及0.001ng/μl，按照步骤二qrt-pcr反应体系及程序分别进行qrt-pcr扩增，建立质粒标准曲线。

步骤四，敏感性检验：对实验室所保存纯净isosporasuis卵囊进行计数，分别稀释成1000个/ml、100个/ml、10个/ml和1个/ml，分别提取基因组dna，以此为模板，按照步骤二qrt-pcr反应体系及程序分别进行qrt-pcr扩增。

步骤五，特异性检验：分别以实验室所保存等孢球虫、艾美耳属球虫、弓形虫及隐孢子虫基因组dna为模板，按照步骤二qrt-pcr反应体系及程序分别进行qrt-pcr扩增。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本方法以引起仔猪腹泻的猪等孢球虫为研究对象，利用生物信息学及分子生物学技术扩增获得is-18s-its1-5.8s-its2-28srrna序列，筛选its2基因为目的基因，分别优化扩增引物(100nm)及探针浓度(100nm)，成功建立qrt-pcr定量检测方法，通过敏感性及特异性检验，结果证实该方法可以特异性检测到样品中的单个卵囊，较传统检测方法既可提高检测敏感性，又可做到定量分析的效果，因此该方法的建立将为猪球虫病爆发风险评估提供理论依据，对养猪业的发展具有重要意义。

附图说明

图1为本发明is-hnits2基因的pcr扩增结果示意图；

图2为本发明is-hnits2基因pcr扩增引物浓度筛选结果示意图；

图3为本发明is-hnits2基因qrt-pcr扩增探针浓度筛选结果示意图；

图4为本发明is-hnits2基因qrt-pcr标准曲线的建立结果；

图5为本发明is-hnits2基因qrt-pcr扩增敏感性检验结果(1-1000个卵囊)；

图6为本发明is-hnits2基因qrt-pcr扩增特异性检测结果(仅等孢球虫呈阳性扩增)。

具体实施方式

为了使发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

如图1～图6所示，一种猪等孢球虫qrt-pcr定量检测构建方法，其特征在于：它包括：

步骤一，构建markergene-pmd18-t质粒：利用全长为3957bp的is-hn18srrna-its1-5.8s-its2-28s基因序列，对基因序列进行生物信息学分析确定全长为433bp的its2基因序列为猪等孢球虫所特有的核糖体rna基因序列，选择its2基因为markergene，以前期所构建的is-hn18srrna-its1-5.8s-its2-28s-pmd18-t质粒为模板，对is-hnits2基因进行pcr扩增，同时以ddh2o为模板作为阴性对照。配制50μlpcr反应体系(2×taqpcrmastermix:25μl；上游引物:5’-tgtctctgaagtgtcaagttctgtc-3’,下游引物:5’-ttaagttcagcgggtaatctcg-3’各0.5μl，终浓度为1μm；质粒模板1μl；添加ddh2o至50μl)；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，72℃延伸10min，35个循环，取pcr反应产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，阳性产物经胶回收试剂盒纯化回收，产物连接至pmd18-t载体，再将连接产物转化入e.colidh5α感受态细胞，挑取转化子进行菌落pcr鉴定，阳性菌进行测序，测序正确后提取质粒，并测定浓度保存待用。

步骤二，筛选及优化qrt-pcr引物及探针：根据测序is-its2基因序列，设计qrt-pcr引物及探针，摸索引物浓度，将引物分别稀释成终浓度为50nm、100nm、150nm、200nm和400nm，分别进行pcr扩增，pcr反应条件为：95℃30秒，以下共进行40循环(95℃15sec，60℃15sec，72℃30sec)，16℃终止反应。使用3％的琼脂糖电泳检测pcr产物；将探针分别稀释成终浓度为50nm、100nm、200nm和400nm，分别进行qrt-pcr，pcr反应条件为：program1(预变性)：95℃30sec，1cycle；program2(扩增程序)：95℃5sec，60℃20sec，40cycles。

步骤三，建立标准曲线：根据质粒浓度10倍梯度稀释，分别稀释为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl及0.001ng/μl，按照步骤二qrt-pcr反应体系及程序分别进行qrt-pcr扩增，建立质粒标准曲线。

步骤四，敏感性检验：对实验室所保存纯净isosporasuis卵囊进行计数，分别稀释成1000个/ml、100个/ml、10个/ml和1个/ml，分别提取基因组dna，以此为模板，按照步骤二qrt-pcr反应体系及程序分别进行qrt-pcr扩增。

步骤五，特异性检验：分别以实验室所保存等孢球虫、艾美耳属球虫、弓形虫及隐孢子虫基因组dna为模板，按照步骤二qrt-pcr反应体系及程序分别进行qrt-pcr扩增。

其中步骤二中的qrt-pcr引物及探针的设计，如表1。

表1qrt-pcr引物及探针

步骤二中的pcr扩增的pcr反应体系如表2。

表2引物筛选pcr反应体系(单位：μl)

步骤二中的qrt-pcr，pcr反应体系如表3。

表3探针筛选qrt-pcr反应体系(单位：μl)

经过生物信息学分析，筛选is-hnits2基因作为qrt-pcr检测的marker基因，结果成功构建is-hnits2-pmd18-t质粒，测序正确，所提取质粒浓度为127ng/μl，is-hnits2pcr结果见图1(图中m.dl2000marker；1.阴性对照；2,3.is-hnits2基因pcr扩增产物)，此为markergene-pmd18-t质粒的构建结果。

为获得高效、特异的pcr引物，本研究通过普通pcr预实验筛选合适的引物。以质粒为模板，梯度稀释的引物进行pcr扩增。电泳结果表明，当引物终浓度为100nm时，扩增is-hnits2基因所得条带无非特异扩增，无引物二聚体，适合作为qrt-pcr的引物，如图2(图中m.dl1000marker；1.阴性对照；7.阳性对照，2-6.引物浓度分别为：50nm、100nm、150nm、200nm和400nm)；探针终浓度为100nm时，qrt-pcr扩增is-hnits2基因可以获得单一平滑曲线，为最佳浓度，如图3(图中1-4.引物浓度分别为：50nm、100nm、200nm和400nm)，此为qrt-pcr引物及探针的筛选及优化结果。

将模板稀释成一系列浓度梯度进行qrt-pcr反应，结果扩增曲线平滑，随着模板浓度的降低，ct值呈递减的线性关系，说明在此浓度范围内，反应体系稳定，引物浓度、探针浓度适合，且保持稳定高效的扩增效率，适合模板浓度标准的制定，如图4，此为标准曲线的建立结果。

分别对不同浓度的dna模板(1、10、100和1000个卵囊)进行qrt-pcr扩增，结果发现该方法可检测到样品中单个卵囊，敏感性好，如图5，此为敏感性检测结果。

分别以实验室所保存等孢球虫、艾美耳属球虫、弓形虫及隐孢子虫基因组dna为模板，利用本研究所建立qrt-pcr方法进行定量检测，结果发现仅等孢球虫可扩增出目的片段，说明本方法可以特异检测等孢球虫，扩增结果如图6，此为特异性检测结果。

本方法以引起仔猪腹泻的猪等孢球虫为研究对象，利用生物信息学及分子生物学技术扩增获得is-18s-its1-5.8s-its2-28srrna序列，筛选its2基因为目的基因，分别优化扩增引物(100nm)及探针浓度(100nm)，成功建立qrt-pcr定量检测方法，通过敏感性及特异性检验，结果证实该方法可以特异性检测到样品中的单个卵囊，较传统检测方法：既可提高检测敏感性，又可做到定量分析的效果，因此该方法的建立将为猪球虫病爆发风险评估提供理论依据，对养猪业的发展具有重要意义。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。