人工优化合成的Mat基因与重组载体以及改变作物抗性的方法与流程

本发明涉及一种人工优化合成的mat^#基因(蛋氨酸砜n-乙酰基转移酶基因)，含有该基因的重组载体，以及利用所述含有该基因的重组载体改变作物抗性的方法。

背景技术：

草铵膦(glufosinate)是德国赫斯特(hoechst)公司开发的一种高效、广谱、低毒、低残留的非选择性除草剂，又称为草丁膦(phosphinothricin,ppt)，iupac标准名称：2-氨基-4[羟基(甲基)氧膦基]丁酸(2-amino-4-(hydroxy(methyl)phosphonoyl)butanoicacid)，易溶于水，不易溶于有机溶剂，对光稳定，在ph5～9的水溶液中易水解。草铵膦可通过植物蒸腾作用在木质部进行传导，生效时间长于百草枯、短于草甘膦，高温、高湿、高光强可以增进草铵膦吸收。在田间条件下，由于草铵膦迅速被土壤微生物降解，故根系不能吸收或吸收很少。

市售草铵膦是外消旋混合物，只有l-型具有除草活性，靶标酶是谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase,gs)。谷氨酰胺合成酶存在于所有植物组织中，有2种同工酶：细胞质中的gs1(主要存在非光合作用体系中)和叶绿体中的gs2(主要存在光合作用组织中)。谷氨酰胺合成酶在植物的氨同化及氮代谢调节中起重要作用，它催化无机氮向有机氮的转化反应，该酶同时也是植物中唯一的解毒酶，能够解除由硝酸盐还原、氨基酸降解及光呼吸中释放出的铵的毒性。草铵膦能够特异性地抑制植物的谷氨酰胺合成酶的活性，导致植物体内氮代谢紊乱，过量积累铵，进而使叶绿体解体，光合作用受到抑制，最终导致植物死亡。自转基因作物商业化以来，抗草铵膦作物面积增长迅速，带动了草铵膦销售额的增长。预计到2015年，草铵膦的销量将突破10亿美元，在除草剂中仅次于草甘膦(杨益军，2013)。

截止2015年，已经有6个抗草铵膦基因被发现，其中发现较早的bar和pat基因已经转化作物并应用于商业化种植。datta等(1992)用原生质体转化法将bar基因转入水稻ir72中，获得了对高剂量除草剂草铵膦抗性的水稻植株。christou等(1991)将bar基因导入到多种水稻品种中，田间试验实验结果表明转基因植株对除草剂草丁膦具有明显的抗性。国内相继开展了抗除草剂水稻的研究(朱冰等，1996；刘自刚等，2006)，培育出抗除草剂的杂交稻恢复系752r(张祥喜等，2000)、测64r、明恢63r、特青r(黎垣庆等，2000)、密阳46r(薛石玉等，2001)、9311r(王才林等，2002)和bar68-1(肖国樱等，2006；xiaoetal,2007)等。

蛋氨酸砜n-乙酰基转移酶(methioninesulfonen-acetyltransferase,mat)基因mat于2009年发现，长度为534bp，与其它抗草铵膦基因的同源性为31.55％～58.64％，是一类新的抗草铵膦基因。mat基因表达产物长度为177aa，功能和其他抗草铵膦蛋白类似，具有n-乙酰基转移酶的活性。通过酶动力学研究发现，mat的最适ph为8.0～8.5，而bar基因表达的n-乙酰基转移酶的最适ph约为6.5(yunetal,2009)。

未经密码子优化的mat基因转化的水稻对草铵膦的抗性不强，如在含有不同浓度ppt(0，500，750和1000mg/l)的ms培养基上，转野生型mat基因离体叶片在500mg/l的ms培养基上表现出发黄，与不含mat基因对照相比抗性不显著(yunetal,2009)。

技术实现要素：

本发明的目的是提高水稻对草铵膦的抗性，提供一种人工优化合成的mat^#基因(蛋氨酸砜n-乙酰基转移酶基因)，含有该基因的重组载体，以及利用含有该基因的载体改变作物抗性的方法。

本发明提供了一种mat^#基因，其为密码子优化的mat基因，其中，该mat^#基因的序列含有seqidno.1所示的序列，且该mat^#基因能编码具有n-乙酰基转移酶活性的多肽。

本发明还提供了一种mat^#基因，其为密码子优化的mat基因，其中，该mat^#基因的序列含有信号肽的编码序列和seqidno.1所示的序列，且该mat^#基因能编码n端带有信号肽且具有n-乙酰基转移酶活性的多肽。

本发明还提供了一种mat^#基因，其为密码子优化的mat基因，其中，该mat^#基因的序列含有提高mat^#基因翻译效率的序列、信号肽的编码序列和seqidno.1所示的序列，且该mat^#基因能编码n端带有信号肽且具有n-乙酰基转移酶活性的多肽。

本发明还提供了一种mat^#基因，其为密码子优化的mat基因，其中，该mat^#基因的序列为如上所述的mat^#基因的5’端和3’分别连接上相同或不同的内切酶识别序列后得到。

本发明还提供了一种mat^#基因表达框，其中，该mat^#基因表达框含有如上所述的mat^#基因、在该mat^#基因的5’端上连接有能够被rna聚合酶特异识别和高效结合的启动子和在该mat^#基因的3’端上连接有能够给予rna聚合酶转录终止信号的终止子。

本发明还提供了一种mat^#基因重组载体，其中，该mat^#基因重组载体由如上所述的mat^#基因表达框插入表达载体后得到。

此外，本发明还提供一种改变作物抗性的方法，其中，该方法包括将上述的重组载体转化所述作物，使得到的转基因作物表达mat^#基因、并具有除草剂抗性。

通过上述技术方案，本发明能够使得转基因水稻至少耐受1000mg/l浓度的草铵膦，因此有效地提高了转基因水稻对草铵膦的抗性。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是植物表达载体pc3300-mat^#的构建流程图。

图2是质粒pc3300-mat^#的酶切鉴定图。图中：m1为dl2000分子量标记；1～2泳道为pmd19-t-mat^#酶切产物(xhoⅰ)；3～4泳道为pc3300-mat^#酶切产物(xhoⅰ)；5泳道为pc3300-mat^#质粒；m2为dl15000分子量标记。

图3a是转基因植株中mat^#基因的pcr检测电泳图，图3b是转基因植株中mat^#基因的southern杂交图。图中：图3a中m为dl2000分子量标记；b泳道为空白对照；ck泳道为阴性对照，p泳道为阳性对照；9k-mat泳道为t1代再生植株；1～4泳道为t2代植株；图3b中m泳道为dl15000分子量标记。

图4是t2代转基因植株9k-mat喷洒草铵膦的实验结果。

图5是t2代转基因植株9k-mat种子在含草铵膦培养基上萌发的实验结果。图中：ck为水稻品系9k；9ka2为以9k品系为受体转入bar基因获得的转基因水稻；9k-mat为mat^#基因导入籼稻9k获得的转基因水稻；0mg/l～600mg/l表示培养基中草铵膦的浓度。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供一种mat^#基因，其为密码子优化的mat基因，其中，该mat^#基因具有seqidno.1所示的序列，且该mat^#基因能编码具有n-乙酰基转移酶活性的多肽。

所述mat^#基因按照水稻偏爱密码子的分布原则，置换原mat基因序列(ncbi登录号：ab378291)中的部分稀有密码子，同时消除mat基因中影响该基因在水稻细胞高效表达的碱基序列，优化后获得本发明的mat^#基因序列如seqidno.1所示。

分析发现，原始mat基因中存在1处潜在的内含子切割识别序列，利用同义密码子替换法，消除内含子切割识别序列；原始mat基因gc含量达到65.36％，造成包含多个mrna发夹环结构，起始自由能达到-232.70kcal/mol；在不改变优化基因的氨基酸序列的前提下，利用同义密码子替换法来消除形成的稳定发夹环等mrna二级结构。分析优化后的mat^#基因，密码子的相对使用度(rscu值)如表1中第3列所示，与水稻和原始mat基因序列相比，优化后的mat基因序列的密码子使用频率与模式植物水稻的表达蛋白密码子使用频率基本一致；与原始mat基因相比，mat^#基因mrna二级结构得到优化，起始自由能降到-198.30kcal/mol；同时为了防止dna序列甲基化的可能，降低了密码子gcg、acg、ccg和tcg的使用频率。

获得的优化mat^#基因序列长度为534bp，与原始mat基因的dna序列相比，氨基酸组成和顺序不变，改变碱基75个，占碱基总数的14％，更改密码子78个，占整个密码子总数的43.82％，g+c含量从原来的65.36％降为60.11％。

根据本发明，在具有seqidno.1所示的序列的前提下，只要该基因能编码具有n-乙酰基转移酶活性的多肽，可以在mat^#基因的两端添加任意类型和数目的其他dna，这些基因也应在本发明的范围内。

例如，可在mat^#基因上连接适当的信号肽编码序列，以实现该蛋白质在细胞内或细胞间的转运、定位、分泌、储存等。定位信号肽能够使mat蛋白产生后定向运输到细胞的特定部位，如：叶绿体、内质网和液泡等，这些特定区域能够为mat蛋白提供一个相对稳定的环境，有效防止mat蛋白的降解，可明显提高mat蛋白的稳定性和积累量，从而提高植物由mat蛋白所赋予的抗性。

根据本发明的优选的一种实施方式，本发明还提供了一种mat^#基因，其为密码子优化的mat基因，该mat^#基因的序列含有信号肽的编码序列和seqidno.1所示的序列，且该mat^#基因能编码n端带有信号肽且具有n-乙酰基转移酶活性的多肽。

优选地，所述信号肽编码序列为叶绿体转运肽tp的编码序列。

更优选地，所述信号肽编码序列如seqidno.2所示。

更进一步优选地，具有信号肽的编码序列的mat^#基因的序列为seqidno.3所示，该多肽的氨基酸序列为seqidno.4所示的序列。

具体地，所述mat^#基因的5’端有叶绿体转运肽tp的编码序列(如seqidno.2所示)，且该mat^#基因能编码n端带有叶绿体转运肽tp、具有n-乙酰基转移酶活性的多肽。其中，tp转运肽能够使mat蛋白靶向性的运输到细胞的叶绿体内。本发明对于seqidno.2所示的序列与seqidno.1所示的序列的连接方式没有特别的限定，只要二者位于同一读码框，能够表达n端带有tp转运肽的、具有n-乙酰基转移酶活性的多肽即可。通过以上步骤确定如seqidno.3所示的序列，该优化基因能够编码n端带有tp转运肽的、具有n-乙酰基转移酶活性的多肽。在tp转运肽的引导下，mat蛋白靶向性的运输到细胞的叶绿体内。叶绿体内是n-乙酰基转移酶作用的场所，可明显提高mat蛋白的稳定性和积累量，从而提高植物相对应的抗性水平。但是，本领域技术人员可以确定的是，seqidno.3所示的dna序列仅是本发明的一种优选实施方式，本发明所述能够编码n端带有tp信号肽的、具有n-乙酰基转移酶活性的多肽的序列并不限于seqidno.3所示的dna序列，其中，seqidno.3所示的dna序列表达出蛋白质的氨基酸序列为seqidno.4所示的氨基酸序列。

根据本发明的优选的一种实施方式，本发明还提供了一种mat^#基因，其为密码子优化的mat基因，该mat^#基因的序列含有提高mat^#基因翻译效率的序列、信号肽的编码序列和seqidno.1所示的序列，且该mat^#基因能编码n端带有信号肽且具有n-乙酰基转移酶活性的多肽。

优选地，提高mat^#基因翻译效率的序列为kozak序列，所述kozak序列如seqidno.5所示。

更优选地，具有提高mat^#基因翻译效率的序列的mat^#基因的序列如seqidno.6所示。

更详细地，为了提高mat^#基因的翻译效率，所述mat^#基因的5’端优选还有seqidno.5所示的dna序列，seqidno.5所示的dna序列属于kozak序列，其中，kozak序列用来增强真核基因的翻译效率，避免核糖体出现扫描漏洞(leakyscan)的序列。在本发明中，seqidno.5所示的序列位于seqidno.3所示的序列的5’端，通过以上方法确定如seqidno.6所示的序列。

根据本发明的优选的一种实施方式，本发明还提供了一种mat^#基因，其为密码子优化的mat基因，该mat^#基因的序列为如上所述的mat^#基因的5’端和3’分别连接上相同或不同的内切酶识别序列后得到。

优选地，所述内切酶识别序列为xhoⅰ限制性内切酶识别序列，所述xhoⅰ限制性内切酶识别序列如seqidno.7所示。

更优选地，具有内切酶识别序列的mat^#基因序列如seqidno.8所示。

详细地，为了载体构建的需要，在上述序列的5’与3’端还分别添加了限制性内切酶识别位点。在本发明中，优选地在seqidno.6所示的序列5’与3’端分别添加seqidno.7所示的序列(xhoi限制性内切酶识别序列ctcgag)，最终确定如seqidno.8所示的序列。

根据本发明的优选的一种实施方式，本发明还提供了一种mat^#基因表达框，该mat^#基因表达框含有如上所述的mat^#基因、在该mat^#基因的5’端上连接有能够被rna聚合酶特异识别和高效结合的启动子和在该mat^#基因的3’端上连接有能够给予rna聚合酶转录终止信号的终止子。

优选地，所述启动子为35s启动子，所述35s启动子的序列如seqidno.9所示，所述终止子为35spolya终止子，所述35spolya终止子的序列如seqidno.10所示。

更优选地，所述mat^#基因表达框序列如seqidno.11所示。

详细地，要想把目标基因(即mat^#基因)转入生物中稳定表达，需要有完整的基因表达框，即目标基因上游(5’端)有启动子序列、下游(3’端)有终止子序列。启动子序列和终止子序列在目标基因表达时起到控制目标基因转录的起始部位、转录强度和转录终止部位的作用，它并不影响目标基因表达出的蛋白质的氨基酸组成和结构，对于目标基因赋予的除草剂抗性特征没有任何影响。因此，本发明中，可以选择任何能够适用于基因表达的启动子、终止子序列与目标基因形成不同组合的基因表达框。根据一般生物学原理，真核和原核生物启动子-终止子组合都能实现本发明的mat^#基因的转录；只是本发明的mat^#基因按照模式植物水稻的密码子优化，在真核高等植物中蛋白质翻译效率高。

不同启动子和终止子对于起始和终止目标基因转录的能力有差异、作用时空有不同。选择合适的启动子和增强启动子的活性可增强外源基因的转录。目前在植物表达载体中应用的启动子有组成表达型启动子(例如：camv35s启动子、ubiquitin启动子、actin启动子，等)、诱导表达型启动子(例如：创伤诱导表达启动子、光诱导启动子rbcs、四环素诱导表达启动子，等)、组织特异表达型启动子(例如：花药绒毡层特异表达启动子ta29、胚乳特异表达启动子、维管束特异表达启动子，等)等。

根据本发明，优选地，所述mat^#基因的5’端还有seqidno.9所示的序列作为mat^#基因转录的启动子。其中，seqidno.9所示的序列为来源于花椰菜花叶病毒35s蛋白的启动子序列(camv35s)，作为启动mat^#基因转录的启动子。

根据本发明，优选地，所述mat^#基因的3’端还有seqidno.10所示的序列作为mat^#基因转录的终止子。其中，seqidno.10所示的序列为来源于花椰菜花叶病毒的35s蛋白的polya终止子序列(35spolya)，作为终止mat^#基因转录的终止子。最终，形成了如seqidno.11所示的序列，且作为mat^#基因表达的完整表达框。

另一方面，本发明还提供一种重组载体，该mat^#基因重组载体由如上所述的mat^#基因表达框插入表达载体后得到。

本发明中，所述重组载体由上述mat^#基因表达框和载体骨架组成；原核表达载体骨架插入原核启动子和终止子组合成的mat^#基因表达框能实现上述mat^#基因在原核细胞中的表达，真核表达载体插入真核启动子和终止子组合成的mat^#基因表达框能实现上述mat^#基因在真核细胞中的表达。如，所述载体可以为t载体(pmd18-t、pmd19-t等)、原核表达载体(pet32a等)或真核表达载体(pcambia3300、pcambia3301等)。其中，t载体和原核表达载体的主要作用是初步验证目标基因和目标蛋白的功能，而真核表达载体的作用是为了后续将其转化进作物中。因此，能够满足上述应用的各种t载体、原核表达载体和真核表达载体均可用于本发明。

优选地，mat^#基因重组载体为真核植物表达载体pc3300-mat^#，它以植物表达载体pcambia3300为载体骨架，插入序列如seqidno.11所示的mat^#基因表达框构建而成。

再一方面，本发明还提供一种改变作物抗性的方法，该方法包括将如上所述的重组载体转化所述作物，使得到的转基因作物表达mat^#基因、并具有除草剂抗性。

根据本发明，术语“作物”为本领域公知的概念，指大面积栽种或大面积收获，供盈利或口粮用的植物。本发明的基因不仅可用于转入水稻，也可以用于转入玉米、高粱、小麦、棉花、油菜、大豆、土豆、蔬菜、树木、花草等。优选地，所述作物为模式作物水稻，所述水稻包括各种水稻，如各亚种(籼稻、粳稻、爪哇稻)、各生态型(早稻、中稻、晚稻)水稻等。优选地，本发明中优选籼稻品系9k作为转化的受体作物。

实现转基因的方法有本领域公知的农杆菌介导转化法、基因枪法和花粉管通道法，等。优选地，本发明所用的转化方法为农杆菌介导转化法。所述农杆菌介导转化法可以为传统的常规法，如(yukohhieietal.transformationofricemediatedbyagrobacteriumtumefaciens.plantmolecularbiology,1997,35:205-218)中报道的方法，也可采用(seiichitoki,etal.earlyinfectionofscutellumtissuewithagrobacteriumallowshigh-speedtransformationofrice.theplantjournal,2006,47:969-976)中报道的快速转化方法。本发明采用改进的农杆菌介导快速转化法，具体地，seiichitoki等人进行农杆菌介导转化时，愈伤组织诱导后不进行继代而直接浸染，而本发明根据所用的愈伤组织的状态，诱导产生的愈伤组织继代后第3天达到最佳状态时再进行浸染，且在共培养和预分化阶段均将固体培养基中的琼脂粉含量提高至12g/l，这样改进能够得到更高的转化效率。

术语“除草剂抗性”是指作物具有一定耐受除草剂的能力。本发明中，所述除草剂抗性为对除草剂草铵膦的抗性；优选地，所述除草剂抗性为耐受至少1000mg/l浓度的草铵膦。

下面，通过以下实施例对本发明做更详细的说明。

其中，dna序列seqidno.8委托大连宝生物公司合成；各种pcr引物的合成和基因测序工作委托华大基因公司进行；各种酶均购自大连宝生物公司；pcambia3300载体由澳大利亚农业分子生物学应用中心(cambia，http://www.cambia.org)提供，本发明人扩增、保存；质粒的提取、纯化和酶切以及其他常规分子生物学操作方法参考《分子克隆》(科学出版社，第3版)进行。

本发明实施例中，所用作物为籼稻品系9k，由中科院亚热带农业生态研究所选育，已在文献(曾崇华.hd9802s/kasalath选系中高培养力和抗稻瘟病株系的筛选[d].北京:中国科学院大学,2015)中公开。农杆菌菌株eha105购自上海北诺生物科技有限公司，本发明人繁殖、保存。本发明中采用文献(seiichitokietal.earlyinfectionofscutellumtissuewithagrobacteriumallowshigh-speedtransformationofrice.theplantjournal,2006,47:969-976)所述的农杆菌介导转化法，但有改良：诱导产生的愈伤组织继代1次，继代后第3d进行浸染；且在共培养和预分化阶段均将固体培养基中的琼脂粉含量提高至12g/l。

实施例1

本实施例用于说明人工优化的mat^#基因的制备方法

首先，查找原始mat基因的dna序列(ncbi登录号：ab378291)，分析原始mat基因序列的密码子的相对使用度(rscu值)和水稻蛋白编码序列的密码子的相对使用度(rscu值)。其次，分析原始序列中存在的内含子切割识别序列、polya加尾识别序列及mrna发夹环结构。根据分析，在保持mat蛋白的氨基酸组成、顺序不变的前提下，用水稻偏爱密码子置换原始mat基因序列中相应的密码子，同时消除影响外源基因在植物细胞内高效表达的元件，最终获得优化后的mat基因(序列如seqidno.1所示)，命名为mat^#基因。

分析发现，原始mat基因中不存在造成植物转录不稳定的at富集区及attta重复序列、polya加尾识别信号序列，但存在1处潜在的内含子切割识别序列，利用同义密码子替换法，消除了内含子切割识别序列；在不改变优化基因的氨基酸序列的前提下，利用同义密码子替换法来消除形成的稳定发夹环等mrna二级结构，使优化基因起始自由能降到-198.30kcal/mol。分析优化后的mat^#基因，密码子的相对使用度(rscu值)如表1中第3列所示，与水稻和原始mat基因序列相比，优化后的mat^#基因序列的密码子使用频率与水稻表达蛋白密码子使用频率基本一致；同时为了防止dna序列甲基化的可能，降低了密码子gcg、acg、ccg和tcg的使用频率。

获得的优化mat^#基因序列长度为534bp，与原始mat基因的dna序列相比，氨基酸组成和顺序不变，改变碱基75个，占碱基总数的14％，更改密码子78个，占基因密码子总数的43.82％，g+c含量从原来的65.36％降为60.11％。

表1

注：括号内数据为在统计的样本中每个密码子使用的次数。rscu(ij)＝x(ij)/〔x(i)/n〕，其中，rscu(ij)是指第i个氨基酸第j个同义密码子的密码子使用相对概率，x(ij)是指第i个氨基酸第j个同义密码子在一个基因中的出现次数，x(i)是指第i个氨基酸在这个基因中的出现次数，这个数字是该氨基酸对应所有同义密码子的出现次数之和；n是指该氨基酸对应的同义密码子种数。

表1示出了人工优化合成的mat^#基因、原始的mat基因与水稻蛋白编码基因在同义密码子的相对使用度(rscu值)上的比较。

为了使表达的目标蛋白有效地积累和行使功能，在优化好的mat^#基因序列的5’端添加seqidno.2所示的序列，该序列可以把目标蛋白靶向叶绿体。为了提高mat蛋白的表达效率，可以对起始密码子周边序列进行优化，优选地在mat^#融合基因的5’端添加了seqidno.5所示的dna序列，其中seqidno.5所示的dna序列属于kozak序列。根据进一步实验的需要，在上述序列的5’与3’端分别添加xhoi内切酶识别序列ctcgag，通过以上步骤最终确定如seqidno.8所示的序列。送至大连宝生物公司合成如seqidno.8所示的序列，并将其连接在pmd19-t载体上，构建成含有mat^#基因的重组载体pmd19-t-mat^#。

实施例2

本实施例用于说明植物表达载体pc3300-mat^#的构建方法。

将质粒载体pcambia3300和pmd19-t-mat^#均用限制性内切酶xhoⅰ单酶切，分别回收其大片段和小片段。使用t4dna连接酶连接这2个回收片段，重组质粒转化感受态大肠杆菌，扩增后提取质粒，pcr和酶切检测结果说明重组质粒载体构建成功(图2)。通过测序选出连接方向正确的重组质粒，得到的新质粒载体命名为pc3300-mat^#。

实施例3

本实施例用于说明mat^#基因转化模式植物水稻的方法。

1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导

选用籼稻品系9k作为转化受体，取其成熟种子，剥去颖壳；糙米中加入5％的次氯酸钠溶液消毒40min，倾去上清液，用无菌双蒸水清洗3-5次；将糙米接种于愈伤组织诱导培养基上，32℃黑暗下培养5-7d；挑选从种子盾片部位诱导出的愈伤组织接种于新鲜诱导培养基上，继代3d后用于农杆菌浸染。

2)农杆菌介导法转化水稻愈伤组织

(a)pc3300-mat^#质粒转化农杆菌感受态细胞。农杆菌感受态细胞的制备及转化方法参考《植物基因工程》(科学出版社，第2版)进行。

(b)农杆菌转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织。(1)取步骤(a)得到农杆菌单菌落，均匀涂抹于含50mg/l卡那霉素和50mg/l利福平的lb固体培养基上，28℃倒置培养1-2d至菌落长出；(2)加入相应的液体培养基悬浮菌体成一定浓度的菌液，测od值在0.2左右；(3)将待浸染的愈伤组织置于滤纸上于无菌风下吹干后置于灭菌的三角瓶中，加入稀释好的农杆菌菌液浸染20min，浸染过程中不断的摇动三角瓶；(4)取出愈伤组织置于灭菌的滤纸上吸干多余菌液后再置于琼脂粉含量为10g/l的固体共培养基上于24℃暗培养3d；(5)取出共培养的愈伤组织，转移到含有6mg/l草铵膦、400mg/l羧苄霉素和500mg/l头孢霉素的筛选培养基上培养2-3周；(6)之后将筛选后的成活愈伤组织转移到琼脂粉含量为12g/l的预分化培养基上培养2周；(7)将预分化后的愈伤组织转移到分化培养基上，每天12h、1000-1500lux光照下进行分化；(8)7d后愈伤组织出现绿点，14d左右愈伤组织上长出再生小苗，3-4周后将再生小苗转至1/2ms培养基上壮苗培养，待小苗长到10cm左右时移栽入土。移栽成活的转基因再生植株命名为9k-mat。

3)转基因植株的检测

(a)转基因植株9k-mat的pcr检测

首先，采用ctab法提取植株总dna，方法参考《植物基因工程》(科学出版社，第2版)进行。

然后，进行pcr检测分析：(1)dna试验材料：转基因植株9k-mat的总dna提取物；阴性对照9k的总dna提取物；阳性对照pc3300-mat^#质粒。(2)pcr检测mat^#基因：上游引物pmat-1的序列如seqidno.12所示，下游引物pmat-2的序列如seqidno.13所示。

对mat^#基因的检测结果如图3.a所示。其中，泳道m为dl2000dna分子量标记，泳道b为不加模板的阴性对照，泳道ck为非转基因植株9k的阴性对照，泳道p为阳性质粒的对照，泳道9k-mat为转基因株系的检测结果，说明转基因株系9k-mat已成功转入了mat^#基因。

(b)转基因植株9k-mat的southern杂交检测

首先，采用ctab法提取植株总dna，方法参考《植物基因工程》(科学出版社，第2版)进行。

其次，以pcr扩增的方法制备探针，具体方法如下：

(1)pcr反应体系：正向引物pmat-1(10μmol)1μl，反向引物pmat-2(10μmol)1μl，dna模板(10-20ng/μl)1μl，10×pcr缓冲液2μl，mgcl22μl，dig-dutp标记混合物1μl，h2o13.5μl，taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl。

(2)pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸10min。

(3)检测扩增产物：制备1.0％的琼脂糖凝胶，取1μlpcr产物稀释5倍后电泳检测。

southern杂交方法参考《植物基因工程》(科学出版社，第2版)进行。结果显示，southern杂交检测4株t2代植株，全部均有相同的特异性目标条带出现(图3.b)，初步表明9k-mat株系至少含有2个拷贝的mat^#基因，且连锁遗传、不分离。

实施例4

本实施例用于说明mat^#基因在籼稻9k中表达。

通过测定mat^#基因表达产物的酶活，用于说明mat^#基因在籼稻9k中能正常表达。

mat蛋白酶活测定按照文献(ellmangl.tissuesulfhydrylgroups.archivesofbiochemistryandbiophysics,1959,82(1):70-7)所述方法进行，具体操作步骤如下：

(1)取0.5g叶片，加500μl提取缓冲液(25mmol/ltris-hcl，1mmol/lna2edta，0.15mg/ml苯甲基磺酰氟，ph8.5)，加25mg聚乙烯聚吡咯烷酮，冰上研磨。

(2)将研磨液在4℃下13000rpm离心10min，取上清液，得到粗提液。

(3)取4根灭菌离心管，编号1、2、3、4。分别在离心管中加入100μl粗提液，1～3管放于冰上，将4号管在沸水浴中加热1min。

(4)分别在管中加入690μl反应缓冲液(100mmol/ltris-hcl，ph8.5)，加入100μl5,5-二硫二硝基苯甲酸(终浓度为0.4mg/ml)，10μl乙酰coa(终浓度为0.5mmol/l)。

(5)将4根离心管放于30℃水浴中预热1min后，逐管加入100μl草铵膦(终浓度为1mmol/l)，30s后使用uv-2450型号分光光度计测定a412，分别记为a1、a2、a3、a4。用等体积的去离子水替代样品作为空白对照。

(6)定义1个酶活性单位(u)为1分钟内催化1μmol底物所需的酶量，利用下列公式计算酶的比活力。

其中，ε为摩尔吸收系数，文献(ellmangl.tissuesulfhydrylgroups.archivesofbiochemistryandbiophysics,1959,82(1):70-7)值为13600ml·mmol^-1·cm^-1，v为反应体系体积(单位ml)，b为光度计直径(单位cm)，w为样品鲜重(单位mg)。

以t2代转基因植株9k-mat叶片为材料，测量其表达的n-乙酰基转移酶活性，结果如表2所示。经计算，t2代转基因植株表达的mat蛋白的平均比活力为6.67×10^-5u/mg鲜重，n-乙酰基转移酶活性约为非转基因对照的7.5倍。

表2

表2示出了t2代转基因水稻9k-mat的mat蛋白酶活性。

实施例5

本实施例用于说明t2代转基因植株9k-mat喷洒除草剂草铵膦的抗性实验。

用100ml浓度为1000mg/l的草铵膦水溶液喷洒非转基因植株9k和转基因植株9k-mat，10d后观察植株生长情况。

结果如图4所示，其中，ck为非转基因植株9k，9k-mat为转基因株系。由图4可以看出，非转基因植株9k已经枯死，而转基因的植株则生长正常。说明mat^#基因在转基因水稻中正常表达，能抵抗浓度为1000mg/l草铵膦的处理。

实施例6

本实施例用于说明t2代转基因植株的种子在含草铵膦培养基上萌发的抗性检测结果。

方法：将灭菌后的9k、9ka2(含bar基因)和9k-mat种子分别接种到含有0、6、100、300、600mg/l草铵膦的1/2ms培养基上，在24℃光照/19℃黑暗交替条件下发芽，10天后测定每个发芽种子的根长和芽长。其中9ka2为以籼稻9k为受体转化了抗草铵膦的bar基因的转基因植株，该转基因水稻由发明人单位研制。

通过种子萌发实验测定转基因植株对草铵膦的抗性(图5、表3)。从图5可以看出，随着除草剂浓度的增加，非转基因受体植株的根系和芽的生长受到了抑制，而且幼苗的颜色发黄，转基因株系9k-mat的生长并未受到很大影响。统计转基因水稻种子在草铵膦培养基上萌发的根长，结果表明(表3)，当草铵膦浓度均为0mg/l时，转基因和非转基因水稻的根长无显著差异；在存在草铵膦(6～600mg/l)的培养基上，转基因水稻9k-mat的根长显著长于非转基因对照的根长，说明转基因水稻9k-mat具有草铵膦抗性。转基因水稻9k-mat在各个处理中都没有表现出草铵膦对根长的显著抑制作用，说明转基因水稻9k-mat用根长度量的草铵膦抗性浓度不低于600mg/l，且9k-mat的抗性至少不低于9ka2。

统计转基因水稻种子在草铵膦培养基上萌发的芽长，结果表明(图5，表3)，当草铵膦浓度为0mg/l时，9k-mat的芽长与对照间无显著差异；在存在草铵膦(6～600mg/l)的培养基上，转基因水稻9k-mat的芽长均显著长于非转基因对照的芽长，说明转基因水稻9k-mat具有草铵膦抗性。转基因水稻9k-mat的芽长在草铵膦6～600mg/l处理均没有导致芽长比对照显著降低，说明这转基因水稻9k-mat用芽长度量的草铵膦抗性浓度不低于600mg/l。

表3

注：字母a、b、c表示表格纵向的多重比较结果，字母e、f、g表示表格横向的多重比较结果，标志字母中具有相同小写字母的数据之间差异不显著。

表3示出了转基因水稻种子在含草铵膦培养基上萌发时的根长和芽长。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。