斜带石斑鱼补体C1INH基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种rc1inh-nonserpin蛋白及编码该蛋白的基因、含有该基因的载体及其应用；还涉及一种补体c1inh蛋白及编码该蛋白的基因、含有该基因的载体及其应用。

背景技术：

补体在巨噬细胞活化因子所调控的动物免疫系统中扮演着一个调控中枢，能够有效通过提高免疫细胞对入侵病菌的吞噬力并同时刺激超氧化物酶的产生，从而挺高机体的免疫能力。然而，补体过度的激活会造成机体的损伤。在补体系统当中，补体c1抑制物(c1inh)是补体元件中唯一的一个负调控元件。补体c1inh是一个单链分子，一般由478个氨基酸残基组成，链内存在两对二硫键，n末端为nonserpin结构域，c末端为丝氨酸蛋白酶抑制蛋白结构域。在功能上，c1inh能够负调控三条补体激活途径，其能够通过与c1r和c1s的活性部分形成共价的酯键而抑制活性，从而抑制了补体的经典途径；c1inh可以通过抑制mbsp-1和mbsp-2的活性，从而抑制补体的凝集素途径；c1inh也可以通过b因子与c3b的结合，从而抑制补体的旁路途径。c1inh是一个多功能的大分子，其除了能够抑制补三条补体途径之外，c1inh的存在还可以有效地拮抗lps的毒副作用，抑制激肽释放酶原，凝血因子xii，凝血因子xi和纤溶酶的活性，对炎症反应具有重要的调控作用。

斜带石斑鱼（epinepheluscoioides）属于鲈形目(perciformes)，鮨科(serranidae)，石斑鱼亚科(epinephelinae)，石斑鱼属(epinephelus)，是暖水性的礁栖鱼类，在印度洋和太平洋的热带、亚热带海域广泛分布。石斑鱼属于名贵海产鱼类之一，其肉质鲜美，倍受各地消费者的喜爱，经济价值巨大。但是，由于面对着目前的急剧的气候变化灾害和严重污染的水质问题，从而导致了其致病率和死亡率居高不下，对石斑鱼的人工养殖造成严重的经济打击，也是一个难以解决的问题。如何增强石斑鱼的抗逆能力，提高养殖存活率，是目前亟待解决的难题。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种石斑鱼rc1inh-nonserpin蛋白。

本发明的另一目的在于提供编码上述石斑鱼rc1inh-nonserpin蛋白的基因。

本发明的另一目的在于提供一种石斑鱼补体c1inh的结构域蛋白，即石斑鱼补体rc1inh-nonserpin蛋白。

本发明的另一目的在于提供编码上述石斑鱼补体c1inh蛋白的基因。

本发明的另一目的在于提供含有石斑鱼补体c1inh蛋白基因及功能片段rc1inh-nonserpin的克隆载体。

本发明的另一目的在于提供含有石斑鱼补体c1inh蛋白基因及功能片段rc1inh-nonserpin的表达载体。

本发明的另一目的在于提供一种石斑鱼补体c1inh功能片段rc1inh-nonserpin重组蛋白及其制备方法。

本发明的另一目的在于提供石斑鱼rc1inh-nonserpin蛋白和/或c1inh蛋白在提高石斑鱼免疫力中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

石斑鱼rc1inh-nonserpin蛋白，其氨基酸序列如seqidno:4所示，或者是seqidno:4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后且具有同等或更高活性的蛋白。

编码上述石斑鱼rc1inh-nonserpin蛋白的基因。其核苷酸序列如seqidno：3所示。

石斑鱼补体c1inh蛋白，其氨基酸序列如seqidno：2所示，或者是seqidno：2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后且具有同等或更高活性的蛋白。

编码上述石斑鱼补体c1inh蛋白的基因。其核苷酸序列如seqidno：1所示。

生产石斑鱼rc1inh-nonserpin蛋白或石斑鱼补体c1inh蛋白的方法，包括将上述表达载体导入宿主细胞中，表达得到rc1inh-nonserpin蛋白或c1inh蛋白。

本发明的有益效果如下：

1．本发明首次获得了石斑鱼的补体c1inh基因序列以及c1inh序列上的功能片段rc1inh-nonserpin核苷酸序列，不仅丰富了石斑鱼的基因库，而且可应用于制备重组蛋白、鱼类免疫制剂或饲料添加剂，为石斑鱼的生理免疫研究提供了新的理论与实践基础；

2.将石斑鱼rc1inh-nonserpin核苷酸序列通过重组株表达，可以大量生产石斑鱼rc1inh-nonserpin重组蛋白，大大降低了生产成本，具有很高的经济价值；

3.本发明所提供的石斑鱼rc1inh-nonserpin重组蛋白，经实验证明具有提高石斑鱼免疫力等功能，可以应用于制备鱼类尤其是石斑鱼免疫制剂或饲料添加剂，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是斜带石斑鱼补体c1inh基因中间片段的凝胶电泳分析图（m：dna分子量标准；1，2：石斑鱼c1inh基因中间片段pcr产物）；

图2是斜带石斑鱼补体c1inh基因5’端片段合成和3’端片段合成的第二次pcr凝胶电泳分析图；（m：dna分子量标准；1-4：石斑鱼5’端片段pcr产物；6-8：石斑鱼3’端片段pcr产物；nc：阴性对照）；

图3是c1inh基因orf的pcr扩增产物的电泳鉴定图（m：dna分子量标准；1：石斑鱼c1inh基因orf全长序列pcr产物）；

图4是斜带石斑鱼补体c1inh功能片段rc1inh-nonserpin的pcr扩增产物的凝胶电泳分析图（m：dna分子量标准；1：石斑鱼rc1inh-nonserpin基因orf全长序列pcr产物;nc：阴性对照）；

图5是克隆载体pmd18-t-rc1inh-nonserpin双酶切（ecori、xbai）验证图（m：dna分子量标准；1：pmd18-t-rc1inh-nonserpin质粒;2：双酶切pmd18-t-rc1inh-nonserpin质粒）；

图6是表达载体pet32a-rc1inh-nonserpin双酶切（ecori、xbai）验证图（m：dna分子量标准；1：双酶切pet32a-rc1inh-nonserpin质粒;2：pet32a-rc1inh-nonserpin质粒;3:双酶切pet32a质粒;4：pet32a质粒）；

图7是重组株pet32a-rc1inh-nonserpin-bl21表达产物rc1inh-nonserpin重组蛋白的sds-page电泳分析图（m：蛋白分子量标准；1：pet32a-bl21诱导产物；2：pet32a-rc1inh-nonserpin-bl21诱导产物；3：破碎pet32a-rc1inh-nonserpin-bl21诱导产物后的上清液；4:破碎pet32a-rc1inh-nonserpin-bl21诱导产物后的沉淀；5：纯化后rc1inh-nonserpin的重组蛋白）；

图8是重组株pet32a-rc1inh-nonserpin-bl21表达产物rc1inh-nonserpin重组蛋白的western-blot鉴定图（m：蛋白分子量标准；1：pet32a-bl21诱导产物；2：pet32a-rc1inh-nonserpin-bl21诱导产物）；

图9是pet32a-rc1inh-nonserpin表达载体构建示意图；

图10是rc1inh-nonserpin抗原表位预测分析；

图11是对样品进行抽提rna的电泳图；

图12是lps刺激中，a，b，c三组鱼血myd88基因水平的变化（不同字母表示与对照组相比有显著性差异，p＜0.0＝5）；

图13是lps刺激中，a、b、c三组鱼血tnf1基因水平的变化（不同字母表示与对照组相比有显著性差异，p＜0.05）；

图14是lps刺激中，a、b、c三组鱼血tnf2基因水平的变化（不同字母表示与对照组相比有显著性差异，p＜0.05）；

图15是lps刺激中，a、b、c三组鱼血il1b基因水平的变化（不同字母表示与对照组相比有显著性差异，p＜0.05）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括pcr扩增、质粒提取、质粒转化、dna片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(sambrookj,russelldw，janssenk,argentinej.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。

一、斜带石斑鱼补体c1inh基因中间片段的合成

通过序列分析软件对人c1inh基因的序列的一段高度同源片段进行分析并设计兼并引物一对c1inh-f和c1inh-r，上游引物c1inh-f为【5’-tgtaaccgctcagtcgcc】（seqidno.5）和下游引物c1inh-r【5’-gcattatccctcgcaccta】（seqidno.6），以m-mlvreversetranscriptasekit(promega，madison，wi，usa)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cdna为模板，经降落pcr方法扩增获得了石斑鱼补体c1inh的中间片段，总长为753bp。反应条件为：94℃预变性5分钟；（1）94℃变性30秒，66℃退火30秒，72℃延伸45秒，共5循环，；（2）94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒，共5循环，；最后94℃，变性30秒，54℃退火45秒，72℃延伸45秒，共30循环，最后继续72℃延伸10分钟。增产物的电泳鉴定图见图1。

二、斜带石斑鱼补体c1inh基因5’端片段和3’端片段合成

操作按照bdsmartracecdnaamplificationkit(bdbioscienceclontech，ca，usa)protocol来进行。根据试剂盒的要求，依据已测序的补体c1inh中间片段的序列设计了两条引物c1inh5-1和c1inh5-2进行5’端片段嵌套pcr，并设计了两条引物c1inh3-1和c1inh3-2进行3’端片段嵌套pcr。在5’端片段嵌套pcr反应中，第一条引物c1inh5-1为【5’-gcaccccgctgatactgataggag】（seqidno.7），第二条引物c1inh5-2为【5’-gggttcccctgtgcgactgttc】（seqidno.8）。在3’端片段嵌套pcr反应中，第一条上游引物c1inh3-1为【5’-aacacccgtagagccattgagacag】（seqidno.9），第二条上游引物c1inh3-2为【5’-gttttatgaagcaaagcccaccagg】（seqidno.10）。

第一次5’端和3’端嵌套pcr反应中以m-mlvreversetranscriptasekit(promega，madison，wi，usa)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cdna为模板，经降落pcr方法扩增。其反应条件为：94℃预变性5分钟；（1）94℃变性30秒，72℃退火30秒，共5循环，72℃延伸2分钟；（2）94℃变性30秒，70℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共5循环；最后94℃变性30秒68℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共30循环。第二次pcr以第一次pcr产物为模板，经降落pcr方法扩增，（1）94℃变性30秒，72℃退火30秒，共5循环，72℃延伸2分钟；（2）94℃变性30秒，70℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共5循环；最后94℃变性30秒68℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共30循环。第一次pcr在琼脂糖凝胶上未能检测出条带，第二次pcr扩增产物的电泳鉴定图见图2。

三、斜带石斑鱼补体c1inh基因全长序列的拼接

将已经测序的补体c1inh中间片段、5’race片段和3’race片段进行拼接，得到斜带石斑鱼补体c1inh基因的orf全长，即补石斑鱼补体c1inhcdna全序列（seqidno.1）的第1-2219bp，总长为2219bp，并推测出其氨基酸序列（seqidno.2）。

根据拼接得到的c1inh基因orf全长设计引物c1inhqf【5’-atgaaactacaggccgtact】（seqidno.11），c1inhqa【5’-tgggttggtcactctgccaacaa】（seqidno.12）。扩增的长度为1797bp。以m-mlvreversetranscriptasekit(promega,madison,wi,usa)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cdna为模板，经pcr方法扩增石斑鱼的补体c1inh序列，pcr反应条件为：94℃预变性3分钟；下边为40个循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟；最后72℃延伸10分钟。pcr扩增产物的电泳鉴定图见图3。

四、生物信息学方法分析斜带石斑鱼活性区段c1inh补体nonserpin结构序列

另外。通过软件分析了石斑鱼的补体c1inh基因的抗原表位（图10）。进一步的确定了包含多个结合位点的活性区段石斑鱼c1inh-nonserpin结构序列。

五、斜带石斑鱼功能片段rc1inh-nonserpin序列基因的合成

根据分析好的斜带石斑鱼功能片段rc1inh-nonserpin的cdna序列（seqidno.3），设计合成两段引物，上游引物【5’-cgcggatccatgaaactacaggccgtact】（seqidno.13）；下游引物【5’-cccaagcttatacagcttcattgaaaact】（seqidno.14）。以m-mlvreversetranscriptasekit(promega，madison，wi，usa)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cdna为模板，经pcr方法扩增石斑鱼的补体c1inh功能片段rc1inh-nonserpin序列，pcr反应条件为：94℃预变性3分钟；下边为40个循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒；最后72℃延伸10分钟。pcr扩增产物的电泳鉴定图见图4。

六、含斜带石斑鱼功能片段rc1inh-nonserpin序列的克隆载体

将所获得的rc1inh-nonserpin序列片段分离纯化，然后与pmd18-t（takara）载体按照该试剂盒提供的体系4℃连接过夜（约16h），将连接产物转化大肠杆菌dh5α，经amp+抗性和蓝白斑筛选出阳性克隆，通过质粒提取试剂盒提取质粒，质粒经过双酶切验证以及测序验证，证明斜带石斑鱼功能片段rc1inh-nonserpin序列克隆到载体中，命名为pmd18-t-rc1inh-nonserpin，克隆载体转化大肠杆菌dh5α所得到的重组菌株命名为pmd18-t-rc1inh-nonserpin-dh5α。使用bamhi、hindiii对克隆载体pmd18-t-rc1inh-nonserpin进行双酶切，酶切图谱见图5。

七、含斜带石斑鱼功能片段rc1inh-nonserpin序列的表达载体pet32a-rc1inh-nonserpin的构建

克隆载体pmd18-t-rc1inh-nonserpin用限制性内切酶bamhi和hindiii双酶切后，酶切产物用e.z.n.a.^®gelextractionkit回收，进行琼脂糖凝胶电泳，对斜带石斑鱼功能片段rc1inh-nonserpin序列进行分离纯化；

载体质粒pet32a经限制性内切酶bamhi和hindiii双酶切后，与斜带石斑鱼功能片段rc1inh-nonserpin片段序列按1:3混合，用t4连接酶16℃连接16小时后用氯化钙转化法转入大肠杆菌dh5a中。用lb平板筛选具有amp抗性的转化子，并提取质粒，再用限制性内切酶ecori和xbai双酶切重组质粒进行鉴定，重组质粒命名为pet32a-rc1inh-nonserpin。质粒构建流程图见图9。使用bamhi、hindiii对表达载体pet32a-rc1inh-nonserpin进行双酶切，酶切分析图见图6。

八、能高效表达斜带石斑鱼功能片段rc1inh-nonserpin蛋白的大肠杆菌重组株pet32a-rc1inh-nonserpin-bl21构建

按照氯化钙转化法，将实施例7所获得目的重组质粒转入大肠杆菌bl21，用lb平板筛选具有amp抗性的转化子，该重组菌为pet32a-rc1inh-nonserpin-bl21。

九、利用大肠杆菌重组菌pet32a-rc1inh-nonserpin-bl21生产重组斜带石斑鱼功能片段rc1inh-nonserpin蛋白

分别挑取重组bl21单克隆工程菌，接种于含有amp抗性的lb培养基中，37℃，200rpm培养od600至2-6，扩大菌种并换新鲜含有amp抗性的lb培养基，当od600至1.0时停止，并加入约1mmiptg诱导4h。诱导后2000rpm，4℃收集菌体。加入tebbuffer对菌体进行悬浮，加入适量的溶菌酶，4℃过夜，然后再冰浴中超声破碎至亮清。再用含有30%tritionx-100的buffera进行重悬，再冰上静置30分钟，加入含有尿素的bufferb在室温下对蛋白进行溶解。按照hisbindni-nta（novagan）的方法，对溶解后的蛋白进行纯化。结果见图7。

十、石斑鱼rc1inh-nonserpin蛋白抗原活性鉴定实验

将重组斜带石斑鱼功能片段rc1inh-nonserpin蛋白采用免疫印迹（westernblot）方法进行免疫活性鉴定。一抗为鼠源his单克隆抗体（novagen），二抗为羊抗鼠igg-hrp（鼎国公司）。结果见图8，显示鼠源his单克隆抗体能识别我们用毕赤酵母表达的重组斜带石斑鱼功能片段rc1inh-nonserpin蛋白，证明得到的蛋白是重组斜带石斑鱼功能片段rc1inh-nonserpin蛋白。

十一、动物实验

1.实验前准备

将上述纯化的石斑鱼rc1inh-nonserpin蛋白与lps，按照质量体积比rc1inh-nonserpin：lps=3：10冰上混匀，4℃下，180rpm轻摇2h，得到lps+rc1inh-nonserpin混合液。

2.实验设计

实验组分为3组，a组为注射纯化30μgrc1inh-nonserpin蛋白液/尾，用pbs补足体积；b组为注射100μglps溶解液/尾，用pbs补足体积；c组为注射100μglps+30μgrc1inh-nonserpin蛋白混合液/尾。

3.实验条件

选取同一批次、体质健康、规格相近的斜带石斑鱼放养在准备好的1.0m×0.5m×0.5m的储物箱中，在每个储物箱先装满40l的海水，水温25～30℃，水体盐度28～32‰，ph值8.1～8.3，溶解氧值大于5.0mg/l。对各组鱼进行注射后，分别在0小时，6小时，12小时和24小时取样，每组取5尾，将每个组别的鱼血分离，并加入trizol，液氮速冻后，马上放入-80℃保存。

4.rna提取与cdna反转录

根据rna提取方法，总rna用trizol试剂（invitrogen，usa）进行提取。所提取的rna的质量和纯度由260nm和260/280nm的数值所断定。总rna的完整性通过1%琼脂糖胶所断定，见图11。根据revertaid™m-mulvreversetranscriptasekit(mbifermentas,usa)的方法，使用1000ng的mrna进行反转录实验。

5.实时荧光定量qrt-pcr

将上述反转的cdna进行实时荧光定量qrt-pcr实验，实时荧光定量qrt-pcr的体系总体积为20ml：0.8ml稀释的上下游引物（myd88,tnf1,tnf2,il1b）,0.4mlrox参照染料（50×）,10mlsybrpremixextaq™ii(perfectrealtime)(takara,dalian,china),0.4ml按1比10稀释的cdna模板和6ml超纯水。qrt-pcr反应条件包含有：95℃预变性2分钟；下边为40个循环：95℃变性30秒，65℃退火30秒；在扩增结束后接着以下1个循环：95℃变性30秒，60℃退火30秒，所扩增的产物要经过溶解曲线分析。每个qrt-pcr实验重复3次。实验结果由7500sdssoftware(appliedbiosystems,usa)进行分析。见图12-图15。

以上实验表明：实验组b组，注射了lps后，在24小时，lps能够激活的依赖于myd88信号通路激活，并上调通路下游的相关炎症因子。实验组a组，注射了rc1inh-nonserpin重组蛋白，其无法激活lps所依赖的myd88信号通路，作为阴性对照。实验组c组，注射了lps+rc1inh-nonserpin后，myd88信号通路以及其下游相关炎症因子无法激活。由此可见，重组蛋白rc1inh-nonserpin可以有效与lps相互作用，降低其对鱼体的应激作用，该重组蛋白可用于制备鱼类免疫制剂，提高鱼类尤其是石斑鱼的免疫力。

sequencelisting

<110>华南师范大学

<120>斜带石斑鱼补体c1inh基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用

<130>

<160>14

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2219

<212>dna

<213>epinepheluscoioides

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caaagaggacaataatggcacaaggacacagctggacactgaagacgagtcaagtgataa600

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catcacggagttttcaatgaagctgtattcttacctcagagaatcacaaccctccagcaa900

tctactcttctctcctatcagtatcagcggggtgctgtcccatttgttgctaggtgccag960

ggataacacccgtagagccattgagacagctgtcagtgtgcctcatgacttccactgtgt1020

tcacctccacatgaagaagcttagagagaagttggccggctccttgcagatggcttctca1080

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