一种高效获得重组蛋白的大肠埃希菌可溶性表达载体的制作方法

本发明涉及一种原核生物表达体系，尤其是一种可高效、低成本地获得重组蛋白的可溶性表达载体。

背景技术：

在基因工程药物研究中，由于大肠埃希菌具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、易于操作等优点，但不可避免地也存在着一定的缺点。虽然人们开发出了多种表达体系，以克服大肠埃希菌表达产物中含有内毒素、缺少翻译后修饰、高表达时易折叠错误等不足，但大肠埃希菌表达体系仍然是基因表达的重要工具。

在利用大肠埃希菌高水平表达外源基因，尤其是表达产物富含二硫键时，易于形成包涵体，而经变性/复性后，正确折叠的蛋白质的产量不稳定，有时会很低，甚至有些蛋白尤其是高分子量的蛋白基本上不能正确折叠。虽然目前已经开发出多种可促进的外源蛋白正确折叠、提高其产量的表达载体，但由于促进蛋白正确折叠的生物分子，如分子伴侣dnak、groel等，其分子量与某些目的蛋白相近，混入其中，导致所获得蛋白的纯度不高，而且各种促进蛋白正确折叠的生物分子适用不同的目的蛋白。

一般情况下，利用基因重组技术，可以实现低成本、高效地获取具有药用价值的重组多肽或蛋白，但所获得的蛋白纯度不高、纯化步骤繁琐。通常采用亲和标签与目的蛋白融合表达的方式来简化重组蛋白的分离纯化步骤，但所获得的目的蛋白的一端带有亲和标签。而对于很多蛋白质药物而言，药典规定其不能含有亲和标签，故亲和标签的去除又成为了一个难题。目前，常见的亲和标签去除方法有化学法切割和酶法切割。其中，化学法切割对目的蛋白的活性影响较大，酶法切割成本较高，均不适合大规模应用。

综合来看，目前还没有一种载体能够在保证目的蛋白正确折叠的情况下通过自我剪切获得不含任何标签的目的蛋白的低成本、高收率的方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种可高效获得重组蛋白的大肠埃希菌可溶性表达载体及其构建方法，利用该载体进行外源蛋白的表达克服了现有技术中存在的外源蛋白表达量少、纯度低、操作步骤多、以包涵体形式表达的缺陷。

本发明解决当前技术问题所采用的技术方案是：

所述的高效获得重组蛋白的大肠埃希菌可溶性表达载体通过异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导外源蛋白质表达，载体结构中同时含有内含肽基因与硫氧还蛋白基因，且所表达的内含肽与硫氧还蛋白用六聚组氨酸标记。其结构基因，按顺序为六聚组氨酸标签-柔性连接肽-几丁质结合域-内含肽复合体编码基因、外源目的基因、核糖体结合位点、硫氧还蛋白-柔性连接肽-六聚组氨酸标签复合体编码基因。

本发明的表达载体通过如下方法构建：分别获取内含肽与硫氧还蛋白的核酸序列，通过设计合适的引物，对两个基因(内含肽和硫氧还蛋白)的核酸序列进行优化和修饰，以市售的通用型表达载体为母核，通过酶切、酶连，获得特征结构序列依次为六聚组氨酸标签-柔性连接肽-几丁质结合域-内含肽复合体编码基因、外源目的基因、核糖体结合位点、硫氧还蛋白-六聚组氨酸标签复合体编码基因的重组可溶性表达载体。其中，将六聚组氨酸标签-柔性连接肽-几丁质结合域-内含肽复合体命名为i复合体蛋白，硫氧还蛋白-六聚组氨酸标签复合体命名为h复合体蛋白，整个载体命名为psypu-ih。

其中，在内含肽基因序列的5'端依次连接上几丁质结合域基因、柔性连接肽基因、六聚组氨酸标签基因。

在硫氧还蛋白基因3'端进行六聚组氨酸基因标记。

所述的外源目的基因的结构中含有二硫键。

所用的限制性核酸内切酶为bspi、bamhi，宿主菌为bl21。

外源目的基因与硫氧还蛋白基因非融合表达。

本发明的有益效果是：①利用结构中含内含肽的i蛋白的高效自我切割能力，简化操作步骤，可获得不带有亲和标签的外源目的蛋白。②利用结构中含硫氧还蛋白的h复合体蛋白与目的蛋白在两个转录单位中非融合表达，促进目的蛋白正确折叠，获得表达量高、有生物活性的目的蛋白，低成本地解决了大肠埃希菌基因工程表达产物易形成包涵体的问题。同时，通过亲和标签介导，实现硫氧还蛋白的柱上结合，避免其混入，提高目的蛋白质的纯度。③应用价值高，可适用于规模化生产。

总体来看，该表达载体是一种能够在保证目的蛋白正确折叠的情况下通过自我剪切获得不含任何标签的目的蛋白的低成本、高收率的良好工具。

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

附图说明

图1为可溶性表达载体psypu-ih的构建及特征图谱

图1-1：(histag)6-柔性连接肽-cdb-intein基因获取；

图1-2：proh-柔性连接肽-(histag)6蛋白基因的pcr扩增图谱；

图1-3：可溶性表达载体psypu-ih质粒构建图谱；

图1-4：psypu-ih特征区域的结构顺序；

图2为重组蛋白angp的可溶性表达及分离纯化

图2-1：重组体psypu-ih-angp的pcr验证图谱；

图2-2：重组体psypu-ih-angp的菌落pcr验证图谱；

图2-3：重组蛋白angp可溶性分析的sds-page分析图谱；

图2-4：intein自我剪切的条件优化电泳图谱；

图2-5：chealtingsepharose4bfastflow层析图谱；

图2-6：spsepharosefastflow离子交换层析图谱；

图2-7：q-sepharosefastflow层析图谱。

具体实施方式

实施例1:可溶性表达载体psypu-ih构建

菌株：e.colibl21(de3)为本实验室保藏

引物：

lg4s-f1：5'-ggtggcggcggtagtggcggcggtggtagtaaaatcgaagaaggtaaactgacaaatcc-3'

lg4s-f2：5'-cgccatatg(cat)5cacggtggcggcggtagtggcggcggtggtagt-3'

lg4s-r1：5'-cgcggatccgaattcgagctcgctcttccgttgtgtacaatgat-3'

proh-f1：5'-cgcgaattctaagaaggagatatacatatgagcgataaaattattcacctgac-3'

proh-r1：5'-actaccaccgccgccactaccgccgccaccgctgctggccaggttagc-3'

proh-f2：5'-ggtggcggcggtagtggcggcggtggtagtatgagcgataaaattattcacctgac-3'

proh-r2：5'-cgcggatccttagctatgatgatgatgatggtggctgctggccaggttag-3'

proh-f：5'-cgcgaattctaagaaggagatatacatatgagcgataaaattattcacctgac-3'

proh-r：5'-cgcggatccttagctatgatgatgatgatggtggctgctggccaggttag-3'

angp-f1：5'-ggtggttgctcttccaacgatggatatataagaggaagtaacg-3'

angp-r1：5'-cgcgaattcttactttttgccaccgcatgtattact-3'

1.1(his)6-柔性连接肽-cdb-intein编码基因获取

a.第一轮pcr扩增。以ptwin-1为pcr模板，以lg4s-f1和lg4s-r1为引物，pcr扩增内含肽片段，按表1-1配制pcr反应混合液，表1-2所示条件进行第一轮pcr扩增，1.5％琼脂糖凝胶电泳检pcr扩增产物，回收备用。

b.以步骤a中回收产物为模板，以lg4s-f2和lg4s-r1为引物，按照上述第一轮pcr扩增条件进行第二轮pcr扩增，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，电泳检测获得目的基因大小产物，见附图1-1。

1.2psypu-i载体构建

质粒ptwin-1和intein基因双酶切：质粒ptwin-1和intein进行ndei和bamhi双酶切，成为带有两个粘性末端的线性dna分子，按照表1-3和1-4分别配制酶切反应混合液，于37℃保温酶切过夜，65℃20min终止反应。

酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，进行胶回收，按表1-5重组进行酶连接。连接反应混合物，于40℃孵育过夜，热转化大肠杆菌感受态细胞。

表1-5酶连体系

1.3psypu-i载体的鉴定

pcr扩增目的基因片段并电泳检查阳性的单克隆菌落，小量提取质粒，t7terminator为引物进行测序，测序图谱正确。

1.4硫氧还蛋白基因(h蛋白基因)获取

以特定质粒psypu-1b为模板，prohf1/r1、prohf2/r2、prohf/r为引物通过三轮pcr扩增，获得357bp长度的含有proh、柔性连接肽(ggtggcggcggtagtggcggcggtggtagt)、组氨酸标签和的基因。琼脂糖电泳检测pcr扩增产物如附图1-2。

1.5psypu-ih表达载体的构建

胶回收片段proh的pcr产物，用ecori和bamhi酶切对其进行双酶切，载体psypu-i同样双酶切，酶连后的产物转化大肠杆菌，涂布于lb-amp琼脂平板，小提质粒。pcr扩增目的基因片段并电泳检查呈阳性的单克隆菌落，提取质粒，以t7terminator引物进行测序，测序结果正确。

如图1-3和1-4所示，构建成功的psypu-ih的结构特征为：利用氨苄青霉素，或卡那霉素，或氯霉素对载体进行抗性标记；将两个复制起点(ori、m13ori)串联，提高复制效率；嵌入乳糖操纵子序列(lac),使外源蛋白在特定的条件下实现表达；在内含肽核酸序列的基础上，通过设计合适的引物，在内含肽基因序列的5'端依次连接上几丁质结合域基因、柔性连接肽基因、六聚组氨酸标签基因；利用同样的方式，在硫氧还蛋白基因3'端进行六聚组氨酸基因标记；在内含肽基因序列后，添加合适的酶切位点，便于外源基因的插入；在硫氧还蛋白基因与标记好的内含肽基因前，分别嵌入一个核糖体结合位点(rbs)，使二者在两个转录单位中各自表达，其中外源蛋白与被标记的内含肽融合表达，与硫氧还蛋白非融合表达。

实施例2：重组蝎毒活性肽angp可溶性表达、分离纯化

2.1重组质粒psypu-ih-angp的构建

以pet28a-angp为模板，以带有bspi和ecori限制性内切酶识别位点angpf/r为引物，pcr扩增angp基因(见附图2-1)。于37℃进行angp基因的ecori单酶切2hr，1.5％琼脂糖凝胶电泳分离并用胶回收angp基因(见附图2-2)，将angp的基因经ecori单酶切后的回收产物进行bspi单酶切，于50℃进行angp基因的bspi单酶切1hr，胶回收后进行酶连转化大肠杆菌感受肽。lb-amp筛选重组子，测序验证正确。

2.2重组质粒psypu-ih-angp的诱导表达

取重组质粒psypu-ih-angp，热转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，涂于含氨苄霉素抗性lb平板，于37℃倒置培养12～16小时。挑平挑平板单菌落至3mllb(ampicillin120ug/ml)，于37℃，250rpm培养过夜。按照1：100将过夜培养物接种至400ml含120ug/ml氨苄霉素的新鲜lb培养基的三角瓶中，于37℃，250rpm培养至od为0.6-0.8，加入终浓度为0.166mm/l的iptg，继续培养4个小时。3500转、4℃离心20分钟，收集菌体沉淀，加入startbuffer(50mmol/lpbs,0.5mnacl,ph8.020ml，溶解菌体沉淀，超声破碎，得上清、沉淀。对目的蛋白进行可溶性分析。从附图2-3中可知，外源基因得以表达，并且90％以上的诱导表达产物存在于上清液中，说明外源基因在该载体中得到了较高的可溶性表达。

2.3重组蛋白angp的分离纯化

1.上清总蛋白的获得

取重组质粒psypu-ih-angp，热转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，涂于含氨苄霉素抗性lb平板，于37℃倒置培养12～16小时。挑平挑平板单菌落至3mllb(ampicillin120ug/ml)，于37℃，250rpm培养过夜。按照1：100将过夜培养物接种至400ml含120ug/ml氨苄霉素的新鲜lb培养基的三角瓶中，于37℃，250rpm培养至od为0.6～0.8，加入终浓度为0.166mm/l的iptg，继续培养4个小时。3500转、4℃离心20分钟，收集菌体沉淀，加入startbuffer(50mmol/lpbs,0.5mnacl,ph8.020ml，溶解菌体沉淀，超声破碎，140000转、4℃离心20分钟，得上清、沉淀，获得上清总蛋白后，样品上chelatingsepharosefastflow柱，进行纯化。

2.诱导剪切条件

在改变缓冲液ph值的条件下，诱导上清蛋白中的(his)6-柔性连接肽-cdb-intein-angp发生自剪切，释放目的蛋白angp。分别将缓冲液ph值调至5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，室温下静置16～24hr后，15％sds-page对剪切效果检测分析，6.5的剪切条件为最佳(见附图2-4)。

3.重组蛋白angp的分离纯化

a.chealtingsepharose4bfastflow层析

由于重组蛋白(histag)6-柔性连接肽-cdb-intein-angp在成熟肽angp的n末端具有his-tag，其可与nⁱ²⁺特异性结合，柱上通过改变溶液ph值，诱导intein发生自切割，切除his-tag，释放目的蛋白angp，所以采用chelatingsepharosefastflow柱层析对样品进行初步分离，纯化出目的蛋白。

细胞破碎上清液上样至起始缓冲液平衡好的chelatingsepharosefastflow层析柱，然后用起始缓冲液洗涤不能吸附于柱上的蛋白。用a溶液除去内毒素，然后用b溶液除去a溶液，最后用起始缓冲液洗至基线。用剪切缓冲液(ph6.5)平衡ni柱，至流出液ph值与剪切缓冲液一致后，常温下静置ni柱16～24hr，诱导内含肽蛋白intein发生自剪切。对目的蛋白采用咪唑浓度梯度洗脱。用15％sds-page对层析结果进行检测分析(附图2-5)。

b.spsepharosefastflow离子交换层析

利用spsepharosefastflow将经过chelatingsepharosefastflow柱层析所获得的咪唑峰进一步分离纯化，先采用ph值逐渐升高的方法去除杂蛋白，再通过盐浓度升高的梯度洗脱目标蛋白，附图2-6中目标蛋白在盐浓度梯度洗脱中出现在(a)-c2峰中。

c.q-sepharosefastflow层析图谱

经spsepharosefastflow柱层析洗脱组分c2经q-sepharosefastflow柱层再次分离纯化，通过提高盐浓度梯度洗脱目的蛋白，目的蛋白集中在附图2-7中c2-2组分中，且目标重组蛋白达到电泳纯。

2.5重组蛋白angp镇痛活性检测

采用小鼠醋酸扭体法。取昆明种小鼠雌雄各半，体重18g～22g，随机分组，每组18～20只，给药组尾静脉注射一定剂量样品，对照组尾静脉注射0.2ml生理盐水。20分钟后按0.1ml/10g体重腹腔注射0.8％(w/w)冰醋酸溶液，致使小鼠产生“扭体反应”(腹部内凹，躯干与后腿伸张、臀部高起)。从小鼠第一次扭体开始计算时间，统计10分钟内的扭体次数；若5分钟内小鼠没有扭体，则5分钟后开始计时，计数小鼠在随后10分钟内的扭体次数。取平均值作为该组小鼠的扭体数。按下列公式计算各给药组小鼠的扭体反应抑制率：

蝎毒活性肽angp具有较好的镇痛活性，经小鼠醋酸扭体实验表明，利用该载体表达的蛋白与野生型蛋白在活性上相当，没有显著性差异，见表2-1。说明该载体表达的蛋白保持自身的结构和活性。

表2-1.在醋酸扭体模型中获得的重组rangp和天然angp的镇痛活性

^a抑制率为(t0-tx)/t0×100％,t0为空白组扭体次数均值，tx为实验组扭体次数均值^b相对活性为tr/tm×100％,tr为阳性组扭体扭体抑制率，tm为实验组扭体抑制率，*和空白比对显著性差异(0.05level.n＝18,p<0.05vsns)

本实例中采用的限制性核酸内切酶为bspi、bamhi，宿主菌为bl21(de3)，所获得的目的蛋白的前端连有i复合体蛋白。并与proh-柔性连接肽-(histag)6非融合表达。利用该载体表达目的蛋白angp，实现了其原核可溶性表达，利用亲和层析等方法，可实现了angp快速、高纯度的分离，采用自我切割的策略，低成本切除亲和标签，获得的重组活性肽活性不变，且收率为从每升发酵液中可获得约3.2mg目的蛋白。

我们针对bmkangm3、anep和lqhit2等蝎毒素和芋螺毒素也做了同样的实验，结果表明均可实现这些富含二硫键的多肽原核可溶性表达，分离纯化的收率在2.5-3.5mg/发酵液。