利用CRISPR-Cas9系统构建的敲除IFN-β基因的293T细胞系的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种利用CRISPR-Cas9系统构建的敲除IFN-β基 因的293T细胞系。
【背景技术】
[0002] 293T细胞由293细胞衍生而出，293细胞是转染腺病毒ElA基因的人肾上皮细 胞系，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。用 Ca3(PO4)2转染效率可高达50%。蛋白表达水平高，转染后2-3天用碱性磷酸酶分析可较容 易地检测到表达的蛋白。瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外（分泌 的或膜）蛋白的便捷方式。
[0003] IFN-β是在细菌、病毒、多聚肌苷酸多聚胞苷酸（Poly 1C)、核苷酸等刺激物诱导 下，主要由成纤维细胞、白细胞等产生的一种糖蛋白。HuIFN-β的基因均定位于人第9号染 色体，HuIFN-β蛋白由166个氨基酸组成，属于糖基化蛋白，分子量约23KD，肽链中含3个 Cys，分别在17、31和141位，其中31和141位的半胱氨酸之间形成的二硫键对HuIFN-β 的生物学活性非常重要。IFN-β具有多种生物学功能，主要包括抗病毒、抑制某些细胞的 生长、免疫调节及抑制和杀伤肿瘤细胞的功能。IFN-β的抗病毒效果针对不同的病毒，甚 至是同一病毒的不同血清型而不同。其抗病毒的作用机理主要是通过两个方面实现：1)通 过抑制某些病毒的吸附、脱衣壳和转录、病毒蛋白合成以及成熟病毒的释放来实现其抗病 毒功能；2)通过增强自然杀伤NK细胞，单核巨噬细胞对病毒的吞噬作用来实现其抗病毒功 能。IFN-β还可以抑制某些细胞的生长，如成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞以及造血细胞 的增殖，其机理可能是通过使细胞分裂停留在G0/G1期，降低DNA的合成，下调细胞原癌基 因的转录水平，下调某些生长因子受体表达。IFN- β还具有免疫调节作用，包括促进大多数 细胞MHC-I类抗原的表达，活化NK细胞和杀伤性T淋巴细胞增强巨噬细胞的功能，调节Τ、 B淋巴细胞的功能。IFN-β可抑制和杀伤肿瘤细胞，主要是通过促进机体的免疫功能，提高 巨噬细胞、NK细胞和CT L的杀伤水平。
[0004] CRISPR-Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALEN技术之后迅速发展起来的第三代基 因组编辑技术，该技术来源于细菌和古细菌中存在抵抗噬菌体入侵的CRISPR-Cas获得性 免疫系统，经人工改造而逐渐发展起来。CRISPR是指规律成簇间隔短回文重复序列，Cas是 指CRISPR相关蛋白。CRISPR-Cas基因组编辑技术是通过一段RNA来识别打靶位点，通过 Cas核酸内切酶对打靶位点附近的核酸进行切割来实现对基因组的定点编辑，因此该技术 也叫做RNA指导的核酸内切酶技术。与ZFN和TALEN技术相比，CRISPR-Cas基因组编辑技 术在设计、合成与阳性克隆的筛选上都更为便捷，而且可以实现同时在一个细胞内对多个 位点进行编辑，提高基因编辑的效率。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种敲除IFN- β基因的293T细胞系。
[0006] 本发明所提供的敲除IFN-β基因的293Τ细胞系具体为人胚肾细胞 293T-K〇-IFN-f3，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为 CGMCC No. 10096。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种基于CRISPR-Cas9构建敲除IFN-β基因的293T 细胞系的方法。
[0008] 本发明所提供的基于CRISPR-Cas9构建敲除IFN-β基因的293T细胞系的方法， 是以序列表中序列1所示IFN-β基因序列中符合5'-GG-18N-NGG-3'或5'-GG-20N-NGG-3' 或5' -CCN-18N-CC-3'或5' -CCN-20N-CC-3'序列排列规则的序列中的"18N"或"20N"所 示序列为靶序列的；N为A或T或C或G。其中，18N为18个脱氧核糖核苷酸，20N为20个 脱氧核糖核苷酸.
[0009] 所述靶序列可为1-2个；当所述靶序列为2个时，2个所述靶序列之间的间隔优选 为大于200bp。
[0010] 在本发明的一个实施例中，所述靶序列为序列表中序列1所示IFN-β基因序列的 第216-235位，（记为靶序列1);在本发明的另一个实施例中，所述靶序列为序列表中序列 1所示IFN-β基因序列的第545-562位（记为靶序列2)。
[0011] 更加具体的，所述方法为如下（A)或（B):
[0012] (A)包括如下步骤（al)-(a4):
[0013] (al)合成名称为正向单链DNAl和名称为反向单链DNAl的两个单链DNA ;所述正 向单链DNAl的序列如序列表中序列2所示，为在所述靶序列1的5'端加上ACCG ;所述反 向单链DNAl的序列如序列表中序列3所示，为在所述靶序列1的反向互补序列的5'端加 上 AAAC ;
[0014] (a2)将所述正向单链DNAl和所述反向单链DNAl进行退火反应，得到双链 DNAl (特异于靶序列1)，该双链具有粘末端，其粘末端与BsaI酶切后的pGL-U6-gRNA质粒 的酶切位点互补，可直接进行连接反应；
[0015] (a3)将所述双链DNAl连接到pGL-U6-gRNA质粒的限制性内切酶BsaI的切割位点 处，得到的重组质粒记为pGL-U6-gRNA-IFN|3 -1 ;
[0016] (a4)将所述 pGL_U6-gRNA_IFN β-I (Puromycin 抗性）和 Cas9 质粒（Blasticidin 抗性），共转染293T细胞，用Puromycin (3ug/ml)和Blasticidin (3ug/ml)进行抗性筛选， 筛选时间为7天，然后换为正常的DMEM培养基，从转染后的293T细胞中获得IFN-β基因 被敲除的293Τ细胞系；
[0017] (B)包括如下步骤（bl)-(b4):
[0018] (bl)合成名称为正向单链DNA2和名称为反向单链DNA2的两个单链DNA ;所述正 向单链DNA2的序列如序列表中序列4所示，为在所述靶序列2的反向互补序列的5'端加 上ACCG ;所述反向单链DNA2的序列如序列表中序列5所示，为在所述靶序列2的5'端加 上 AAAC ;
[0019] (b2)将所述正向单链DNA2和所述反向单链DNA2进行退火反应，得到双链 DNA2 (特异于靶序列2)，该双链具有粘末端，其粘末端与BsaI酶切后的pGL-U6-gRNA质粒 的酶切位点互补，可直接进行连接反应；
[0020] (b3)将所述双链DNA2连接到pGL-U6-gRNA质粒的限制性内切酶BsaI的切割位点 处，得到的重组质粒记为pGL-U6-gRNA-IFN|3 -2 ;
[0021] (b4)将所述 pGL_U6-gRNA_IFN β-2 (Puromycin 抗性）和 Cas9 质粒（Blasticidin 抗性），共转染 293T 细胞，用 Puromycin (3 μ g/ml)和 Blasticidin (3 μ g/ml)进行抗性筛 选，筛选时间为7天，然后换为正常的DMEM培养基，从转染后的293T细胞中获得IFN- β基 因被敲除的293Τ细胞系；
[0022] 在所述方法的步骤（a2)和（b2)中，所述退火反应的条件均可为：97°C作用7min， 然后关机，自然降温lh。
[0023] 在所述方法的步骤（a4)和（b4)中，将所述pGL-U6-gRNA-IFN β -1 (或所述 pGL-U6-gRNA-IFN β -2)和 Cas9 质粒共转染 293Τ 细胞时，所述 pGL-U6-gRNA-IFN β -1 (或所 述pGL-U6-gRNA-IFN0-2)和所述Cas9质粒的质量比可为1:1。
[0024] 利用所述方法制备得到的IFN- β基因被敲除的293T细胞系也属于本发明的保护 范围。
[0025] 所述IFN-β基因被敲除的293Τ细胞系具体为所述人胚肾细胞 293T-KO_IFN-0 CGMCC No. 10096。
[0026] 本发明的第三个目的是提供一种成套质粒。
[0027] 本发明所提供的成套质粒由所述pGL-U6-gRNA-IFNf3_l