缺失phoP的鸭疫里默氏杆菌CH1减毒菌株及构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及缺失#〇扣勺鸭疫里默氏杆菌CHl减毒菌 株及构建方法。
【背景技术】
[0002] 鸭疫里默氏杆菌RA)主要引起传染性楽膜炎，侵 害包括雏鸭、鹅等多种禽类，表现为急性或慢性、败血性、接触性传染病。在我国主要流行血 清型有血清1型，2型和10型。鸭传染性浆膜炎主要在10-35日龄的雏鸭发病，发病率可 达90 %以上，死亡率为5 % -75 %，耐过鸭导致动物出现生长缓慢，给养殖业造成了巨大的 经济损失。目前，鸭疫里默氏杆菌病的防治主要依靠抗生素治疗，然而随着多种药物耐药性 的不断增加以及对食品安全性等问题的考虑，疫苗免疫是控制疫病发生与传播的最经济、 最有效的手段。国内对于灭活疫苗的研究较多，如鸭传染性浆膜炎灭活苗、鸭疫里默氏杆菌 和大肠杆菌蜂胶二联灭活苗、鸭疫里默氏杆菌多价灭活苗研制等，而且市场上已经有针对 血清1型，2型和10型的灭活疫苗在销售。而这些疫苗存在缺陷：如应用比较广泛的油乳 剂灭活苗无法提供完全保护（70%左右的保护率）且存在注射吸收不理想，毒株覆盖不完全 等问题，研制新的、高效、覆盖多种血清型的鸭传染性浆膜炎疫苗成为我国养禽业发展的迫 切需求。
[0003] 位于膜上的遲白构成双组分调节系统，参与一系列生物学过程，包括 调控毒力基因的表达、增强细菌对多种限制性生长环境，如低Mg2+、低酸、氧化物、金属离 子、盐的的适应能力、激活广谱抗生素的耐药性、增强细菌的免疫逃避能力，如因激 活的可以裂解α-螺旋的多肽C18G。而在鸭疫里默氏杆菌中全局调控基因开究 尚未见报道。现有技术也没有报道通过对# 〇用女造是否可以获得减毒菌株。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一是提供一株缺失#0/?勺鸭疫里默氏杆菌CHl减毒菌株，该减毒 菌株敲除了 #0/?因片段；所述因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，该减 毒菌株的分类命名为/PieffiereJ7a aflaiipesii/er CHlA/7Α0Λ保藏于武汉市武昌洛珈山的 中国典型培养物保藏中心（武汉大学），保藏号为CCTCC M 2014557,保藏时间为2014年11 月07日。
[0005] 所述减毒菌株中的因片段由冲％抗性基因所替代。
[0006] 所述壮观霉素抗性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0007] 本发明的目的之二是提供缺失#0/?勺鸭疫里默氏杆菌CHl减毒菌株的构建方法。 该方法包括如下步骤： 1) 构建重组自杀质粒pREl 12- Δ : 2) 将步骤1)所得重组自杀质粒转化入到x7213大肠杆菌中； 3) 将步骤2)中含有重组质粒的x7213大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌CHl菌自然结合，使 同源臂导入鸭疫里默氏杆菌CHl菌的基因组中，经过同源臂交换和壮观霉素抗性筛选得到 阳性克隆； 4)通过PCR筛选得到缺失因的鸭疫里默氏杆菌CHl减毒菌株。
[0008] 所述步骤3)中，将含有重组质粒的X7213大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌CHl菌自 然结合时，具体的结合步骤为：分别将含有重组质粒X7213菌株与 鸭疫里默氏杆菌CHl培养至OD6qq=O. 6-0. 8,按体积比3:2的比例，在固体平板培养基上混 合，37°C下，于5% C02培养箱中培养18-24h，将菌苔刮下，划线于含有50μ g/ml的和 150 μ g/m的的胰蛋白大豆肉汤固体平板培养基上进行培养，挑取生长的单菌落。
[0009] 所述步骤4)中，PCR筛选的步骤为： (1) 鸭疫里默氏杆菌CHl保守序列引物 F ： CATGCCATGGTGAGACAACTTAAAATTACC R ：CGCGGATCCTTTTCCTAAATAAGACTTC PCR扩增鸭疫里默氏杆菌CHl的特异性基因的864bp片段，判定候选突变株是否为鸭疫 里默氏杆菌CHl ; (2) 以抗性基因的引物 Spec-F ：GCACCTGCAGGGACCAGCCAGGACAGAAA Spec-R ：ATGCGGCCGCCCACGTCAAATAATCAAGGCG 扩增抗性片段的1185bp片段，判断是否发生基因的替换； (3) 以引物 phoP-up-F ：ACAGGAAATAGATAAACAAG phoP-down-R ：GGCCAAGATGATACATCAACG 进行扩增以检测替换片段是否正确； (4) 以引物 phoP-F:CATGCCATGGTGCAAAAAATATTAATTG phoP-R:CGCGGATCCTTTTTTAACAAAGTTGGAA 扩增目的基因以检测是否#〇/^是否被缺失。
[0010] 所述重组自杀质粒PRE112- : 的构建方法，包括如下步骤： 因的左右同源臂的引物设计： phoP-up-F ：ACAGGAAATAGATAAACAAG phoP-up-R ：CCTGCAGGATTGCGGCCGCAGAACAAAGATAGTTATATTT phoP-down-F ：GCGGCCGCATCCCTGCAGGTAACAAGAGAAATATTAGCC phoP-down-R ：GGCCAAGATGATACATCAACG 2) 以鸭疫里默氏杆菌CHl全基因组作为模板，分别对phoP基因的左右臂进行PCR扩 增，回收产物用引物phoP-up-F和phoP-down-R进行扩增，得到左右同源臂产物； 3) 利用加 A试剂盒对同源臂末端进行加 A处理，然后与用AhdI限制性内切酶处理的 PRE112自杀质粒产物进行连接，将连接产物转入汰肠杆菌感受态中； 4) 将步骤3)所得C7232大肠杆菌摇菌培养至对数期，进行质粒抽提，得到重组质粒 pRE112-/7Ao/*;在 phoP-up-R 和 phoP-down-F 引物间引入 NotI 和 SbfI 酶切位点； 5) 抗性基因的引物设计 spec-F ：GCACCTGCAGG GACCAGCCAGGACAGAAA Spec-R ：ATGCGGCCGCCCACGTCAAATAATCAAGGCG ； 将抗性基因的引物进行PCR扩增，PCR扩增片段回收后用NotI和SbfI进行 双酶酶切，再与经NotI和SbfI双酶酶切处理的pRE112-A#o/^接，得到重组质粒 pREl 12- Δ :
[0011] 所述重组自杀质粒pREm-A/^o/7: 的构建方法的步骤2)中，对phoP基因 的左右臂进行PCR扩增时，具体PCR扩增条件为：先于94°C变性2 min，经98°C变性10s、 55°C退火10s、72°C延伸15s，循环扩增35次，再于72°C延伸lOmin。
[0012] 所述步骤5)重组自杀质粒pREld/^o/7: 的构建方法的步骤2)中，对spec 抗性基因的引物进行PCR扩增时，具体PCR扩增条件为：先于94°C变性2min，经98°C变性 10s、55°C退火10s、72°C延伸20s循环扩增35次，再于72°C延伸IOmin。
[0013] 由于口1^112-八/7力〇/?::5776^重组质粒不能在狀中复制存活，将转入有重组质粒的 C7213菌株与RA结合，使同源片段导入RA基因组中，利用壮观霉素抗性筛选得到阳性克隆。 再利用PCR方法鉴定得到突变株。
[0014] 药敏试验表明鸭疫里默氏杆菌CHl菌株天然就对很多抗生素不敏感，利用壮观霉 素抗性基因片段进行重组质粒的构建，具有较好效果。
[0015] 本发明的第三个目的是提供该减毒菌株在疫苗上的应用。
[0016] 本发明的有益效果： 1、目前，对鸭疫里默氏菌的毒力因子认识较少，用于构建鸭疫里默氏菌减毒菌株的方 法十分有限，本发明通过敲除鸭疫里默氏菌中的因，成功构建了缺失因的鸭 疫里默氏杆菌CHl的减毒菌株。
[0017] 2、本发明构建的减毒菌株可用于鸭疫里默氏杆菌基因减毒疫苗，用于研制预防多 个血清型的鸭疫里默氏杆菌的感染或者作为疫苗载体。
[0018] 3、本发明构建的减毒菌株可用于对鸭疫里默氏杆菌基因调控网络的构建，为后续 研究奠定基础。
【附图说明】
[0019] 图1 :是本发明中用于构建鸭疫里默氏杆菌杆菌因突变株示意图，图中， PhoP :鸭疫里默氏杆菌CHl #0/?因，B739-2186 :鸭疫里默氏杆菌CHl #0/?因上游邻 近的读码框，B739-2188 :鸭疫里默氏杆菌因下游邻近的读码框； 图2 :为重组质粒pREld/^o/7: : spec质粒图谱； 图3 :为鸭疫里默氏杆菌变株构建鉴定，其中1为保守序列扩增，2为壮观霉素 抗性片段扩增，3为的基因扩增，4为ph〇P-up-F/ph〇P-up-R扩增野生株替换片段全 长； 图4 :为鸭疫里默氏杆菌亲本株生长曲线图，其中，RA-CHl为野生株， RA-CHl Λ为本发明减毒菌株； 图5 :是本发明中鸭疫里默氏杆菌突变株对鸭胚成纤维细胞侵袭力和粘附力的结果； 其中，左侧Adherence代表粘附力实验，右侧invasion代表侵袭力实验，RA-CHl为野生株， RA-CHl Λ #0/?本发明减毒菌株； 图6 :为鸭疫里默氏杆菌突变株及亲本株在动物机体组织载量测定，其中，左侧Liver 代表是本发明减毒菌株RA-CHl 其亲本株在接种后12h、24h肝脏中细菌组织载 量，右侧Brain代表是RA-CHl 其亲本株在接种后12h、24h大脑中细菌组织载量， phoP-12h和phoP-24分别为本发明减毒菌株接种12h和24h的载量，RA-12h和RA-24h分 别为亲本株接种12h和24h的载量； 图7 :是本发明中不同剂量鸭疫里默氏杆菌突变株对试验动物生长的影响情况。其中 1 (phop-Ι)为免疫剂量6. I X IO9CFU组，2 (phop-2)为免疫剂量6. I X IO8CFU组，对照组1 为不免疫不攻毒，对照组2为不免疫但用10XLD5tl攻毒组。
【具体实施方式】
[0020] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0021] 实施例1 鸭疫里默氏杆菌（RA-CHl)减毒菌株的制备： 所述的鸭疫里默氏杆菌为四川农业大学禽病中心实验室保存（RA-CH1)，所述的沙门氏 菌为鼠伤寒沙门氏菌UK-I 大肠杆菌为大肠杆菌工程菌，如c7232，c7213，c6212 等。
[0022] 第一步，鸭疫里默氏杆菌血清I (RA-CHl)潜在因功能鉴定，根据鼠伤