一株鸭疫里默氏杆菌ch1减毒菌株及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株鸭疫里默氏杆菌CHl减毒菌株及其 构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 鸭疫里默氏杆菌RA)引起的一种主要侵害雏鸭、 雏火鸡、鹅等多种禽类的急性或慢性、败血性、接触性传染病。在我国，其流行毒株包含有 血清1型，2型和10型。该病以10-35日龄的雏鸭发病较多，发病率可达90%以上，死亡 率为5% -75%，每年均给养殖业造成了巨大的经济损失。目前，鸭疫里默氏杆菌病的防治 主要依靠抗生素治疗，然而随着多种药物耐药性的不断增加以及对食品安全性等问题的考 虑，疫苗免疫是控制疫病发生与传播的最经济、最有效的手段。国内对于灭活疫苗的研究较 多，如鸭传染性浆膜炎灭活苗、鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌蜂胶二联灭活苗、鸭疫里默氏杆 菌多价灭活苗研制等，而且市场上已经有针对血清1型，2型和10型的灭活疫苗在销售。而 这些疫苗存在缺陷：如应用比较广泛的油乳剂灭活苗无法提供完全保护（70%左右的保护 率）且存在注射吸收不理想，毒株覆盖不完全等问题，研制新的、高效、覆盖多种血清型的鸭 传染性浆膜炎疫苗成为我国养禽业发展的迫切需求。
[0003] cr/7基因编码合成的cAMP受体蛋白与cja (adenylate cyclase)编码的腺苷酸 环化酶都是细菌重要的毒力调控蛋白，它主要参与调控细菌的碳水化合物和氨基酸代谢， 并会影响菌毛与鞭毛的表达。
[0004] 而在鸭疫里默氏杆菌中全局调控基因 Ci7T研究尚未见报道，现有技术也没有报道 通过对cr/7改造是否可以获得减毒菌株。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是提供一株鸭疫里默氏杆菌CHl减毒菌株，该减毒菌株缺失了 cr/7基因片段；所述cr/7基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，该减毒菌株的分类命 名为沿61?6?/-61^7<3 <3/7<3〇>61>5以/19_/'011八^/77，保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型 培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO :M 2014556,保藏时间为2014年11月07日。
[0006] 所述减毒菌株中的Ci7T基因片段由抗性基因所替代。
[0007] 所述壮观霉素抗性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0008] 本发明的目的之二是提供一种鸭疫里默氏杆菌CHl减毒菌株的构建方法。该方法 包括如下步骤： 1) 构建重组自杀质粒pREl 12- Δ Cr/?: : 2) 将步骤1)所得重组自杀质粒转化入到x7213大肠杆菌中； 3) 将步骤2)中含有重组质粒的x7213大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌CHl菌自然结合，使 同源臂导入鸭疫里默氏杆菌CHl菌的基因组中，经过同源臂交换和壮观霉素抗性筛选得到 阳性克隆； 4)通过PCR筛选得到缺失cr/τ基因的鸭疫里默氏杆菌CHl减毒菌株。
[0009] 所述步骤3)中，将含有重组质粒的X7213大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌CHl菌自 然结合时，具体的结合步骤为：分别将含有PRE112-A cr/7: : 5/7%重组质粒x7213菌株与 鸭疫里默氏杆菌CHl培养至OD6qq=O. 6-0. 8,按体积比3:2的比例，在固体平板培养基上混 合，37°C下，于5% C02培养箱中培养18-24h，将菌苔刮下，划线于含有50 μ g/ml的和 150 μ g/m的的胰蛋白大豆肉汤固体平板培养基上进行培养，挑取生长的单菌落。
[0010] 所述步骤4)中，PCR筛选的步骤为： (1) 鸭疫里默氏杆菌CHl保守序列引物 F ：AGAAGATTTTAAGGCGGAG R：GGCTTCTGATTGATTTCC PCR扩增鸭疫里默氏杆菌CHl的特异性基因的1514bp片段，判定候选突变株是否为鸭 疫里默氏杆菌CHl ; (2) 以抗性基因的引物 Spec-F ：GCACCTGCAGGGACCAGCCAGGACAGAAA Spec-R ：ATGCGGCCGCCCACGTCAAATAATCAAGGCG 扩增抗性片段的1185bp片段，判断是否发生基因的替换； (3) 以引物 crp-up-F ：GATTGATATCTTTGAGGCTT crp-down-R ：ATTACAGGAATACCTGCATTG 进行扩增以检测替换片段是否正确； (4) 以引物 crp-F: CATGCCATGGTGTTTGAAAAACAGTT crp-R: CGCGGATCCAGAAACCACATGTCCTACTT 扩增目的基因以检测是否cr/7是否被缺失。
[0011] 所述重组自杀质粒PRE112-A Cr/?: 的构建方法，包括如下步骤： 1) cr/7基因的左右同源臂的引物设计： crp-up-F ：GATTGATATCTTTGAGGCTT crp-up-R ：CCTGCAGGGATGCGGCCGCTTAACTGATATTTATCAGCA crp-down-F ：GCGGCCGCATCCCTGCAGGTAAATTTTTAATGAAGTAAAAAT crp-down-R ：ATTACAGGAATACCTGCATTG 2) 以鸭疫里默氏杆菌CHl全基因组作为模板，分别对cr/7基因的左右臂进行PCR扩增， 回收产物用引物crp-up-F和crp-down-R进行扩增，得到左右同源臂产物； 3) 利用加 A试剂盒对同源臂末端进行加 A处理，然后与用AhdI限制性内切酶处理的 PRE112自杀质粒产物进行连接，将连接产物转入c7232大肠杆菌感受态中； 4) 将步骤3)所得C7232大肠杆菌摇菌培养至对数期，进行质粒抽提，得到重组质粒 pRE112_crp ;在 crp-up-R 和 crp-down-F 引物间引入 NotI 和 SbfI 酶切位点； 5) 抗性基因的引物设计 spec-F ：GCACCTGCAGGGACCAGCCAGGACAGAAA Spec-R ：ATGCGGCCGCCCACGTCAAATAATCAAGGCG ； 将抗性基因的引物进行PCR扩增，PCR扩增片段回收后用NotI和SbfI进 行双酶酶切，再与经NotI和SbfI双酶酶切处理的pRE112-Acr/7连接，得到重组质粒 pREl 12- Δ Cr/?: :
[0012] 所述重组自杀质粒pRE112_Acrp: 的构建方法的步骤2)中，对c/77基因的 左右臂进行PCR扩增时，具体PCR扩增条件为：先于94°C变性2 min，经98°C变性10s、55°C 退火10s、72°C延伸15s，循环扩增35次，再于72°C延伸lOmin。
[0013] 所述步骤5)重组自杀质粒pRE112_A c/77: 的构建方法的步骤2)中，对spec 抗性基因的引物进行PCR扩增时，具体PCR扩增条件为：先于94°C变性2min，经98°C变性 10s、55°C退火10s、72°C延伸20s循环扩增35次，再于72°C延伸IOmin。
[0014] 由于pRE112_A Cr/?: 重组质粒不能在RA中复制存活，将转入有重组质粒的 C7213菌株与RA结合，使同源片段导入RA基因组中，利用壮观霉素抗性筛选得到阳性克隆。 再利用PCR方法鉴定得到突变株。
[0015] 药敏试验表明鸭疫里默氏杆菌CHl菌株天然就对很多抗生素不敏感，利用壮观霉 素抗性基因片段进行重组质粒的构建，具有较好效果。
[0016] 本发明的第三个目的是提供该减毒菌株在疫苗上的应用。
[0017] 本发明的有益效果： 1、 目前，对鸭疫里默氏菌的毒力因子认识较少，用于构建鸭疫里默氏菌减毒菌株的方 法十分有限，本发明通过敲除鸭疫里默氏菌中的Ci 7T基因，成功构建了缺失Ci7T基因的鸭疫 里默氏杆菌CHl的减毒菌株； 2、 本发明构建的减毒菌株可用于鸭疫里默氏杆菌基因减毒疫苗，用于研制预防多个血 清型的鸭疫里默氏杆菌的感染或者作为疫苗载体； 3、 本发明构建的减毒菌株可用于对鸭疫里默氏杆菌基因调控网络的构建，为后续研究 奠定基础。
【附图说明】
[0018] 图1 :是本发明中用于构建鸭疫里默氏杆菌杆菌cr/7基因突变株示意图，图中， crp :鸭疫里默氏杆菌CHl cr/7基因，B739-0374 :鸭疫里默氏杆菌CHl cr/7基因上游邻近的 读码框，B739-0372 :鸭疫里默氏杆菌Ci7T基因下游邻近的读码框； 图2:为重组质粒pRE112_A Cr/?: : spec质粒图谱； 图3:为利用cr/7基因上下游扩增目的基因结果图，其中1-3为cr/7突变株，4-9为未突 变株，10为鸭疫里默氏杆菌CHl阳性对照； 图4:为鸭疫里默氏杆菌cr/7突变株构建鉴定，其中1为阴性对照，2-4分别扩增鸭疫里 默氏杆菌cr/7突变株保守序列和crp-up-F/crp-up-R扩增USD替换片段全长，5为鸭疫里默 氏杆菌保守序列，6-10为crp-up-F/crp-up-R扩增野生株全长； 图5:是本发明中鸭疫里默氏杆菌突变株对鸭胚成纤维细胞侵袭力和粘附力的结果， 其中，左侧Adherence代表粘附力实验，右侧invasion代表侵袭力实验，RA CHl为野生株， RA CHl Λ cr/7为本发明减毒菌株； 图6:是本发明中不同剂量鸭疫里默氏杆菌突变株对试验动物生长的影响情况；其中1 为免疫剂量5 X IO9CFU组，2为免疫剂量5 X IO8CFU组，3为免疫剂量5 X IO7CFU组；对照组 1为不免疫不攻毒，对照组2为不免疫但用10XLD5tl攻毒组。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0020] 实施例1 鸭疫里默氏杆菌（RA-CHl)减毒菌株的制备： 所述的鸭疫里默氏杆菌为四川农业大学禽病中心实验室保存（RA-CH1)，所述的沙门氏 菌为鼠伤寒沙门氏菌UK-I (c3761)，大肠杆菌为大肠杆菌工程菌，如c7232，c7213，c6212 等。
[0021] 第一步，鸭疫里默氏杆菌血清I (RA-CHl)潜在Ci7T基因功能鉴定，根据鼠伤寒沙 门氏菌UK-I菌株中cr/7序列利用BLASTP进行对比发现RA-CHl中存在两个潜在的cr/7基 因序列，将其命名为c/T?7与c/77J。设计引物： crpl% ： crpl-F ： CATGCCATGGTGTTTGAAAAACAGTT crpl-R ： CGCGGATCCAGAAACCACATGTCCTACTT crp2% ： crp2~V ：CATGCCATGGTGGAAAAGGAA