Csfv、prrsv和siv h1亚型的三重荧光rt-pcr检测试剂盒及引物、探针的制作方法
【专利摘要】本发明目的是提供一种针对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光RT?PCR检测试剂盒及引物、探针。本发明的第一个目的是提供猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光定量RT?PCR检测试剂盒；本发明的第二个目的是提供猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的检测引物和探针；本发明的第三个目的是提供猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光定量RT?PCR检测方法。本发明实现在猪中对上述3种病原的快速早期鉴别诊断，由于引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，提高了早期鉴别检测效率，并简化了检测方法。
【专利说明】
CSFV、PRRSV和SIV H1亚型的三重荧光RT-PCR检测试剂盒及引 物、探针
技术领域
[0001 ]本发明目的是提供一种针对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1 亚型的三重荧光RT-PCR检测试剂盒及引物、探针。
【背景技术】
[0002] 猪痕病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是ssRNA病毒，黄病毒科痕病毒 属，病毒粒子呈圆形，其RNA为单股正链。猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)为动脉炎病毒属，病毒粒子呈球型，是一种有囊 膜的单股正链RNA病毒。猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)H1亚型为正黏病毒科甲 型流感病毒，病毒粒子多形性，有囊膜，基因组为分节段单股负链RNA。以上三种病原均为 RNA病毒，均会造成养猪业巨大经济损失，引起的临床症状有类似之处，甚至有可能同时混 合感染，但不同病原感染引起的危害性、流行性及其防控措施截然不同。因此，建立一种区 分三种病原的检测方法非常重要，准确灵敏的检测方法能有效防止疾病的传播，减少经济 损失。
[0003] ELISA、RT-PCR等免疫学和分子生物学检测方法已经应用在上述疫病的诊断中，但 目前主要用于单一病原的检测，其灵敏性、特异性和简便性等方面均有待进一步提高，普通 RT-PCR检测结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作繁琐。本发明采用三重荧光RT-PCR检测方法能够同时检测区分这三种病毒，不但可提高灵敏性、特异性和简便性等，还可 节约大量时间和成本。
[0004] 上述3种病原都可以通过在保守区域设计特异性引物和探针，进行荧光RT-PCR检 测。荧光实时定量PCR(Real-time PCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团标记的探针，利用 荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对结果进行分析。Allglo?探针是 美国AlleLogic Biosciences公司推出的最新一代焚光定量探针，它打破传统Taqman探针 的一端报告基团一端粹灭基团的限制，其最大优势是探针两端标记同样的荧光基团，探针 在水解之前荧光基团互相淬灭，水解后均为报告发光基团，大大提高探针的荧光强度和灵 敏性，Allglo?探针染料上面含有特殊的能提高Tm值的化学基团（BGB)，可以大大提高探针 特异性。多重荧光定量PCR技术是指在同一个荧光定量PCR扩增试验中同时扩增多个目的基 因。在多重定量应用领域，Allglo?探针避免了TaqMan探针相互抑制的问题，探针染料采用 比较容易酶切的化学基团，多条Allglo?探针在一个反应体系中相互干扰非常小，使一个荧 光反应检测多种病原微生物的效果非常好。根据该原理设计特异性多重荧光探针，常用的 荧光基团有MAR、JUP、URA等，可通过不同的荧光检测通道，同时检测多种荧光信号。由于该 方法引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增 强，从而避免了其他检测方法特异性不高且容易漏检的问题。
【发明内容】
[0005] 为了实现同步检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒HI亚型，本 发明的第一个目的是提供猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重 荧光定量RT-PCR检测试剂盒;本发明的第二个目的是提供猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征 病毒和猪流感病毒H1亚型的检测引物和探针;本发明的第三个目的是提供猪瘟病毒、猪繁 殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光定量RT-PCR检测方法。本发明实现在 猪中对上述3种病原的快速早期鉴别诊断，由于引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，提 高了早期鉴别检测效率，并简化了检测方法。
[0006] 为了实现上述的第一个目的，本发明采用的技术方案是：
[0007] 猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光RT-PCR检测 试剂盒，该试剂盒包括脱氧三磷酸核苷混合物、逆转录酶M_MLV、MgCl 2、DNA聚合酶、特异性 引物和焚光探针、阳性参考品、阴性参考品，所述的特异性引物和A1 lglo焚光探针序列如 下：
[0017] 对于脱氧三磷酸核苷混合物、MgC12、DNA聚合酶等，这些组分对于本领域技术人员 来说
[0018] 属于公知常识，可根据需要选用。
[0019] 作为优选，猪瘟病毒阳性参考品的序列：
[0021]猪繁殖与呼吸综合征病病毒阳性参考品的序列：
[0023]猪流感病毒H1型阳性参考品的序列：
[0025]为了实现上述的第二个目的，本发明采用的技术方案是：
[0026] 猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光RT-PCR检测 用特异性引物和Allglo荧光探针序列，所述的特异性引物和Allglo荧光探针序列如下：
[0036]为了实现上述的第三个目的，本发明采用的技术方案是：
[0037] 猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光RT-PCR检测 方法，所述方法如下：
[0038] 1)提取待测样品RNA，该步骤所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用上海辉 睿生物科技有限公司的柱法核酸抽提试剂盒或其它试剂盒说明书进行提取；
[0039] 2)以待测样品RNA为模板，RT-PCR缓冲液为HR One-step qPCR Master Mix缓冲 液；
[0040] 特异性引物和荧光探针序列如下：
[0050] 3)对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判 断结果。
[0051 ] 4)所述荧光定量RT-PCR反应条件为：50°C 30min，95°C 5min，然后95°C 10s，55°C 40s，在55 °C进行三重荧光检测，共进行40个循环。
[0052]本发明涉及猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型特异性引物 和探针。基于具有高度特异性的猪瘟病毒5'非编码区基因序列（基因序列号:JX262391)、猪 繁殖与呼吸综合征病毒基因0RF2基因（基因序列号：处771746)、猪流感病毒!11亚型 hemagglutinin(HA)基因（基因序列号:KR074351)分别设计各自的引物和探针，并在3个探 针上标记了不同的荧光信号，在优化了PCR反应体系的条件下，实现三重荧光定量PCR同步 检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型。由于该3种病原体的核酸均 为RNA，因此，不仅可实现RNA同步提取，也可以进行荧光RT-PCR同步检测，大大简化了检测 方法。由于该方法引入了高特异性扩增引物和不同荧光标记的探针，确保了本方法能快速、 特异和灵敏的一次性鉴别检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型， 可提高早期检出率，有效防止疾病的传播，减少经济损失。
【附图说明】
[0053]图1为本发明试剂盒测定猪瘟病毒的灵敏度图。
[0054]图2为本发明试剂盒测定猪繁殖与呼吸综合征病毒的灵敏度图。
[0055]图3为本发明试剂盒测定猪流感病毒H1亚型的灵敏度图。
[0056]图4为同时测定猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒H1亚型的测定 图。
【具体实施方式】
[0057]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0058] 实施例1:样本准备和病毒RNA的提取：
[0059]无菌采集猪鼻腔拭子、咽喉拭子、血液以及内脏器官（如:脾、气管、肺、淋巴结、扁 桃体、肾脏、脾脏等），置于含抗菌素的PBS液中，密闭运输，低温保存，备用。病毒RNA的提取 采用上海辉睿生物科技有限公司的柱式核酸抽提试剂盒，按试剂盒说明书提取。
[0060] 实施例2:引物与探针
[0061] 从NCBI基因库上下载世界各地的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流感病 毒H1亚型基因序列，对其进行了同源性比较。基于具有高度特异性的猪瘟病毒5'非编码区 基因序列（基因序列号:JX262391)、猪繁殖与呼吸综合征病毒基因0RF2基因（基因序列号： KP771746)、猪流感病毒H1亚型hemagglutinin(HA)基因（基因序列号:KR074351)，用生物信 息学方法根据引物设计原则，并利用Primer Express设计软件，设计出扩增上述基因片段 的特异性引物和荧光探针若干组。将设计得到的引物和探针一一进行BLAST验证(http:// blast .ncbi .nlm.nih.gov/)，以保证引物的高特异性。并进一步利用DNAStar软件，验证各 引物探针间是否会产生引物二聚体等。经过上述验证，最后选择了如表1所示的引物和探 针，并在探针上分别标记不同的荧光信号，以实现3通道同步检测。
[0062]表1猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型检测的引物和 Allglo探针
[0064] F:正向引物;R:反向引物;P:探针。
[0065] 实施例3:质粒的制备
[0066]猪瘟病毒阳性参考品的序列：
[0068]猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性参考品的序列：
[0070]猪流感病毒H1型阳性参考品的序列：
[0072]按上面序列采用人工合成的方式构建相应病毒的阳性质粒，构建好后测序验证序 列的准确性，如此获得各含有一种目的片段的质粒3种。
[0073]实施例4:荧光RT-PCR反应体系和条件的优化
[0074] 试剂盒:RT reaction buffer和酶mix选用上海辉睿生物科技有限公司的HR One-step qPCR Master Mix，Code:SJ_2106A，按说明书操作，反应体系为 25μ1，其中 RT reaction buffer 7.5ul，酶mix 5ul，上游与下游引物（lOymol/L)各ΙμL，探针（lOymol/L) 〇. 5μ1，模板RNA 2-3μ1，DEPC水补足25μ1。用ABI7500荧光检测系统进行检测，反应条件为： 50 °C 30min，95 °C 5min，然后95 °C 10s，55 °C40s，在55 °C进行三重荧光检测，共进行40个循环。 结果判断：选择荧光检测模式MAR、JUP、URA，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均 值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为 阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的 反应体系中，引物浓度从0.10~Ι.ΟΟμΜ，探针浓度从0.10~0.50μΜ，采用矩阵法优选引物和 探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值（ARn)选择最佳引物和探针浓度。 [0075]实施例5:单重荧光PCR灵敏度验证
[0076]分别对上述3种病原进行荧光PCR的灵敏度验证。单重荧光PCR反应体系如下:其中 RT reaction buffer 7.5ul，酶mix 5ul，上游与下游引物（ΙΟμ mol/L)各ΙμL，探针（ΙΟμ mol/ L)0.5yl，上述实例3中的质粒取lul (各个浓度梯度的质粒含量如表2所示），不足的体积用 水补足至25ul。用ABI7500荧光检测系统进行检测，反应条件为：50 °C 30min，95 °C 5min，然后 95°C10s，55°C40s，在55°C进行三重荧光检测，共进行40个循环。各个单重PCR的结果如表2 所示。一般认为Ct值小于等于35时，得到的阳性结果比较可靠。由此判断，CSFV、PRRSV、SIV 引物和探针的检测灵敏度均为〇. 〇〇〇25ngAU。
[0077]表2单重荧光PCR灵敏度验证的检测结果 [0078]
[0079]所有实验取重复3次的平均值;Undet. :Ct值低于检测限。
[0080] 实施例6:多重荧光PCR灵敏度验证
[0081] 比较了三重荧光反应时，各引物探针的检测灵敏度。反应体系和反应程序如实例5 所示，即各引物浓度相同，各探针浓度也相同。在三种质粒(实例3中获得)浓度为1:1:1时， 三重荧光PCR反应对三种物质检测灵敏度如表3所示，即对CSFV、PRRSV和SIV的灵敏度均达 到0.0025ngAU。
[0082] 表3三重荧光PCR灵敏度验证的检测结果
[0083]
[0084] 所有实验取重复3次的平均值;Undet: Ct值低于检测限。
【主权项】
1. 猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒HI亚型的三重荧光RT-PCR检测试 剂盒，其特征在于该试剂盒包括脱氧三磷酸核苷混合物、逆转录酶M_MLV、MgCl 2、DNA聚合 酶、特异性引物和荧光探针、阳性参考品、阴性参考品，所述的特异性引物和Allglo荧光探 针序列如下： 猪瘟-F: GGACTAGCCRTAGTGGCGAGC 猪瘟-R: GGCATGCCCTCGTCCAC 猪瘟-P: MAR-CCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGG-MAR; 猪繁殖与呼吸综合征病毒-F: TTGTTTGGCTTCACAATCGC 猪繁殖与呼吸综合征病毒_R:GTAGAGCGCGCACGGAGTA 猪繁殖与呼吸综合征病毒-P: JUP-TTGGCTGGTGGTCTTATGCATCAGACT-JUP; 猪流感病毒 H1 型-F: GTGCTATAAACACCAGCCTYCCA 猪流感病毒 H1 型-R: CGGGATATTCCTTAATCCTGTRGC 猪流感病毒 H1 型-P: URA-CAGAATATACATCCRGTCACAATTGGARAA-URA。2. 根据权利要求1所述的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的 三重荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于猪瘟病毒阳性参考品的序列： AACGGAGGGACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGT TCGACGTGGGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACACACC； 猪繁殖与呼吸综合征病病毒阳性参考品的序列： CTCAGGGTGAACGGTAGAGCGCGCACGGAGTACCGCGGAGCAAACCAGTCTGATGCATAAGACCACCAGCCAA CCGGCGATTGTGAAGCCAAACAAAATGGGC； 猪流感病毒H1型阳性参考品的序列： ACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCAGTCACAATTGGAGAATGTCCAAAA TATGTCAAAAGCACAAAATTGAGAATGGCTACAGGACTAAGGAATATCCCGTCTATTCAAT； 猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光RT-PCR检测用特 异性引物和Allglo荧光探针序列，其特征在于所述的特异性引物和Allglo荧光探针序列如 下： 猪瘟-F: GGACTAGCCRTAGTGGCGAGC 猪瘟-R: GGCATGCCCTCGTCCAC 猪瘟-P: MAR-CCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGG-MAR; 猪繁殖与呼吸综合征病毒-F: TTGTTTGGCTTCACAATCGC 猪繁殖与呼吸综合征病毒_R:GTAGAGCGCGCACGGAGTA 猪繁殖与呼吸综合征病毒-P: JUP-TTGGCTGGTGGTCTTATGCATCAGACT-JUP; 猪流感病毒 H1 型-F: GTGCTATAAACACCAGCCTYCCA 猪流感病毒 HI 型-R: CGGGATATTCCTTAATCCTGTRGC 猪流感病毒 HI 型-P: URA-CAGAATATACATCCRGTCACAATTGGARAA-URA。
【文档编号】C12Q1/68GK105936944SQ201610260124
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】何永强, 莫虹斐, 帅江冰, 曾若雪, 门光琦, 曹爱玲, 金晨晨, 张晓峰, 李辉, 王素华, 余招锋
【申请人】浙江省检验检疫科学技术研究院