一步法反转录pcr检测和分型寨卡病毒的试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明提供一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的引物、探针及试剂盒，以及其检测方法和应用，以用于灵敏地、特异地、高效快速地同时检测和分型两种寨卡病毒基因型(亚洲型和非洲型)。本发明的设计原理在于：基于反转录PCR技术，建立一套适用于同时检测和分型两种寨卡病毒的一步法FRET?PCR系统。此系统基于寨卡病毒两种基因型以及与之同源性较高的其他相关病原体的全基因序列，选择相对保守的区间设计引物和探针，通过特异性地扩增，可以灵敏、快速地从临床样品中检测并筛选出阳性样品，进而根据高分辨率熔解曲线中熔解温度Tm值的不同，从而可信度高地区分寨卡病毒亚洲型和寨卡病毒非洲型，该试剂盒和检测方法操作便捷高效，适合于检测大量样本。
【专利说明】
一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的试剂盒及其检测 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物科学技术领域，具体涉及一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒 的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 寨卡病毒病也称寨卡热(Zika fever)，是由寨卡病毒(Zika virus，ZIKAV)引起并 通过伊蚊(主要包括埃及伊蚊Aedes aegypti，白纹伊蚊Aedes albopictus，非洲伊蚊Aedes Africana)等吸血昆虫进行传播的急性病毒性虫媒传染病。该病还可以由孕妇在怀孕或生 产过程中传播给胎儿或婴儿，或者通过性传播或输血传播。寨卡病毒感染的潜伏期约为3-12天，以发热、皮疹、剧烈关节疼痛、肌肉疼痛以及结膜炎为主要临床症状，小儿感染病例还 可出现神经系统、眼部和听力等改变，孕妇感染寨卡病毒可能导致新生儿小头畸形甚至胎 儿死亡。寨卡病毒广泛分布于非洲大陆北部以及许多东南亚国家，包括印度、马来西亚、菲 律宾、泰国、越南、巴基斯坦以及印度尼西亚，近年来在东非海岸、印度洋岛屿、美洲及加勒 比海地区岛屿流行。截至2016年1月，在非洲、亚洲、美洲以及太平洋岛屿上至少45个国家均 发现寨卡病毒传播的证据，其中在南美洲有23个国家和地区正在流行，且流行地区呈现不 断扩大的趋势，感染病例数也不断上升。截止2016年2月28日，我国已发生8例输入性寨卡病 毒感染病例。近年来，随着全球化进程的加快及全球变暖的加剧，为该病毒由流行地区向非 流行地区的传播创造了条件；同时，由于寨卡热与登革热（Dengue fever)、黄病毒热 (Yellow fever)、基孔肯雅热（Chikungunya fever)、日本脑炎（Japanese encephalitis) 的临床症状相似且传播媒介类似，使得很多寨卡热被误诊为登革热和基孔肯雅热。目前尚 无药物可以预防和治疗寨卡热。
[0003] 寨卡病毒属于黄病毒科，黄病毒属，单股正链RNA病毒。寨卡病毒全基因长度约为 11Kb，直径40~70nm，有包膜，包含10794个核苷酸，编码3419个氨基酸，寨卡病毒基因编码3 个结构蛋白：衣壳蛋白（C)、膜前体蛋白（prM)和包膜蛋白（M)，以及7个非结构蛋白（NS1， 吧2 &，吧213，吧3，吧4&，吧413和吧5)。根据分子生物学和生物信息学分析表明，寨卡病毒主要 存在两个基因型：寨卡病毒非洲型（Zika virus African genotype)和寨卡病毒亚洲型 (Zika virus Asian genotype)。目前寨卡病毒的检测方法主要有：
[0004] (1)病毒分离培养。通过从感染机体内分离得到寨卡病毒，然后将该病毒接种在 C6/36、BHK-21、Ver〇na、Hela细胞和原代鼠肾细胞等细胞系或者乳鼠、蚊子等动物中培养增 殖后进行判断。该检测方法具有灵敏度高、特异性强等优点，但是由于寨卡病毒的高致病 性，对培养环境、操作人员、培养条件和仪器设备等有较高的要求；
[0005] (2)血清学检测方法。该方法用抗原和抗体结合的理论，通过包被的抗原（或者抗 体)检测人或动物的血清抗体(或者抗原)来进行判断。目前，寨卡病毒抗原血清学检测方法 研究较少，抗体检测方法较多，主要包括免疫层析法、免疫荧光法、酶联免疫吸附法 (ELISA)、血凝抑制法、病毒中和试验等。其中，免疫层析、免疫荧光和ELISA是目前实验室诊 断和商业化试剂盒应用最广泛的血清学检测方法。由于寨卡病毒特异抗体一般需在机体感 染病毒5天后才产生，此外，不同基因型的寨卡病毒之间，以及寨卡病毒和其他与之相近的 病原体(如:登革热病毒、西尼罗河热病毒、黄热病病毒等黄病毒科病毒)之间会发生交叉反 应(张硕，李德新。寨卡病毒和寨卡病毒病。病毒学报，2016,第32卷，第1期），从而影响确诊。 这些都使得该方法无法适用于在寨卡热集中爆发时进行快速和准确的检测和诊断；
[0006] (3)分子生物学方法。该方法主要通过聚合酶链式反应(PCR)方法检测样本中有无 寨卡病毒的RNA来进行判断。分子生物学方法具有所需样本来源多样（如：病毒培养液、血 液、蚊子标本等均可）、样本用量少、检测快速准确、灵敏度高、特异性强等特点，使其成为目 前应用最广泛的临床检测方法之一。其中应用的关键是确保RNA中无 RNA酶和基因组DNA的 污染。其中，反转录聚合酶链式反应技术(Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)，是以实时荧光RT-PCR为主的分子生物学方法，为寨卡病毒感染的诊断、 预防和控制提供了快速、准确、有效的诊断方法。使用常规的RT-PCR检测方法，一般在发病 后4天内在感染者外周血中可检测到病毒核酸;而应用更灵敏的实时荧光RT-PCR技术，可以 在感染当日或发病7日后可检测到病毒核酸。因此，对处于发热期的可疑病例，首选的实验 室检测方法为实时荧光RT-PCR，而且可将PCR产物进行序列测定，准确判定是否为寨卡病毒 感染或者感染的寨卡病毒的基因型。
[0007] 然而，现有的寨卡病毒PCR检测方法不能实时、特异和灵敏地检测或区分寨卡病毒 核酸的两种基因型。寨卡病毒分为非洲型和亚洲型，寨卡病毒非洲型主要在非洲地区流行， 而寨卡病毒亚洲型主要在东亚和东南亚地区流行，因此两种基因型的寨卡病毒存在基因水 平上的差异，如果要同时检测两种基因型的寨卡病毒需要从两种基因型寨卡病毒的全基因 序列中选择保守序列并巧妙地设计引物可以同时扩增两种基因型的寨卡病毒，但是不会扩 增其他与之相近的的病毒；同时，如果要达到区分两种寨卡病毒基因型的目的，需要将阳性 样品或可疑样品通过对PCR产物的基因测序后进行判定。因此，建立寨卡病毒的快速、方便、 准确的检验检测方法，有利于了解寨卡病毒的生物学特性、临床诊断，并将其应用于寨卡 病毒感染的检测工作，对防止其传入我国具有重要意义。
[0008] 已公布中国专利申请（申请号：201610099248.7)提供了一种用于亚洲型寨卡病毒 的荧光RT-PCR正向、反向引物和荧光寡核苷酸探针、试剂盒及检测方法，用以快速、高效、定 性的检测样本中的亚洲型寨卡病毒。该专利申请的技术方案：1)只能检测寨卡病毒亚洲型； 2)是利用水解探针（荧光寡核苷酸探针）的荧光反转录PCR进行检测，因而在进行相关样品 检测时只有扩增曲线而没有熔解曲线，从而只能通过扩增曲线的有无来判定样品的阴阳 性，无法有效地减少或避免假阳性结果，其检测结果的可行度有待提高;3)其试剂盒的最低 检出限为1X10 3拷贝/mL。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种高度灵敏、特异、可以高效快速地检测和分型两种寨卡 病毒基因型的引物、探针及试剂盒，以及其检测方法和应用。本发明的设计原理在于:基于 反转录PCR技术，建立一套适用于同时检测和分型两种寨卡病毒的的一步法FRET-PCR系统。 此系统基于寨卡病毒两种基因型以及与之同源性较高的其他相关病原体的全基因序列，选 择相对保守的区间设计引物和探针，经过特异性地扩增，可以灵敏、快速地从临床样品中检 测并筛选出阳性样品，进而根据高分辨率熔解曲线中熔解温度1值的不同，从而可信度高 地区分寨卡病毒亚洲型和寨卡病毒非洲型。
[0010]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0011 ]本发明提供了一种反转录PCR检测寨卡病毒的试剂盒，包括引物、探针和FRET-PCR 标准品，其中：
[0012]所述引物为上游引物和下游引物;所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列； 所述下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；
[0013]所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针；所述6-FAM探针具有SEQIDNo.3的核苷 酸序列;所述LCRed640探针具有SEQIDNO.4的核苷酸序列；
[0014] 进一步地，所述试剂盒包括:上述引物、6-FAM探针和LCRed640探针，以及PCR缓冲 液、热启动Taq酶、dNTP和FRET-PCR标准品；还可以包括PCR阴性对照，可选地，所述PCR阴性 对照为双蒸水。
[0015] 进一步地，所述FRET-PCR标准品包括DNA质粒标准品和RNA标准品。其中，所述DNA 质粒标准品是将具有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6序列的核苷酸片段插入pUC57载体构建而 成的重组质粒;所述RNA标准品是将含有SEQ ID No. 5和SEQ ID No.6序列和T7启动子序列 的质粒通过体外转录获得的RNA核苷酸。
[0016]更进一步地，所述DNA质粒标准品和RNA标准品模板的浓度为100基因拷贝/微升。 [0017]本发明提供了一种反转录PCR检须彳寨卡病毒的试剂盒的反转录PCR扩增检测体系， 反转录PCR扩增对象包括RNA标准品或者RNA模板、RNA提取的阴性对照和RT-PCR阴性对照；
[0018] 反转录PCR扩增检测体系包括如下扩增体系:体积比为扩增体系总体积50%的样 品RNA模板或者RNA标准品、lx PCR缓冲液、ΙμΜ的上游引物、ΙμΜ下游引物、0.2μΜ的6-FAM探 针、0.2μΜ的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μΜ dNTP、0.14个单位的商业化反转 录酶、20个单位的商业化RNA酶抑制剂;优选地，所述的扩增体系的总体积为20μ 1或者40μ 1。
[0019] 进一步地，所述的反转录PCR扩增体系的反应条件包括:反转录、预变性、18个温度 递减的高严谨循环、30个欠严谨的荧光获得循环和1个降温循环，其中：
[0020] 反转录：lxl5min@55°C ;预变性：lx2min@95°C ; 18个温度递减的高严谨循环： 6xlseci95〇C ,12seci72〇C ,30seci72〇C ；9xlseci95〇C ,12seci70〇C ,30seci72〇C ；3xlseci95 °C，12sec@68°C，30sec@72°C ;30个欠严谨的荧光获得循环：30xlsec@95°C，8sec@55-58°C， 3〇8θ(：@67Γ and 3〇8θ(：@72Γ;降温循环：lxlsec@4(TC。
[0021 ]本发明提供了一种反转录PCR检测寨卡病毒的试剂盒的实时荧光定量FRET-PCR扩 增检测体系，实时荧光定量FRET-PCR扩增对象包括DNA质粒标准品、PCR阴性对照；
[0022]实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系包括如下扩增体系:体积比为扩增体系总体 积50%的样品DNA模板或者DNA质粒标准品、lx PCR缓冲液、ΙμΜ上游引物、ΙμΜ下游引物、0.2 μΜ的6-FAM探针、0.2μΜ的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μΜ dNTP，优选地，所述 的扩增体系的总体积为20μ1或者40μ1。
[0023]进一步地，所述的实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系的PCR扩增反应条件包括： 预变性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严谨的荧光获得循环、1个持续荧光获得的熔 解循环和1个降温循环，其中：
[0024]预变性：lx2min@95°C;18 个温度递减的高严谨循环：6xlsec@95°C，12sec@72°C， 30seci72〇C ；9xlseci95〇C ,12seci70〇C ,30seci72〇C ；3xlseci95〇C ,12seci68〇C ,30seci72 °C ; 30个欠严谨的荧光获得循环：30xlsec@95°C，8sec@55-58°C，30sec@67°Cand 30sec@72 °C ; 1 个熔解循环：lxlsec@95°C，10sec@40°C，@85°C持续收集荧光；降温循环：lxlsec@40°C。
[0025] 本发明还公开了一种检测和分型寨卡病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步 骤：
[0026] 步骤1:准备检测样品RNA模板；
[0027] 步骤2:按照产品说明配制引物和探针;配制如上述的用于检测和分型寨卡病毒的 一步法反转录PCR反应体系和用于质粒标准品的PCR反应体系，对步骤1中所述的待检RNA模 板和标准品进行扩增;其反应条件包括:反转录、预变性、18个温度递减的高严谨循环、30个 欠严谨的荧光获得循环和1个降温循环;反转录：lxl5min@55°C ;预变性：lx2min@95°C ; 18个 温度递减的高严谨循环：61186(3@95。(：，1286(3@72。(：，3〇86(3@72。(：；91186(3@95。(：，1286(3@70 °C，30sec@72°C ;3xlsec@95°C，12sec@68°C，30sec@72°C ;30个欠严谨的荧光获得循环： 30χ?8θ(3@95Γ，88θ(3@55-58Γ，3〇8 θ(3@67Γ and 3〇8θ(：@72Γ;降温循环：lxlsec@4(TC;在每 个循环的退火时收集荧光信号;所述荧光探针和标准探针分别对应目标荧光通道、寨卡病 毒非洲型标准品荧光通道和寨卡病毒亚洲型标准品荧光通道；
[0028] 步骤3 :反应结束后，读取并记录检测通道扩增曲线和熔解温度1"值;所述检测通 道包括目标荧光通道、寨卡病毒非洲型标准荧光通道和寨卡病毒亚洲型标准荧光通道，所 述目标荧光通道的熔解温度Tfl，所述非洲型标准荧光通道的熔解温度TfAF，所述亚洲型 标准荧光通道的熔解温度T m-AS，根据以下内容进行检测结果的判定：
[0029] 1)当目标荧光通道和标准荧光通道均有扩增曲线，且熔解温度Tm-1和T m-AF-致 (±1C°)，则检测样品为寨卡病毒非洲型病毒阳性；
[0030] 2)当目标荧光通道和标准荧光通道均有扩增曲线，且熔解温度Tm-1和T m-AS-致 (±1C°)，则检测样品为寨卡病毒亚洲型病毒阳性；
[0031] 3)当目标荧光通道无扩增曲线和熔解温度，标准荧光通道同时有扩增曲线和熔解 温度!^值，则检测样品为寨卡病毒阴性；
[0032] 4)当目标荧光通道有扩增曲线但无熔解温度，标准荧光通道同时具有扩增曲线和 熔解温度，重复一次实验，结果相同，则检测样品为寨卡病毒阴性；
[0033] 5)当目标荧光通道无扩增曲线但有熔解温度，标准荧光通道同时具有扩增曲线和 熔解温度，且T m-1和Tm_AF-致（±1C°)，重复一次实验，结果相同，则检测样品为寨卡病毒非 洲型阳性；
[0034] 6)当目标荧光通道无扩增曲线但有熔解温度，标准荧光通道同时具有扩增曲线和 熔解温度，且T m-1和Tm-AS-致（±1C°)，重复一次实验，结果相同，则检测样品为寨卡病毒亚 洲型阳性。
[0035] 本发明上面所述的反转录PCR检测寨卡病毒的试剂盒及其检测方法在检测寨卡病 毒核酸中的应用。
[0036] 本发明的技术方案达到了如下的有益效果：
[0037] 本发明提供了用于检测和分型寨卡病毒2种基因型的一步法反转录PCR引物和探 针的试剂盒及检测方法，通过荧光共振能量转移(FRET)探针检测技术达到快速高效、方便、 准确、特异地检测和分型待检样品中寨卡病毒核酸，从而判断样品中是否存在寨卡病毒病、 且确定其感染的寨卡病毒基因型。
[0038] 1)本发明根据寨卡病毒2种基因型核酸序列中保守区间建立了一种可以对2种寨 卡病毒基因型进行同时检测和分型的反转录PCR系统，其中，首先从NCBI上获得2种寨卡病 毒基因型以及与之同源性较高的其他相关病原体的全基因序列，选择其中对寨卡病毒相对 保守的区间巧妙地设计了一对引物和一对探针，以特异地扩增并通过高分辨率熔解曲线分 析的1^值的不同，区分2种基因型的寨卡病毒，从而能够高效且特异性地同时检测和分型两 种基因型的寨卡病毒；
[0039] 2)在高效且特异性地同时检测和分型两种基因型的寨卡病毒的基础上，本发明巧 妙地选择寨卡病毒保守区域作为目的片段设计引物和探针，还确保此系统不扩增其它非寨 卡病毒的微生物，尤其是与其同源性相近的其他黄病毒属中的病毒，如登革热病毒(Dengue virus)、黄热病病毒(Yellow fever virus)基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、乙型脑炎 病毒(Japanese enchephalitis virus)、西尼罗河热病毒(West Nile virus)等；以及与其 临床表现相似且传播媒介相同、经常被误诊的传染病，如疟疾等，从而使寨卡病毒的检测具 有更尚的准确性；
[0040] 3)本发明申请通过杂交探针（荧光共振能量转移原理，FRET:Fluorescence Resonance Energy Transfer)焚光定量反转录PCR方法进行检测的，此检测PCR体系不仅具 有扩增曲线且同时具有熔解曲线，因此只有同时具有扩增曲线和熔解曲线才判定为阳性样 品，所以提高了检测结果的可信度，大大减少了假阳性的结果；
[0041] 4)本发明所提供的检测试剂盒和检测方法可以灵敏度高、快速准确、特异性地检 测和分型两种基因型的寨卡病毒，尤其适用于临床症状不明显的寨卡病毒感染早期或恢复 期，机体内病毒的含量相对较低的时期，是对处于发热期的可疑寨卡病毒感染病例的首选 实验室检测方法。本发明具有高灵敏度的反转录FRET-PCR体系，在该体系扩增效率的检测 中，可以有效地扩增最低ΠΓ 7禽流感病毒H1N1的RNA核酸(从鸡胚尿囊液中制备的RNA核酸标 准品）；此外，其实时荧光RT-PCR体系可以在每10μ1的样品最低检测到1个拷贝的样品核酸 (100拷贝/mL)，从而能够及时、快速地诊断、监测和控制传染病，尤其像寨卡热这种急性传 染病；
[0042] 5)本发明所提供的检测试剂盒和检测方法，操作便捷高效，适合于检测大量样本， 为寨卡病毒感染爆发时的快速、准确地诊断大批临床样品，并尽快地控制本病毒感染提供 了坚实的基础。
【附图说明】
[0043] 图1是本发明寨卡病毒非洲型的扩增曲线的示意图。图中，各浓度依次为IX 104/ 反应，1 X 103/反应，1 X 102/反应，1 X 101/反应，1 X 10*7反应的寨卡病毒非洲型质粒标准 品，各2个重复数据，NC为阴性对照样品，横坐标Cycle表示PCR反应扩增循环数，纵坐标 Fluorescence (498-640)表不在640nm处的焚光强度。
[0044] 图2是本发明寨卡病毒非洲型的熔解曲线的示意图。图中，各曲线为IX 104/反应， 1 X 103/反应，1 X 102/反应，1 X 101/反应，1 X 10*7反应的寨卡病毒非洲型质粒标准品及阴 性对照的恪解曲线，各2个重复数据，横坐标Temperature表示PCR反应恪解温度Tm值，纵坐 标-((1/(11')?111〇代8〇611〇6(498-640)表示在64〇111]1处的焚光强度的二阶负导数。
[0045] 图3是本发明寨卡病毒亚洲型的扩增曲线的示意图。图中，各浓度依次为1 ΧΙΟ4/ 反应，1 X 103/反应，1 X 102/反应，1 X 101/反应，1 X 10*7反应的寨卡病毒亚洲型质粒标准 品，各2个重复数据，NC为阴性对照样品，横坐标Cycle表示PCR反应扩增循环数，纵坐标 Fluorescence (498-640)表不在640nm处的焚光强度。
[0046] 图4是本发明寨卡病毒亚洲型的熔解曲线的示意图。图中，各曲线为IX 104/反应， 1 X 103/反应，1 X 102/反应，1 X 101/反应，1 X 10Q/反应的寨卡病毒亚洲型质粒标准品及阴 性对照的恪解曲线，各2个重复数据，横坐标Temperature表示PCR反应恪解温度Tm值，纵坐 标-((1/(11')?111〇代8〇611〇6(498-640)表示在64〇111]1处的焚光强度的二阶负导数。
[0047] 图5是本发明两种基因型寨卡病毒质粒的熔解曲线的示意图。图中，曲线为IX 1〇3/反应的寨卡病毒非洲型和寨卡病毒亚洲型质粒标准品和阴性对照的高分辨率熔解曲 线，各3个重复数据，横坐标Temperature表示PCR反应恪解温度Tm值，纵坐标_(d/dT) Fluorescence (498-640)表示在640nm处的焚光强度的二阶负导数。
[0048]图6是本发明中反转录PCR体系的扩增曲线的示意图。图中，各浓度依次为IX 10-3/ 反应，1 X 10_4/反应，1 X 10_5/反应，1 X 10_6/反应，1 X 10_7/反应的流感病毒RNA核酸标准品， 各3个重复数据，NC为阴性对照样品，横坐标Cycle表示PCR反应扩增循环数，纵坐标 Fluorescence (498-640)表不在640nm处的焚光强度。
[0049] 图7是本发明中反转录PCR体系的熔解曲线的示意图。图中，各曲线为IX 10-3/反 应，1 X 10-4/反应，1 X 10-5/反应，1 X 10-6/反应，1 X 1〇々反应的流感病毒RNA核酸标准品及 阴性对照的熔解曲线，各2个重复数据，横坐标Temperature表示PCR反应熔解温度1?值，纵 坐标-(d/dT)Fluorescence (498-640)表示在640nm处的焚光强度的二阶负导数。
[0050] 图8是本发明两种寨卡病毒基因型琼脂糖凝胶电泳的示意图。图中各泳道依次为： 泳道-1:标准品；泳道-2:寨卡病毒非洲型（Zika virus Asian genotype，ZIKV_Asian);泳 道_3:寨卡病毒亚洲型（Zika virus African genotype，ZIKV_African)。其中，标准品 (Ladder)各条带大小依次为 100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp， 900bp，和lOOObp。
【具体实施方式】
[0051] 为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及【具体实施方式】对本发明 做进一步的介绍。
[0052] 本发明提供了用于检测和分型寨卡病毒2种基因型的一步法反转录PCR引物和探 针的试剂盒及检测方法，通过荧光能量共振转移(FRET)探针检测技术达到快速、方便、准 确、特异地检测和分型待检样品中寨卡病毒核酸，从而判断样品中是否存在寨卡病毒病且 确定其感染的寨卡病毒基因型。
[0053] 实施例1
[0054]本实施例1中提供了一种用于检测和分型寨卡病毒2种基因型的一步法反转录 FRET-PCR的试剂盒，包括引物和探针，以及PCR缓冲液、热启动Taq酶、dNTP、FRET-PCR标准 品、以及双蒸水PCR阴性对照；
[0055] 其中，所述引物为上游引物和下游引物;所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针； 所述引物和探针的核苷酸序列分别如下：
[0060] 其中6-FAM探针为供体探针，在其3'端标记有供体染料FAM;LCRed640探针为受体 探针，在其5 '端标记有受体染料LCRedi t640.供体染料由仪器中自带的合适的激发滤光片 激发，并释放能量激发受体染料，受体染料激发后发射出不同波长的荧光，其荧光量与PCR 产生的靶DNA的数量呈成正比。
[0061 ]所述FRET-PCR标准品是由商业化基因合成公司（金斯瑞生物科技，中国南京)获得 的寨卡病毒非洲型和亚洲型保守区间的核苷酸片段插入PUC57载体构建而成的重组质粒。 所述DNA质粒标准品的浓度为100基因拷贝/微升。
[0062] 其中，所述寨卡病毒亚洲型（Zika virus Asian genotype)特异性保守序列具有 SEQ ID吣.5的序列：
[0064] 所述寨卡病毒非洲型（Zika virus African genotype)特异性保守序列具有SEQ ID No.6的序列：
[0066]采用本例所述的试剂盒对检测样品进行检测时，主要包括以下步骤：
[0067]步骤A:待检样品RNA的提取：所述样品RNA可以采取罗氏诊断公司生产的H i gh Pure RNA Isoaltion Kit(Roche，Germany)试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。
[0068] 步骤B:以步骤A的待检样品RNA为模板，配制一步法反转录FRET-PCR反应体系，进 行扩增反应，其中反应体系如下：反转录PCR扩增检测体系包括20μ1的扩增体系，?ομL的待 测样品RNA模板或者体外转录RNA样品、lxPCR缓冲液、ΙμΜ上游引物、ΙμΜ下游引物、0.2μΜ的 6-FAM探针、0.2μΜ的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μΜ dNTP、0.14个单位的商 业化反转录酶、20个单位的商业化RNA酶抑制剂。
[0069]其中，所述反应条件包括:反转录、预变性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严 谨的荧光获得循环和1个降温循环;反转录：lxl5min@55°C ;预变性：lx2min@95°C ; 18个温度 递减的高严谨循环：6χ?8θ(：@95Γ，128θ(3@72Γ，3〇8θ(：@72Γ ;9χ?8θ(：@95Γ，12sec@7(TC， 30sec@72°C ;3xlsec@95°C，12sec@68°C，30sec@72°C ;30个欠严谨的荧光获得循环： 30χ?8θ(：@95Γ，88θ(3@55-58Γ，3〇8θ(：@67Γ and 3〇8θ(：@72Γ ;降温循环：lxlsec@4(TC 〇
[0070]步骤C:结果分析
[0071 ] 1)读取并记录检测通道扩增曲线和熔解温度Tm值;所述检测通道包括目标荧光通 道、寨卡病毒非洲型标准荧光通道和寨卡病毒亚洲型标准荧光通道，所述目标荧光通道的 熔解温度Tfl，所述非洲型标准荧光通道的熔解温度TfAF，所述亚洲型标准荧光通道的熔 解温度Tm-AS。
[0072] 2)质量控制
[0073 ]阴性对照:无扩增曲线且无熔解温度；
[0074] 阳性对照:具有扩增曲线，同时具有熔解温度Tm-AF和Tm-AS;
[0075] 以上两个条件需要在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需要重新进行 实验。
[0076] 3)结果判读
[0077] a)当目标荧光通道和标准荧光通道均有扩增曲线，且熔解温度Tm-1和Tm-AF-致 (±1C°)，则检测样品为寨卡病毒非洲型病毒阳性；
[0078] b)当目标荧光通道和标准荧光通道均有扩增曲线，且熔解温度Tm-1和Tm-AS-致 (±1C°)，则检测样品为寨卡病毒亚洲型病毒阳性；
[0079] c)当目标荧光通道无扩增曲线和熔解温度，标准荧光通道同时有扩增曲线和熔解 温度!^值，则检测样品为寨卡病毒阴性；
[0080] d)当目标荧光通道有扩增曲线但无熔解温度，标准荧光通道同时具有扩增曲线和 熔解温度，重复一次实验，结果相同，则检测样品为寨卡病毒阴性；
[0081] e)当目标荧光通道无扩增曲线但有熔解温度，标准荧光通道同时具有扩增曲线和 熔解温度，且Tm-1和T m_AF-致（±1C°)，重复一次实验，结果相同，则检测样品为寨卡病毒非 洲型阳性；
[0082] f)当目标荧光通道无扩增曲线但有熔解温度，标准荧光通道同时具有扩增曲线和 熔解温度，且Tm-1和T m_AS-致（±1C°)，重复一次实验，结果相同，则检测样品为寨卡病毒亚 洲型阳性；
[0083] 实施例2
[0084]本实施例2通过载有寨卡病毒非洲型和寨卡病毒亚洲型的质粒标准品验证本发明 中一步法反转录FRET-PCR检测方法的灵敏度、特异性和扩增效率。
[0085] 1)本发明检测方法灵敏度的确定
[0086] 步骤A: DNA质粒标准品的制备
[0087] 由金斯瑞（金斯瑞生物科技，中国南京）合成寨卡病毒2个基因型（ZIKV-Asian、 ZIKV-African)目的片段的DNA序列。依据合成物的分子量和绝对重量，计算合成物所含的 基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备每个反应的稀释试剂含IX 1〇4拷贝、1 X103拷贝、IX 102拷贝、IX 101拷贝、IX 10°拷贝的目的基因作为标准品。用本发明系统扩 增含不同基因浓度的稀释液，来确定本发明检测此基因的灵敏度。本发明试剂盒中提供寨 卡病毒2个基因型、浓度为100基因拷贝/微升的DNA质粒标准品。
[0088]步骤B:以步骤A获得的DNA质粒样品为扩增模板，配制20μ1的FRET-PCR扩增体系， 包括1 〇μ 1的样品DNA模板、1 xPCR缓冲液、1 μΜ上游引物、ΙμΜ下游引物、0.2μΜ的6-FAM探针、 0.2μΜ的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μΜ dNTP。
[0089] 步骤C:对步骤B中的反应体系进行PCR扩增，所述PCR扩增设置反应条件包括:预变 性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严谨的荧光获得循环、1个持续荧光获得的熔解循 环和1个降温循环；预变性：lx2min@95°C ; 18个温度递减的高严谨循环：6xlsec@95°C， 12seci72〇C ,30seci72〇C ；9xlseci95〇C a2seci70〇C ,30seci72〇C ；3xlseci95〇C , 12seci68 °C，30sec@72°C ;30个欠严谨的荧光获得循环：30xlsec@95°C，8sec@55-58°C，30sec@67°C and 30sec@72°C ; 1 个熔解循环：lxlsec@95°C，10sec@40°C，@85°C持续收集荧光；降温循环： lxlsec@40°C。
[0090] 重复上述检测两次。
[0091] 实验结果（图1至图4)表明，本发明所建立的一步法反转录FRET-PCR具有高灵敏 度，不仅可以扩增2种寨卡病毒(寨卡病毒非洲型和寨卡病毒亚洲型），而且最低可以检测到 单个拷贝的寨卡病毒DNA质粒标准品；此外，两次重复测试结果基本一致，说明本方法具有 可重复性。
[0092] 2)本发明反转录PCR特异性的确定
[0093]本发明的特异性从三个方面得到保证：
[0094] a)通过BLAST搜索验证其不会扩增其它非寨卡热病原体尤其是与其同源性相近或 临床特征相似的病原体核酸：
[0095] 设计的引物和探针经过 NCBI (www · ncbi · nlm · nih · gov)中的 BLAST (WWW · blast · ncbi. nlm. nih · gov/Blast · cgi)搜索，确认本发明设计的引物能特异地扩增所 有的寨卡病毒基因型(寨卡病毒非洲型、寨卡病毒亚洲型），而不扩增其它非寨卡热病原体 尤其是与其同源性相近(登革热病毒、基孔肯雅病毒、埃博拉病毒、乙型脑炎病毒等)或临床 特征相似(疟疾等)的病原体核酸。通过BLAST确认，本发明RT-PCR的探针和引物可以特异地 扩增和检测两种寨卡病毒基因型的核酸但不扩增其他相关病毒的核酸；
[0096] b)通过高分辨率熔解曲线中Tm值的不同验证其可以区分寨卡病毒两种基因型 (ZIKV-Asian^ZIKV-African)：
[0097 ] 步骤A: DNA质粒标准品的制备
[0098]由金斯瑞（金斯瑞生物科技，中国南京）合成寨卡病毒2个基因型（ZIKV-Asian、 ZIKV-African)目的片段的DNA序列。依据合成物的分子量和绝对重量，计算合成物所含的 基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备每个反应的稀释试剂含IX 1〇4拷贝、1 X 103拷贝、1 X 102拷贝、1 X 101拷贝、1 X 10°拷贝的目的基因作为标准品。
[0099]步骤B:以步骤A获得的DNA样品为扩增模板，配制20μ1的FRET-PCR扩增体系，包括 1〇μ1的样品DNA模板、lxPCR缓冲液、ΙμΜ上游引物、ΙμΜ下游引物、0.2μΜ的6-FAM探针、0.2μΜ 的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μΜ dNTP。
[01 00]步骤C:对步骤B中的反应体系进行PCR扩增，所述PCR扩增设置反应条件包括:预变 性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严谨的荧光获得循环、1个持续荧光获得的熔解循 环和1个降温循环；预变性：lx2min@95°C ; 18个温度递减的高严谨循环：6xlsec@95°C， 12seci72〇C ,30seci72〇C ；9xlseci95〇C a2seci70〇C ,30seci72〇C ；3xlseci95〇C , 12seci68 °C，30sec@72°C ;30个欠严谨的荧光获得循环：30xlsec@95°C，8sec@55-58°C，30sec@67°C and 30sec@72°C ; 1 个熔解循环：lxlsec@95°C，10sec@40°C，@85°C持续收集荧光；降温循环： lxlsec@40°C。
[0101] 重复上述检测三次。
[0102] 结果如图1-5所示，本发明系统可以特异、高效的扩增两种血清型的寨卡病毒DNA; 同时，本发明可以通过高分辨率熔解曲线中Tm值的不同区分两种寨卡病毒的非洲型和亚洲 型，寨卡病毒非洲型具有双峰，即两个Tm值(54.1°(：;64.8°(：);而寨卡病毒亚洲型为单峰，即 具有一个Tm(53.8°C)值。因此，本发明中所建立的一步法反转录FRET-PCR可以通过高分辨 率熔解曲线中Tm值的不同区分寨卡病毒非洲型和寨卡病毒亚洲型。
[0103] c)通过琼脂糖凝胶电泳验证其可以区分寨卡病毒两种基因型(ZIKV-Asian、ZIKV-Afr i can)之间的特异性：
[0104] 将上述b)部分中产生的PCR产物进行浓度为3 %琼脂糖凝胶电泳，其中各孔上样量 为 10μ1，标准品各条带从小到大依次为 100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp， 800bp，900bp，和lOOObp。
[0105] 结果如图8所示，泳道-1:标准品；泳道-2:寨卡病毒非洲型（Zika virus Asian genotype，ZIKV_Asian);泳道-3:寨卡病毒亚洲型（Zika virus African genotype，ZIKV_ African)，寨卡病毒两种基因型显示167碱基对(bp)的条带大小。
[0106] 3)本发明中反转录PCR体系效率的确定：
[0107] 步骤A: RNA标准品的制备
[0108] 用禽流感病毒H1N1感染鸡胚后收取其尿囊液，用商业RNA提取试剂盒(High Pure RNA Isolation Kit，罗氏，德国）进行RNA核酸提取后，用TE缓冲液，PH为8.0进行10-3，10一4， 10- 5，1〇Λ 1〇Λ 10-8梯度稀释后作为检测反转录PCR系统效率的标准品。
[0109] 步骤Β:以步骤Α的获得RNA为模板，配制一步法反转录FRET-PCR反应体系，进行扩 增反应，其中反应体系如下:反转录PCR扩增检测体系包括20μ1的扩增体系，10μ1的样品RNA 模板、1 xPCR缓冲液、ΙμΜ流感上游引物（5 ' -GCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCGTCTT-3 '）、ΙμΜ流 感下游引物（5 ' -GACAAAATGACCATCGTCAACATCCACA-3 '）、0 · 2μΜ的流感6-FAM探针（5'_ CTACGGAAGGAGTGCCTGAGTCTATG-6-FAM-3 '）、0 · 2μΜ的流感LCRed640探针（5 ' -LCRED640-GGGAAGAATATCGGCAGGAACAGCAGA-PH0SPHATE-3'）、2个单位的商业化Taq酶、200μΜ dNTP、 0.14个单位的商业化反转录酶、20个单位的商业化RNA酶抑制剂。
[0110] 步骤C:对步骤B中配制的PCR反应体系进行扩增，其中扩增条件包括反转录、预变 性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严谨的荧光获得循环和1个降温循环。反转录： lxl5min@55°C;预变性：lx2min@95°C;18 个温度递减的高严谨循环:6xlsec@95°C，12sec@72 °C ,30seci72〇C ；9xlseci95〇C ,12seci70〇C ,30seci72〇C ；3xlseci95〇C ,12seci68〇C ,30seci 72°C;30个欠严谨的荧光获得循环：30xlsec@95°C，8sec@55-58°C，30sec@67°C and 30sec@ 72°C ;降温循环：lxlsec@40°C 〇
[0111] 结果如图6和图7，其表明本发明的反转录FRET-PCR体系具有较高的灵敏度，可以 检测到反应体系中最低为10-7拷贝的禽流感病毒RNA分子。
[0112] 实施例3
[0113] 本实施例3利用基因合成目的核酸片段并导入的质粒通过商业化试剂盒在体外转 录合成病毒RNA核酸后，对本发明中一步法反转录FRET-PCR检测方法进行验证，本实施例3 中以检测寨卡病毒亚洲型为例，具体操作流程如下：
[0114] 步骤A:由金斯瑞(金斯瑞生物科技，中国南京)合成含有寨卡病毒亚洲型目的片段 DNA(SEQ ID No.5)和T7启动子的质粒批pUC57,用合适的限制性内切酶(Sac I，宝生物，大 连)对质粒进行酶切;通过PCR扩增提高目的DNA浓度；用商业化转录试剂盒( MEGAscript? Kit，ambion?by lifetechn〇l〇ges?，美国））对pcr扩增产物进行转录并获得RNA产物;转录 完成后，将转录产物稀释后用于反转录PCR进行扩增。
[0115] 1)质粒的稀释
[0116] 将含有合成质粒的微型离心管4000转离心2分钟，然后加入40μ1 TE缓冲液，PH为 8.0配成质粒浓度为lOOng/μΙ的溶液；
[0117] 2)质粒的酶切
[0118] 用商业化限制性内切酶SacKSac I，宝生物，大连)对质粒进行酶切，其反应体系 为20μ1，且各试剂成分组成如下表;将各反应液混合后放入37°C环境中孵育1个小时;然后 将反应体系混合液放入56 °C环境中加热20分钟使限制性内切酶失火，从而终止酶切反应；
[0120] 3)PCR扩增酶切产物
[0121]用以下引物从线性质粒上扩增一段含有T7转录启动子和目的DNA片段、长度为733 个碱基对(bp)的片段，从而为后续转录提供足够浓度的目的DNA，大于等于Uig/μL;
[0122] P-上游引物：5 ' -AGCTATTATGCCGCCACCATCC-3 '
[0123] P-下游引物:5 ' -CAGAGTGTCACACGGCTCAGCC-3 '
[0124] 4)体外转录
[0125] 在室温条件下溶解试剂盒中所有相关试剂(将RNA Polymerase Enzyme Mix置于-20 °C冰箱中待使用时取出）；
[0126] 在室温下混合下表中的各试剂并通过移液器上下吹打混匀；
[0128] 在37°C环境中孵育4小时；加入ΙμL TURBO DNase，混匀后在37°C环境中孵育15分 钟，从而去除反应体系中的核酸DNA，从而最终获得体外转录的寨卡病毒RNA核酸。
[0129] 将上述转录产物用TE缓冲液(PH8.0)进行10-3，10-4,10-5稀释；用本发明建立的可 以检测所有寨卡病毒基因型的RT-PCR体系扩增通过上述方法获得的转录产物稀释液(核 酸 RNA)
[0130]步骤B:以步骤A的获得的体外转录寨卡病毒RNA为模板，配制一步法反转录FRET-PCR反应体系，进行扩增反应，其中反应体系如下:反转录PCR扩增检测体系包括20μ1的扩增 体系，1〇μ1的RNA标准品、lxPCR缓冲液、ΙμΜ上游引物、ΙμΜ下游引物、0.2μΜ的6-FAM探针、0.2 μΜ的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μΜ dNTP、0.14个单位的商业化反转录酶、 20个单位的商业化RNA酶抑制剂。其反应条件见实施例1步骤B。
[0131] 步骤C:结果分析
[0132] 结果表明，转录产物荧光扩增曲线在640nm处有荧光的出现和增强，且熔解曲线处 有单一、稳定的熔解峰和Im值。因此，本发明所建立的反转录PCR体系可以有效的扩增RNA， 即可以快速、有效地扩增临床样品中寨卡病毒RNA核酸。
[0133] 本发明方法不仅能快速、方便、准确地检测到寨卡病毒，同时能通过分型确定其基 因型，为世界范围内尤其是寨卡病毒暴发流行的国家和地区在控制、预防寨卡病毒的感染 提供了技术支持。
[0134] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明 要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
【主权项】
1. 一种一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物包 括上游引物和下游引物，所述探针包括6-FAM探针和LCRed640探针，其中： 所述上游引物具有SEQ ID No. 1的核苷酸序列； 所述下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列； 所述6-FAM探针具有SEQIDNo.3的核苷酸序列； 所述LCRed640探针具有SEQIDNo.4的核苷酸序列。2. -种一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求 1所述的引物和探针，以及FRET-PCR标准品。3. 如权利要求2所述的一种一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的试剂盒，其特征在 于，所述试剂盒还包括:PCR缓冲液、热启动Taq酶和dNTP。4. 如权利要求2或者3所述的一种一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的试剂盒，其 特征在于，所述FRET-PCR标准品包括DNA质粒标准品和RNA标准品；其中，所述DNA质粒标准 品是将具有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6序列的核苷酸片段插入pUC57载体构建而成的重组 质粒;所述RNA标准品是将含有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6序列和T7启动子序列的质粒通 过体外转录获得的RNA核苷酸。5. -种一步法反转录PCR检测和分析寨卡病毒的试剂盒的反转录PCR扩增检测体系，其 特征在于，所述的反转录PCR扩增检测体系包括如下扩增体系：体积比为扩增体系总体积 50%的样品RNA模板或者RNA标准品、lx PCR缓冲液、ΙμΜ如权利要求1所述的上游引物、ΙμΜ 如权利要求1所述的下游引物、〇. 2μΜ如权利要求1所述的6-FAM探针、0.2μΜ如权利要求1所 述的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μΜ dNTP、0.14个单位的商业化反转录酶和 20个单位的商业化RNA酶抑制剂。6. 如权利要求5所述的一种一步法反转录PCR检测和分析寨卡病毒的试剂盒的反转录 PCR扩增检测体系，其特征在于，所述的反转录PCR扩增体系的反应条件包括:反转录、预变 性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严谨的荧光获得循环和1个降温循环，其中： 反转录：lxl5min@55°C ;预变性：lx2min@95°C ; 18个温度递减的高严谨循环:6xlsec@95 °C ,12seci72〇C ,30seci72〇C ；9xlseci95〇C ,12seci70〇C ,30seci72〇C ；3xlseci95〇C ,12seci 68°(：，3086(3@72°(：;30个欠严谨的荧光获得循环：3(^186(3@95°(：，886(3@55-58°(：，3086(3@67 1€ and 30sec@72°C ;降温循环：lxlsedMCTC。7. -种一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的试剂盒的实时荧光定量FRET-PCR扩增 检测体系，其特征在于，所述的实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系包括如下扩增体系:体 积比为扩增体系总体积50%的样品DNA模板或者DNA质粒标准品、lx PCR缓冲液、ΙμΜ上游引 物、ΙμΜ下游引物、0.2μΜ的6-FAM探针、0.2μΜ的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、和 200μΜ dNTP〇8. 如权利要求7所述的一种一步法反转录PCR检测和分型寨卡病毒的试剂盒的实时荧 光定量FRET-PCR扩增检测体系，其特征在于，所述的实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系 的PCR扩增反应条件包括:预变性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严谨的荧光获得循 环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环，其中： 预变性：lx2min@95°C;18 个温度递减的高严谨循环:6xlsec@95°C，12sec@72°C，30sec@ 72°C;9xlsec@95°C，12sec@70°C，30sec@72°C;3xlsec@95°C，12sec@68°C，30sec@72°C ;30 个 欠严谨的荧光获得循环：3(^186(3@95°(：，886(3@55-58°(：，3〇86(3@671^11(13〇86(3@72°(： ;1个熔 解循环：lxlsec@95°C，10sec@40°C，@85°C持续收集荧光；降温循环：lxlsec@40°C。9. 一种检测和分型寨卡病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1:准备检测样品RNA模板； 步骤2:配制如权利要求1所述的引物和探针;配制如权利请求5所述的用于检测和分型 寨卡病毒的一步法反转录PCR扩增检测体系，对步骤1中所述的待检RNA模板和标准品进行 扩增;其反应条件包括:反转录、预变性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严谨的荧光获 得循环和1个降温循环;反转录：lxl5min@55°C ;预变性：lx2min@95°C ; 18个温度递减的高严 谨循环：6χ?8θ(3@95Γ，128θ(：@72Γ，3〇8θ(：@72Γ ;9χ?8θ(3@95Γ，12sec@7(TC，3〇8θ(：@72Γ ; 3xlsec@95°C，12sec@68°C，30sec@72°C ;30个欠严谨的荧光获得循环：30xlsec@95°C，8sec@ 55-58°C，30sec@67°C and 30sec@72°C ;降温循环：lxlsec@40°C ;在每个循环的退火时收集 荧光信号;所述荧光探针和标准探针分别对应目标荧光通道、寨卡病毒非洲型标准品荧光 通道和寨卡病毒亚洲型标准品荧光通道； 步骤3:反应结束后，读取并记录检测通道扩增曲线和熔解温度1"值;所述检测通道包括 目标荧光通道、寨卡病毒非洲型标准荧光通道和寨卡病毒亚洲型标准荧光通道，所述目标 荧光通道的熔解温度Tm-1，所述非洲型标准荧光通道的熔解温度T m-AF，所述亚洲型标准荧 光通道的熔解温度Tm-AS，根据以下内容进行检测结果的判定： 1) 当目标荧光通道和标准荧光通道均有扩增曲线，且熔解温度Tm_l和Tm-AF-致（± 1 °C)，则检测样品为寨卡病毒非洲型病毒阳性； 2) 当目标荧光通道和标准荧光通道均有扩增曲线，且熔解温度Tm-1和Tm-AS-致（±1 °C)，则检测样品为寨卡病毒亚洲型病毒阳性； 3) 当目标荧光通道无扩增曲线和熔解温度，标准荧光通道同时有扩增曲线和熔解温度 !^值，则检测样品为寨卡病毒阴性； 4) 当目标荧光通道有扩增曲线但无熔解温度，标准荧光通道同时具有扩增曲线和熔解 温度，重复一次实验，结果相同，则检测样品为寨卡病毒阴性； 5) 当目标荧光通道无扩增曲线但有熔解温度，标准荧光通道同时具有扩增曲线和熔解 温度，且Tm-1和T m-AF-致（± 1°C)，重复一次实验，结果相同，则检测样品为寨卡病毒非洲型 阳性； 6) 当目标荧光通道无扩增曲线但有熔解温度，标准荧光通道同时具有扩增曲线和熔解 温度，且Tm-0PT m-AS-致（± 1°C)，重复一次实验，结果相同，则检测样品为寨卡病毒亚洲型 阳性。10. 如权利要求1、2、5、7或者9所述的任意一项在检测寨卡病毒核酸中的应用。
【文档编号】C12Q1/70GK105936946SQ201610481524
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】王成明, 张继垒, 王瑶瑶, 有金凤, 仇海香, 黄可
【申请人】扬州大学