专利名称：一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物及其制备方法
技术领域：
本发明属于病毒检测领域，涉及一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照，更具体而言涉及一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物及其制备方法。
背景技术：
反转录聚合酶链式反应试剂盒的对照样品在实验中的作用是在每次RT-PCR检测时，设立的阴性对照样品和阳性对照样品是不能缺少的，阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明RNA提取、RNA反转录、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果都成立的前提下，才能对检测样品进行判定。因此，每次试验都应设立RNA提取、RNA反转录、 DNA扩增和电泳鉴定对照，只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果成立。因此，反转录聚合酶链式反应试剂盒要设立阳性对照，试剂盒中阳性对照需要满足以下三点1)稳定性好，2)可靠有效，3)符合生物安全。生物安全是指生物性的传染媒介通过直接感染或间接破坏环境而导致对人类、动物或者植物的真实或者潜在的危险。因此，符合生物安全是指避免了上述危险。所述危险例如是高致病性病原微生物，第一类和第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物，第一类病原微生物，是指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。第二类病原微生物，是指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。对于一些高致病性病原微生物的反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照，目前大多数这种试剂盒做法是将目的片段克隆至载体上，其缺点是不能作为RNA提取、RNA反转录过程对照，且容易污染。因此，亟需一种稳定性好、可靠有效、符合生物安全的反转录聚合酶链式反应试剂盒阳性对照的制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性组合物对照，特别是阳性对照组合物及其制备方法，该方法制得的阳性对照稳定性好、安全可靠、可大大减少试验污染的可能性。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的。本发明提供了一种反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物的制备方法，其特征在于，选取一种非靶病毒作为阳性对照模板。本发明的一个方面，反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物的制备方法中选取的非靶病毒为RNA病毒，其可以是任意的符合生物安全的RNA病毒，包括但不限于鸡新城疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，并且选自比较安全、遗传稳定、容易培养的病毒株。在本发明的具体实施方式
中，所选取的非靶病毒株鸡新城疫病毒Iasota株和猪繁殖与呼吸综合征病毒MLV株。本发明的还一个方面，反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物的制备方法中还包括使用灭活试剂处理所述非靶病毒的培养液。所述灭活试剂为高浓度强变性剂， 其迅速破坏细胞结构，使RNA从细胞中释放出来，还使细胞内的RNA酶失活，使释放出的RNA 不被降解。其中，高浓度强变性剂包括但不限于异硫氰酸胍、硫氰酸胍、盐酸胍等含有胍基的盐。灭活试剂可用于RT-PCR、实时荧光RT-PCR阳性对照的灭活。也就是说，在本发明所述的方法中将非靶病毒培养液用变性剂进行稀释，稀释的倍数可由本领域技术人员容易地确定，一般应稀释不小于7倍，优选地稀释50-100倍，更优选地稀释50倍。稀释倍数与病毒含量有关，其中阳性对照的要求是病毒含量既不能太高，也不能太低；太高了，容易污染试剂盒，太低了，使试剂盒的保存期较短。根据各自试剂盒的要求进行稀释。本发明的还一个方面，反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物的制备方法中还包括设计一对非靶病毒引物，对所述选取的非靶病毒进行扩增，扩增的片段长度与反转录聚合酶链式反应试剂盒所针对目的基因的长度相同本发明还提供了一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物，其特征在于包括一种非靶病毒作为阳性对照模板。在本发明的具体实施方式
中，阳性对照组合物中选取的非靶病毒为RNA病毒，其可以是任意的符合生物安全的RNA病毒，包括但不限于鸡新城疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，并且选自安全、遗传稳定、容易培养的病毒株，优选的所述病毒株包括鸡新城疫病毒Iasota株和猪繁殖与呼吸综合征病毒MLV株。在本发明的一个方面中，阳性对照组合物还包括灭活试剂。灭活试剂为高浓度强变性剂。其中，高浓度强变性剂包括但不限于含有胍基的盐，优选的是异硫氰酸胍、硫氰酸胍、盐酸胍。灭活试剂可用于RT-PCR、实时荧光RT-PCR阳性对照的灭活。所述非靶病毒的培养液用根据病毒含量所述灭活试剂进行稀释，一般应稀释不小于7倍，优选地稀释50-100 倍，更优选地稀释50倍。而稀释倍数可由本领域技术人员根据各自试剂盒的要求容易地确定。在本发明的一个方面中，阳性对照组合物还包括一对非靶病毒引物，以对所述非靶病毒进行扩增，扩增的片段长度与反转录聚合酶链式反应试剂盒针对的目的基因的长度相同。本发明还提供了上文所述阳性对照组合物的用途，其用作反转录聚合酶链式反应试剂盒的部分。本发明的阳性对照组合物可以置于反转录聚合酶链式反应试剂盒中。在本发明的具体实施方式
中，所适用的反转录聚合酶链式反应试剂盒包括但不限于禽流感病毒RT-PCR试剂盒和口蹄疫病毒RT-PCR试剂盒，其中禽流感病毒RT-PCR试剂盒可用于禽类，例如鸡、鸭、鹅、麻雀、鸽子等等；口蹄疫病毒RT-PCR试剂盒可用于检测偶蹄动物，例如牛。与现有技术相比，本发明方法制备的阳性对照安全、易保存，可以起到RNA提取、 RNA反转录过程对照的作用，证明RNA提取试剂、反应体系中的反转录酶等活性正常，避免了现有技术中直接使用病毒感染材料易造成病毒扩散的缺点。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。利用检测靶病毒作为阳性对照是一种理想的方法。由于禽流感发生会给国家造成严重的经济损失，且禽流感属于人畜共患病。因此，禽流感病毒检测试剂盒生物安全是非常重要的。特别是禽流感病毒作为阳性对照可能会对实验室环境产生一些不安全的影响。鸡新城疫病毒Iasota株为一株弱毒疫苗株，广泛应用我国鸡新城疫免疫接种，在预防鸡新城疫方面发挥了十分重要的作用。同时该病毒毒株在鸡胚培养中血凝效价很高， 最高可达到2_13，是比较安全、遗传稳定、容易培养的病毒株。因此鸡新城疫病毒Iasota株是设立反转录阳性对照的理想病毒。我们采用鸡新城疫病毒Iasota株作为RNA病毒的反转录阳性对照，起到了 RNA提取、RNA反转录过程对照的作用，证明了 RNA提取试剂、反应体系中反转录酶等活性正常。同时设计一对针对鸡新城疫病毒的引物，此引物要求扩增的片段大小恰好与所检测的禽流感病毒扩增片段长度相一致。加入含异硫氰酸胍的灭活试剂， 将鸡新城疫病毒灭活，作为禽流感病毒反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照，由于RNA 提取过程中采用了鸡新城疫病毒Iasota株作为提取对照，大大减少了试验污染的可能性， 比较适合长期进行禽流感检测的实验室或大规模的禽流感监测。
图1.实施例2中阳性对照的扩增结果。其中各个泳道分别是1. Marker 2.阳性对照3.样品4.阴性对照。图2.实施例3中阳性对照的扩增结果。其中各个泳道分别是1. Marker 2.阳性对照3.样品4。阴性对照。实施例实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件 (例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社) 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1.禽流感病毒RT-PCR试剂盒阳性对照的制备1、灭活试剂的配制4mol/L异硫氰酸胍，25m mol/L 二水柠檬酸钠，0. 5 % (m/v) 十二烷基硫酸钠，0. lmol/L β -巯基乙醇。2、非靶病毒鸡新城疫病毒Iasota株(来源于中国兽医药品监察所，原种代号 AVlOO(L))将血凝价高于2048的鸡新城疫病毒Iasota株鸡胚尿囊液合并、混勻。3、阳性对照的制备将非靶病毒鸡新城疫病毒Iasota株用变性液100倍稀释后， 可作为禽流感病毒RT-PCR试剂盒阳性对照使用。实施例2.禽流感病毒RT-PCR试剂盒阳性对照的应用1、试剂盒的组成0. 2mL 薄壁 PCR 管、RNA 提取试剂盒(Rneasy Mini Kit, qiagen 公司)、δ0 倍 TAE 电泳缓冲液、染色液(Goldview)、上样缓冲液(溴酚蓝蔗糖溶液)、阴性对照(即灭菌去离子水)、阳性对照(即实施例1中所制备的阳性对照)、RT-PCR反应液(引物、dNTPs、TaqDNA 聚合酶所带的反应缓冲液、Mg2+)、酶混合液(AMV反转录酶、RNA抑制剂、TaqDNA聚合酶)、X 液(如下所述)。2、样品制备2. 1样品采集病死鸡的喉气管和肺组织。2. 2样品处理每份样品分别处理。2. 2. 1组织样品处理每份组织分别从三个不同的位置称取样品约lg，用手术剪剪碎混勻后取0. 05g于研磨器中研磨，加入1. 5mL生理盐水继续研磨，待勻浆后转至1. 5mL 灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100 μ L于1. 5mL灭菌离心管中。2. 2. 2阳性对照处理取阳性对照100 μ L，置1. 5mL灭菌离心管中。2. 2. 3阴性对照处理取阴性对照100 μ L，置1. 5mL灭菌离心管中。3、病毒RNA的提取(按照试剂盒说明书进行操作)4、RT-PCR 操作程序每份总体积20 μ L，含16. 8 μ L RT-PCR反应液(用前混勻)，1. 2 μ L酶混合液， 2 μ L模板RNA0例如:η份样品(η < 10)，配制η+1份，16. 8 X (n+1) RT-PCR反应液，再加入 1. 2 X (η+1)酶混合液混勻，取18 μ L分装成η份，分别加入2 μ L模板RNA (阳性对照管加入 1 μ L阳性对照RNA和1 μ L X液，阴性对照管加入1 μ L阴性对照RNA和1 μ LX液)，作好标记。5、X液即为非靶病毒鸡新城疫病毒Iasota株基因组中的引物序列的水溶液，浓度 IOpmoL/μ L0
权利要求
1.一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物的制备方法，其特征在于，选取一种非靶病毒作为阳性对照模板。
2.权利要求1的制备方法，其特征在于选取的非靶病毒为RNA病毒，其可以是任意的符合生物安全的RNA病毒，包括但不限于鸡新城疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，并且选自安全、遗传稳定、容易培养的病毒株，优选的所述病毒株包括鸡新城疫病毒Iasota株和猪繁殖与呼吸综合征病毒MLV株。
3.权利要求1或2的制备方法，其特征在于还包括使用灭活试剂处理所述非靶病毒的培养液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中所述灭活试剂为高浓度强变性剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中所述高浓度强变性剂包括但不限于含有胍基的盐，优选地是异硫氰酸胍、硫氰酸胍、盐酸胍。
6.权利要求3-5中任一项所述的制备方法，其中所述非靶病毒的培养液根据病毒含量用所述灭活试剂进行稀释，稀释不小于7倍，优选地稀释50-100倍，更优选地稀释50倍。
7.权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，设计一对非靶病毒引物，以对所述非靶病毒进行扩增，扩增的片段长度与反转录聚合酶链式反应试剂盒所针对的目的基因的长度相同。
8.一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物，其特征在于包括一种非靶病毒作为阳性对照模板。
9.权利要求8所述的阳性对照组合物，其特征在于选取的非靶病毒为RNA病毒，其可以是任意的符合生物安全的RNA病毒，包括但不限于鸡新城疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，并且选自安全、遗传稳定、容易培养的病毒株，优选的所述病毒株包括鸡新城疫病毒 Iasota株和猪繁殖与呼吸综合征病毒MLV株。
10.权利要求8或9所述的阳性对照组合物，其特征在于还包括灭活试剂。
11.权利要求10所述的阳性对照组合物，其中灭活试剂为高浓度强变性剂。
12.权利要求11所述的阳性对照组合物，其中，高浓度强变性剂包括但不限于含有胍基的盐，优选的是异硫氰酸胍、硫氰酸胍、盐酸胍。
13.权利要求10-12所述的阳性对照组合物，其中所述非靶病毒的培养液根据病毒含量用所述灭活试剂进行稀释，稀释不小于7倍，优选地稀释50-100倍，更优选地稀释50倍。
14.权利要求8-13中任一项所述的阳性对照组合物，其特征在于还包括一对非靶病毒引物，以对所述非靶病毒进行扩增，扩增的片段长度与反转录聚合酶链式反应试剂盒所针对的目的基因的长度相同。
15.权利要求8-14任一项所述的阳性对照组合物的用途，其用作反转录聚合酶链式反应试剂盒的部分。
全文摘要
本发明提供了一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物及其制备方法，其特征在于以一种非靶病毒作为阳性对照，同时设计一对引物，进行扩增，扩增的片段长度与反转录聚合酶链式反应试剂盒的目的基因的长度相同；非靶病毒用异硫氰酸胍灭活。本发明方法制备的阳性对照安全，避免了现有技术中直接使用病毒感染材料造成病毒扩散，且作为RNA病毒的反转录阳性对照，起到了RNA提取、RNA反转录过程对照的作用，证明RNA提取试剂、反应体系中所用物质的活性正常，便于作为商品化试剂盒的阳性对照，具有很高的实用价值。
文档编号C12N15/11GK102329789SQ20111027245
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月15日 优先权日2011年9月15日
发明者乔明明, 孙明, 田克恭, 赵铁柱, 陈西钊 申请人:北京世纪元亨动物防疫技术有限公司