用荧光标记核苷酸反转录检测菌体rna转录水平的方法

专利名称:用荧光标记核苷酸反转录检测菌体rna转录水平的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物工程技术领域：
检测方法，具体是一种用荧光标记核苷酸反转录检测菌体RNA转录水平的方法。
背景技术：
发酵系统的参数检测是大规模工业发酵过程优化和在线控制的基础。当前，检测内容主要集中在环境变量、宏观生物量和产品产率几个方面。在环境、宏观生物量参数和产品之间，还存在着菌体内产品合成和调控的生化过程，如产品合成基因和调控基因的DNA 转录成为RNA，RNA翻译成为蛋白质，以及酶促生化反应至产品等中间过程环节。而目前菌体内的生化过程被视为“黑盒子”，无法利用产品生产能力的“早期”生化信号，在环境变量、 宏观生物量和产品之间建立更“早期”信号关联，指导发酵过程的优化和在线控制技术提高。因此建立测定菌体发酵过程中RNA转录水平的方法，对于工业发酵过程的优化具有重要意义。荧光染料是核酸探针中很重要的一种标记物，荧光标记的核酸分子探针(probe) 用于检测核酸样品中特定的核苷酸序列，因而也可用来检测菌体RNA转录水平。常用的荧光标记试剂有溴乙锭、TAMRA, Cy (菁染料)系列及STOR Green I等。在mRNA检测定量的方法中，实时荧光RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)运用了荧光标记试剂，生物芯片技术用到荧光标记单核苷酸制备cDNA探针，这两种方法步骤繁杂、耗时，影响因素较多。
经对现有技术的文献检索发现，石嵘等在第一军医大学学报2003年第23卷2期页发表文章“两种限制性标记方法提高基因芯片杂交结果的信噪比”，文中利用
Cy5-dUTP掺入逆转录cDNA，并用Cy5标记通用引物进行限制性PCR扩增，所得DNA探针与芯片杂交后用GSI Lumonics Scanarry Lite进行扫描，结果表明经过限制性扩增的探针与芯片杂交结果的背景小，阳性信号强。但生物芯片技术也存在以下不足步骤较多，PCR扩增需要一定时间，另外杂交信号也需特殊的仪器检测，价格昂贵，不能普及。

发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种用荧光标记核苷酸反转录检测菌体RNA 转录水平的方法，即提取菌体的总RNA，反转录成cDNA。在反转录的过程中荧光标记的核苷酸被反转录酶整合到新合成的cDNA产物中，使核酸信号得以放大。该检测过程无需传统的 PCR扩增和探针制备，可实现发酵过程的在线控制，是一种可以应用到工业发酵过程控制的有用、便捷的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤
第一步，引物的设计和合成
根据目的基因序列，设计RNA反转录引物。
第二步，RNA提取
提取菌体总RNA，利用OD26W和琼脂糖电泳检查RNA的纯度和完整性。
第三步，mRNA荧光信号检测[0011]①在DEPC处理过的PCR管中依次加入iTotal RNA,反转录引物，dATP、dTTP、dGTP、 dCTP, DEPC 水；
②PCR仪中65°C保温5 lOmin，取出后迅速置于冰上冷却；
③向PCR管中依次加入反转录缓冲液及其反转录酶，荧光标记核苷酸；
④42 45°C保温 60 120min;
⑤94 98 °C终止反应；
⑥加入氢氧化钠，混勻，60 80°C保温5min ；
⑦12，OOOrpm,离心 lOmin，取上清；
⑧醋酸中和，加入异丙醇，混勻，沉淀30min ；
⑨12，OOOrpm，离心lOmin，用体积分数为70 90%乙醇洗涤沉淀。
⑩无菌水溶解沉淀，用荧光分析仪(如Fluoroskan Ascent Labsystems，美国热电公司产品)测定荧光信号。
所述RNA荧光信号检测过程中避光操作。
所述的荧光标记核苷酸，其采用的荧光标记染料为Cy系列(菁类染料)、FAM、 Texas Red(得克萨斯红)中一种，但不限于上述荧光染料。
所述的核苷酸，为脱氧胞苷三磷酸或脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸腺
苷三磷酸。
按照上述方法采用赛百盛和Takara Primescript 逆转录酶对假单胞菌M18菌株 RNA进行反转录，并以Cy3标记脱氧胞苷三磷酸为例，cDNA信号值分别为0. 0181,0. 0156。 说明Cy3标记的脱氧胞苷三磷酸在逆转录过程中被反转录酶部分整合入DNA链中，使mRNA 检测信号得以放大。又花菁染料的摩尔吸收系数大，荧光发射波长范围宽，一般在600 IOOOnm的近红外区，可大大避免生物自身的背景干扰(其文章出处为陈秀英，彭孝军，DNA 分子荧光探针，化学通报，2004，67 5)，因此DNA荧光测定值更为准确。
与现有的荧光定量RT-PCR相比，本发明操作简便，节省时间，避免了 PCR反应过程中一些因素对结果的影响。
本发明所使用的的假单胞菌M18菌株已由中国专利公开号CN1340609，专利名称为生物农药促生拮抗菌M18及其制备方法，专利号为00119857. 2全部公开；所用荧光假单胞菌株M18，已在中国专利局指定的保藏单位北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC NO. 0462,2000. 6. 27。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
用Cy3标记dCTP通过反转录检测假单胞菌M18结构基因phzC转录水平
1. phzC基因序列的确定
根据Pseudomonas aeruginosa 操纵子序列(AF005404)，设计 PCR 引物，从M18G 发酵液中提取基因组DNA，PCR放大，测序，得到phzC基因序列(EF491207)。
4[0032]2.引物的设计和合成
根据phzC基因序列，设计上游引物。引物序列为5’-TTCCAAGCCGCACGAGCAGGT-3’
3. RNA 提取
按照TRNzol试剂说明书提取Iml发酵4 假单孢菌M18的总RNA，经过紫外分光光度计测定得D26Wrai = 1. 96, OD2607230nm = 1. 7，琼脂糖电泳检测总RNA质量较好，可以用于下一步的反转录。总RNA浓度(μ g/mL) = OD260 X稀释倍数Χ40μ g/mL，以确定反转录总 RNA的量。
4. mRNA荧光信号检测
(I)DEPC处理PCR管中依次加入
Total RNA5 μ g
引物 QO μ Μ)1 μ 1
dNTP-miχ (dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 1 OmM) 3 μ 1
DEPC 水5·5μ1
(2) PCR仪中65°C保温5min，取出后迅速置于冰上冷却；
(3)向PCR管中依次加入
5X反转录缓冲液5μ1
反转录酶0. 5 μ 1
荧光标记核苷酸05 μ Μ) 1μ 1
(4) PCR 仪中 42°C 保温 60min ；
(5) 94°C水浴5min终止反应；
(6)加入2 μ IlOM氢氧化钠，混勻后，60°C水浴保温5min ；
(7) 12，OOOrpm,离心lOmin，转移上清于新的离心管中；
(8)加入4 μ 15Μ醋酸中和，等体积异丙醇(30 μ 1)，混勻，_20°C沉淀30min ；
(9) 12，OOOrpm,离心lOmin，并用体积分数为70%的乙醇200 μ 1洗涤沉淀2次；
(10) 100 μ 1无菌水溶解上述沉淀，用荧光分析仪测定荧光信号；
本实施例中荧光标记核苷酸为Cy3_dCTP，荧光分析仪为Fluoroskan AscentLabsystems,荧光信号检测过程需避光操作。所测得假单孢菌MlSphzC mRNA荧光信号值0. 0181，Cy3激发和发射波长分别为544nm、590nm。
实施例2
用Cy5标记dATP通过反转录检测假单胞菌M18结构基因phzC转录水平
1. phzC基因序列的确定
根据Pseudomonas aeruginosa 操纵子序列(AF005404)，设计 PCR 引物，从M18G 发酵液中提取基因组DNA，PCR放大，测序，得到phzC基因序列(EF491207)。
2.引物的设计和合成
根据phzC基因序列，设计上游引物。引物序列为
5， -TTCCAAGCCGCACGAGCAGGT-3，
3. RNA 提取
按照TRNzol试剂说明书提取Iml发酵4 假单孢菌M18的总RNA，经过紫外分光光度计测定得0D26(1/28(lnm = 1.96，OD2607230nm = 1.7，琼脂糖电泳检测总RNA质量较好，可以用于下一步的反转录。总RNA浓度(μ g/mL) = OD260 X稀释倍数Χ40μ g/mL，以确定反转录总RNA的量。
4. mRNA荧光信号检测
(I)DEPC处理PCR管中依次加入
Total RNA5 μ g
引物 QO μ Μ)1 μ 1
dNTP-mix (dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 IOmM) 3 μ 1
DEPC 7jC5. 5 μ 1
(2) PCR仪中65°C保温lOmin，取出后迅速置于冰上冷却；
(3)向PCR管中依次加入
5X反转录缓冲液5μ1
反转录酶0. 5 μ 1
荧光标记核苷酸05 μ Μ)1μ 1
(4) PCR 仪中 45°C 保温 I2Omin ；
(5) 98°C水浴5min终止反应；
(6)加入2 μ IlOM氢氧化钠，混勻后，80°C水浴保温5min ；
(7) 12，OOOrpm,离心lOmin，转移上清于新的离心管中；
(8)加入4 μ 15Μ醋酸中和，等体积异丙醇(30 μ 1)，混勻，_20°C沉淀30min ；
(9) 12，OOOrpm,离心lOmin，并用体积分数为90%的乙醇200 μ 1洗涤沉淀2次；
(10) 100 μ 1无菌水溶解上述沉淀，用荧光分析仪测定荧光信号；
本实施例中荧光标记核苷酸为Cy5_dATP，荧光分析仪为Fluoroskan AscentLabsystems,荧光信号检测过程需避光操作。所测得假单孢菌MlSphzC mRNA荧光信号值0. 0132，Cy5激发波长649nm，发射波长670nm。
实施例3
用FluorX标记dGTP通过反转录检测假单胞菌M18结构基因phzC转录水平
1. phzC基因序列的确定
根据Pseudomonas aeruginosa 操纵子序列(AF005404)，设计 PCR 引物，从M18G 发酵液中提取基因组DNA，PCR放大，测序，得到phzC基因序列(EF491207)。
2.引物的设计和合成
根据phzC基因序列，设计上游引物。引物序列为
5， -TTCCAAGCCGCACGAGCAGGT-3，
3. RNA 提取
按照TRNzol试剂说明书提取Iml发酵4 假单孢菌M18的总RNA，经过紫外分光光度计测定得0D26(1/28(lnm = 1.96，OD2607230nm = 1.7，琼脂糖电泳检测总RNA质量较好，可以用于下一步的反转录。总RNA浓度(μ g/mL) = OD260 X稀释倍数Χ40μ g/mL，以确定反转录总RNA的量。
4. mRNA荧光信号检测
(I)DEPC处理PCR管中依次加入
Total RNA5 μ g
6[0095]引物 QO μ Μ)1 μ 1
dNTP-mix (dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 IOmM)3 μ 1
DEPC 7jC5. 5 μ 1
(2) PCR仪中65°C保温7. 5min，取出后迅速置于冰上冷却；
(3)向PCR管中依次加入
5X反转录缓冲液5μ1
反转录酶0·5μ1
荧光标记核苷酸(25 μ Μ)1μ 1
(4) PCR 仪中 43°C 保温 90min ；
96°C水浴5min终止反应；
(6)加入2 μ IlOM氢氧化钠，混勻后，70°C水浴保温5min ；
(7) 12，OOOrpm，离心lOmin，转移上清于新的离心管中；
(8)加入4 μ 15Μ醋酸中和，等体积异丙醇(30 μ 1)，混勻，_20°C沉淀30min ；
(9) 12，OOOrpm，离心lOmin，并用体积分数为75%的乙醇200 μ 1洗涤沉淀2次；
(10) 100 μ 1无菌水溶解上述沉淀，用荧光分析仪测定荧光信号；
本实施例中荧光标记核苷酸为FluorX-dGTP，荧光分析仪为Fluoroskan AscentLabsystems,荧光信号检测过程需避光操作。所测得假单孢菌MlSphzC mRNA荧光信号值0. 0196，FluorX激发波长494nm，发射波长520nm。
实施例4
用Cy7标记dTTP通过反转录检测假单胞菌M18结构基因phzC转录水平
l.phzC基因序列的确定
根据Pseudomonas aeruginosa 操纵子序列(AF005404)，设计 PCR 引物，从M18G 发酵液中提取基因组DNA，PCR放大，测序，得到phzC基因序列(EF491207)。
2.引物的设计和合成
根据phzC基因序列，设计上游引物。引物序列为
5 ’ -TTCCAAGCCGCACGAGCAGGT-3’
3. RNA 提取
按照TRNzol试剂说明书提取Iml发酵4 假单孢菌M18的总RNA，经过紫外分光光度计测定得0D26(1/28(lnm = 1.96，OD2607230nm = 1.7，琼脂糖电泳检测总RNA质量较好，可以用于下一步的反转录。总RNA浓度(μ g/mL) = OD260 X稀释倍数Χ40μ g/mL，以确定反转录总RNA的量。
4. mRNA荧光信号检测
(I)DEPC处PCR管中依次加入
Total RNA5μ g引物 QO μ Μ)1 μ 1
dNTP-mix (dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 IOmM)3 μ 1
DEPC 水5. 5μ1
(2) PCR仪中65°C保温8min，取出后迅速置于冰上冷却；
(3)向PCR管中依次加入[0128]5X反转录缓冲液5μ1
反转录酶0. 5μ1
荧光标记核苷酸(25 μ Μ)1μ 1
G)PCR 仪中 42°C 保温 60min ；
95°C水浴5min终止反应；
(6)加入2 μ IlOM氢氧化钠，混勻后，65°C水浴保温5min ；
(7) 12，OOOrpm，离心lOmin，转移上清于新的离心管中；
(8)加入4 μ 15Μ醋酸中和，等体积异丙醇(30 μ 1)，混勻，_20°C沉淀30min ；
(9) 12，OOOrpm，离心lOmin，并用体积分数为80%的乙醇200 μ 1洗涤沉淀2次；
(10) 100 μ 1无菌水溶解上述沉淀，用荧光分析仪测定荧光信号；
本实施例中荧光标记核苷酸为Cy7_dTTP，荧光分析仪为Fluoroskan AscentLabsystems,荧光信号检测过程需避光操作。所测得假单孢菌MlSphzC mRNA荧光信号值0. 0287, Cy7激发波长743nm，发射波长767nm。
实施例5
用FAM标记dCTP通过反转录检测假单胞菌M18结构基因phzC转录水平
l.phzC基因序列的确定
根据Pseudomonas aeruginosa 操纵子序列(AF005404)，设计 PCR 引物，从M18G 发酵液中提取基因组DNA，PCR放大，测序，得到phzC基因序列(EF491207)。
2.引物的设计和合成
根据phzC基因序列，设计上游引物。引物序列为
5， -TTCCAAGCCGCACGAGCAGGT-3，
3. RNA 提取
按照TRNzol试剂说明书提取Iml发酵4 假单孢菌M18的总RNA，经过紫外分光光度计测定得0D26(1/28(lnm = 1.96，OD2607230nm = 1.7，琼脂糖电泳检测总RNA质量较好，可以用于下一步的反转录。总RNA浓度(μ g/mL) = OD260 X稀释倍数Χ40μ g/mL，以确定反转录总RNA的量。
4. mRNA荧光信号检测
(I)DEPC处理PCR管中依次加入
Total RNA5μ g
引物 QO μ Μ)1 μ 1
dNTP-mix (dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 IOmM)3 μ 1
DEPC 7jC5. 5 μ 1
(2) PCR仪中65°C保温5min，取出后迅速置于冰上冷却；
(3)向PCR管中依次加入
5X反转录缓冲液5μ1
反转录酶0. 5μ1
荧光标记核苷酸(25 μ Μ)1 μ 1
(4) PCR 仪中 42°C 保温 60min ；
95°C水浴5min终止反应；[0161](6)加入2 μ IlOM氢氧化钠，混勻后，70°C水浴保温5min ；
(7) 12，OOOrpm，离心lOmin，转移上清于新的离心管中；
(8)加入4 μ 15Μ醋酸中和，等体积异丙醇(30 μ 1)，混勻，_20°C沉淀30min ；
(9) 12，OOOrpm，离心lOmin，并用体积分数为80%的乙醇200 μ 1洗涤沉淀2次；
(10) 100 μ 1无菌水溶解上述沉淀，用荧光分析仪测定荧光信号；
本实施例中荧光标记核苷酸为FAM-dCTP，荧光分析仪为Fluoroskan AscentLabsystems,荧光信号检测过程需避光操作。所测得假单孢菌MlSphzC mRNA荧光信号值0. 0287, FAM激发波长494nm，发射波长522nm。
权利要求
1.一种用荧光标记核苷酸反转录检测菌体RNA转录水平的方法，其特征在于，包括如下步骤第一步，反转录引物设计根据所测目的基因具体序列，设计上游引物用于RNA的反转录；第二步，提取菌体RNA，用OD26W和琼脂糖电泳检查RNA的纯度和完整性； 第三步，荧光标记和荧光信号检测①在DEPC处理过的PCR管中依次加入菌体RNA，反转录引物，dATP、dTTP、dGTP、dCTP， DEPC 水；②PCR仪中65°C保温5 lOmin，取出后迅速置于冰上冷却；③向PCR管中依次加入反转录缓冲液及其反转录酶，荧光标记核苷酸；④42 45°C保温60 120min；⑤94 98°C终止反应，⑥加入氢氧化钠，混勻，60 80°C保温5min；⑦12，000rpm，离心lOmin，取上清；⑧醋酸中和，加入异丙醇，混勻，沉淀30min；⑨12，OOOrpm，离心lOmin，用乙醇洗涤沉淀；⑩无菌水溶解沉淀，用荧光分析仪测定荧光信号。
2.根据权利要求
1所述的用荧光标记核苷酸反转录检测菌体RNA转录水平的方法，其特征是，所述RNA荧光信号检测过程避光操作。
3.根据权利要求
1所述的用荧光标记核苷酸反转录检测菌体RNA转录水平的方法，其特征是，所述的荧光标记核苷酸，其采用的荧光标记染料为Cy系列、FAM、Texas Red中一种。
4.根据权利要求
1或3所述的用荧光标记核苷酸反转录检测菌体RNA转录水平的方法，其特征是，所述的核苷酸为脱氧胞苷三磷酸、脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸或脱氧胸腺苷三磷酸中一种。
5.根据权利要求
1所述的用荧光标记核苷酸反转录检测菌体RNA转录水平的方法，其特征是，第三步⑨中，所用乙醇，其体积分数为70 90%。
专利摘要
本发明公开一种生物工程技术领域：
的用荧光标记核苷酸反转录检测菌体RNA转录水平的方法，步骤为根据菌体目的基因序列设计并合成上游引物，提取总RNA后，运用反转录酶将荧光标记核苷酸整合到cDNA中，通过异丙醇沉淀得到DNA，并用乙醇洗涤游离荧光标记核苷酸，以使DNA信号测定准确，用荧光分析仪测定荧光信号。本发明方法新颖，与其他运用荧光标记探针测定菌体转录水平的方法相比，步骤简单，节约时间，不需要复杂的仪器。
文档编号G01N21/64GKCN101368216 B发布类型授权 专利申请号CN 200810200931
公开日2012年5月30日 申请日期2008年10月9日
发明者何静, 尹晓武, 李荣秀, 董德贤, 高倩 申请人:上海交通大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),