用于降低酵母双杂交文库假阴性率的反转录方法
【专利摘要】本发明涉及用于降低酵母双杂交文库假阴性率的反转录方法，包括增加两条5’反转录引物，反转录时使用3μg总RNA，每一种5’反转录引物使用1μg总RNA，反转录结束后，3份样本分别进行LD?PCR扩增，扩增结束后将PCR产物进行后续检测，对T?克隆序列进行测序时需要确定所增加的A必须存在，检测结果正确后，将三种PCR产物混合后进行后续建库实验。本发明改变了总RNA的反转录策略，降低了酵母双杂交文库的假阴性率。
【专利说明】
用于降低酵母双杂交文库假阴性率的反转录方法
技术领域
[0001] 本发明设及表达文库制备领域，具体设及一种用于降低酵母双杂交文库假阴性效 率的反转录方法。
【背景技术】
[0002] 酵母双杂交(Yeast two hybrid)技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的 相互作用，已被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域，从而成为分 子生物学研究领域的重要实验手段。该方法建立W来，经过不断完善和发展，不但可W检测 已知蛋白质之间的相互作用，更重要的在于发现与已知蛋白相互作用的未知蛋白。
[0003] 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录调控起始过程的认识。细胞起始基 因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结 构上是组件式的(modular),往往由两个或两个W上结构上可W分开的，功能上互相独立的 结构域(domain)构成，其中有DNA结合功能域(；DNA binding domain，DNA-BD)和转录激活结 构域(activation doman，DNA-AD)。运两个结构域在分开时仍然分别具有各自的功能，但是 由于空间上的距离，导致不能激活转录，只有当两个结构域通过适当的途径在空间上较为 接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（Upstream activating sequence，UAS)的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。
[0004] 根据运个特性，将编码DNA-抓的基因与编码诱巧蛋白（Bait protein)的基因构建 在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白抓-Bait protein;将编码DNA-AD的基 因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上，同时将上述两种载体转化改造后的酵 母，运种改造后的酵母细胞既不能产生GAL4,又不能合成LEU、TRP、HIS和ADE等氨基酸，因此 当将运种酵母培养在缺乏上述四种氨基酸的培养基时酵母无法生长。当上述两种载体所表 达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基 因^5、406、1^\〔2、1611，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母 菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析， W便确定诱巧蛋白和祀蛋白是否存在相互作用。
[0005] Clontech公司研发了 Mate&Plate?文库。在合适的基本选择培养基上，将酵母pr巧 文库与bait菌株通过简单的共培养即可筛选出与已知蛋白相互作用的prey蛋白。使用 "Mate&Plate?"酵母文库构建系统（Cat.No.630490)可W运用简单的方法构建高效的 "Mate&Plate酵母文库"，原理是利用啤酒的同源重组机制，在Y187的酵母菌完成载体的重 组，无需使用大肠杆菌克隆、扩增和筛选文库。但是由于酵母文库是一种蛋白表达文库，载 体上的cDNA序列需要被翻译成蛋白质起作用，而错误的读码框会造成蛋白翻译效率下降或 产生错误蛋白而降低文库的阳性信号率，造成假阴性。
[0006] 因此，发展一种降低酵母双杂交文库假阴性率的反转录方法，降低文库筛库过程 中可能产生的假阴性是亟待解决的问题。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术存在的上述技术问题，本发明人在进行了大量的深入研究之 后，从而提供了一种降低酵母双杂交文库假阴性率的反转录方法，可降低酵母文库筛库过 程中可能产生的假阴性率。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于降低酵母双杂交文 库假阴性率的反转录方法，总RNA反转录时，增加酵母双杂交文库一链5'反转录引物，在已 有5'反转录引物的3'末端的3个G前面分别加上1个碱基A(SMIII-A)和2个碱基A(SMIII- AA)，得到增加的两条5'反转录引物，并将=组反转录产物混合建库，所得到的文库读码框 正确率提高W达到降低筛假阳性率的目的。
[0009] 优选的，所述用于降低酵母双杂交文库假阴性率的反转录方法，包括如下具体步 骤：
[0010] (1)引物设计合成:通过对酵母双杂交文库构建试剂盒提供的一链5 '反转录引物 的3'末端的3个G前面分别添加一个碱基A和两个碱基A，得到增加的两条5'反转录引物；
[0011] (2)反转录；
[0012] (3)LD-PCR；
[0013] (4)PCR 产物纯化；
[0014] (5)酵母文库的克隆；
[0015] (6)PCR鉴定酵母文库的克隆插入片段大小并测序。
[0016] 进一步优选的，步骤（1)中，所述两条5'反转录引物溶解成10咖浓度的引物溶液， 备用。
[0017] 进一步优选的，步骤(2)中，所述反转录的具体过程如下:准备化g总RNA，平均分成 3份，加入CDSII1/3 'PCR引物化L并补水至总体积化L，72°C溫育5分钟，冰浴2分钟，加入5 X 一链缓冲液化L，20mM的DTT 1化，lOmM的dNTP 1化及化L的MMLV反转录酶，42°C溫育10分钟， 再在S管样本中分别加入化L SMIII、SMIII-A和SMIII-AA，42°C溫育1小时，反应结束后，75 °C溫育10分钟终止反应，室溫冷却5分钟，加入化L RNase H后，于37°C放置20分钟。
[0018] 进一步优选的，步骤(3)中，所述LD-PCR的具体过程如下：PCR仪预热到95°C，S管 加了不同SMART III引物的样本分别取化L cDNA-链产物，7化L d地2〇，10化Advantage 2 PCR缓冲液，2化lOXGC-Melt溶液，2化50XdNTP混合物，2化5'PCR引物，2化3'PCR引物 和化L 50 X Advan化ge 2聚合酶，混匀后，离屯、放入预热到95°C的PCR仪中，运行PCR程序:95 °C，30秒1个循环;95°C，15秒;68°C，6分钟，24个循环，并且每个循环结束后，68°C作用时间 再延长5秒，反应完成后，68°C保溫5分钟。
[0019] 进一步优选的，步骤(4)中，所述PCR产物纯化的具体过程如下:反应扩增反应结束 后，等量合并扩增产物进行后续割胶纯化步骤，配制质量比1 %的琼脂糖凝胶，将扩增好的 样品进行电泳，140V电压，30-40分钟，电泳结束后，切取化bW上的片段进行DNA片段的胶回 收。
[0020] 进一步优选的，步骤(5)中，所述酵母文库的克隆的具体过程如下:合并纯化后的 PCR产物取80ng，2 X连接缓冲液化L，加50ng/iiL的T载体0.扣L，补dd出0至总体积10化，4°C 连接过夜，D册a感受态转化后涂板，蓝白斑筛选，37 °C培养过夜。
[0021] 进一步优选的，步骤(6)的具体过程如下:每个文库随机挑取24个白斑克隆，并用 10化此0稀释后，各取1化作为扩增模板，并将PCR产物送测序，确定接头序列存在S种状 态。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明在总RNA反转录时，增加了两条 5'反转录引物，反转录时使用化g总RNA，每一种5'反转录引物使用liig总RNA，反转录结束 后，3份样本分别进行LD-PCR扩增，扩增结束后将PCR产物进行后续检测，对T-克隆序列进行 测序时需要确定所增加的A必须存在，检测结果正确后，将S种PCR产物混合后进行后续建 库实验。本发明改变了总RNA的反转录策略，降低了酵母双杂交文库的假阴性率。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。W下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不W任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进。运些都属于本发明 的保护范围。
[0024] -种用于降低酵母双杂交文库(Clontech文库)假阴性率的反转录方法，由如下具 体步骤组成：
[0025] (1)引物设计合成:通过对酵母双杂交文库(Clontech文库）构建试剂盒提供的一 链5/反转录引物的y末端的3个G前面分别添加一个碱基A(SMIII-A，其序列如SEQ ID N0.1 所示)和两个碱基4(51111-44，其序列如56〇10^.2所示），得到增加的两条5/反转录引物 (增加的两条5/反转录引物的序列如表1所示），溶解成lOiiM浓度的引物溶液，备用；
[0026] 表1:增加的两条5/反转录引物的序列
[0027]
[0028] (2)反转录:准备化g总RNA，平均分成3份，加入CDSII1/3 ' PCR引物化L并补水至总 体积化L，72°C溫育5分钟，冰浴2分钟，加入5 X -链缓冲液化L，20mM的DTT化L，lOmM的dNTP 1化及化L的MMLV反转录酶，42°C溫育10分钟，再在S管样本中分别加入化L SMIII、SMIII-A 和SMIII-AA，42 °C溫育1小时，反应结束后，75 °C溫育10分钟终止反应，室溫冷却5分钟，加入 化L RNase H后，于37°C放置20分钟；
[0029] (3)LD-PCR:PCR仪预热到95°C，S管加了不同SMART III引物的样本分别取化L cDNA-链产物，70化d地2〇，10化Advan化ge 2 PCR缓冲液，2化lOXGC-Melt溶液，2化50 XdNTP混合物，2化5'PCR引物，2化3'PCR引物和化L 50XAdvantage 2聚合酶，混匀后，稍 稍离屯、放入预热到95°C的PCR仪中，运行PCR程序:95°C，30秒1个循环;95°C，15秒;68°C，6分 钟，24个循环，并且每个循环结束后，68°C作用时间再延长5秒，反应完成后，68°C保溫5分 钟；
[0030] (4)PCR产物纯化:反应扩增反应结束后，等量合并扩增产物进行后续割胶纯化步 骤，配制质量比1%的琼脂糖凝胶，将扩增好的样品进行电泳，140V电压，30-40分钟，电泳结 束后，切取IkbW上的片段进行DNA片段的胶回收，使用QIAGEN公司的胶回收试剂盒 QIAquick Gel Extraction kitWat.No.28706);
[0031 ] (5)酵母文库的克隆(T载体克隆）：合并纯化后的PCR产物取80ng，2 X连接缓冲液5 化，加 SOngAiL的T载体0.化L，补dd此0至总体积10化，4°C连接过夜，D册a感受态转化后涂 板，蓝白斑筛选，37 °C培养过夜；
[0032] (6)PCR鉴定酵母文库的克隆插入片段大小并测序:每个文库随机挑取24个白斑克 隆，并用10化此0稀释后，各取化L作为扩增模板，并将PCR产物送测序（增加的两种反转录 的产物测序结果如表2所示），确定接头序列存在=种状态。
[0033] 表2:增加的两种反转录的产物测序结果 [00341
[0035] 本实施例在总RNA反转录时，增加了两条5'反转录引物，反转录时使用化g总RNA， 每一种5'反转录引物使用化g总RNA，反转录结束后，3份样本分别进行LD-PCR扩增，扩增结 束后将PCR产物进行后续检测，对T-克隆序列进行测序时需要确定所增加的A必须存在，检 测结果正确后，将S种PCR产物混合后进行后续建库实验，本发明通过改变总RNA的反转录 策略降低了酵母双杂交文库的假阴性率。
[0036] W上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可W在权利要求的范围内做出各种变形或修改，运并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 用于降低酵母双杂交文库假阴性率的反转录方法，其特征在于，总RNA反转录时，增 加酵母双杂交文库一链5'反转录引物，在已有5'反转录引物的3'末端的3个G前面分别加上 1个碱基A和2个碱基A，得到增加的两条5 '反转录引物，并将三组反转录产物混合建库。2. 如权利要求1所述的用于降低酵母双杂交文库假阴性率的反转录方法，其特征在于， 包括如下具体步骤： (1) 引物设计合成:通过对酵母双杂交文库构建试剂盒提供的一链5'反转录引物的3' 末端的3个G前面分别添加一个碱基A和两个碱基A，得到增加的两条5'反转录引物； (2) 反转录； (3) LD-PCR； (4) PCR产物纯化； (5) 酵母文库的克隆； (6) PCR鉴定酵母文库的克隆插入片段大小并测序。3. 如权利要求2所述的用于降低酵母双杂交文库假阴性率的反转录方法，其特征在于， 步骤(1)中，所述两条5'反转录引物溶解成ΙΟμΜ浓度的引物溶液，备用。4. 如权利要求2所述的用于降低酵母双杂交文库假阴性率的反转录方法，其特征在于， 步骤⑵中，所述反转录的具体过程如下:准备3yg总RNA，平均分成3份，加入CDSIII/3'PCR 引物lyL并补水至总体积4yL，72 °C温育5分钟，冰浴2分钟，加入5 X -链缓冲液2yL，20mM的 DTT lyL，10mM的dNTP lyL及lyL的MMLV反转录酶，42°C温育10分钟，再在三管样本中分别加 入lyL SMIII、SMIII-A和SMIII-AA，42°C温育1小时，反应结束后，75°C温育10分钟终止反 应，室温冷却5分钟，加入lyL RNase Η后，于37°C放置20分钟。5. 如权利要求2所述的用于降低酵母双杂交文库假阴性率的反转录方法，其特征在于， 步骤(3)中，所述LD-PCR的具体过程如下:PCR仪预热到95°C，三管加了不同SMART III引物 的样本分别取2yL cDNA-链产物，70yL ddH20，10yL Advantage 2PCR缓冲液，2yL 10 XGC-Melt溶液，2yL 50XdNTP混合物，2yL 5'PCR引物，2yL 3'PCR引物和2yL 50XAdvantage 2 聚合酶，混匀后，离心放入预热到95°C的PCR仪中，运行PCR程序:95°C，30秒1个循环;95°C， 15秒;68 °C，6分钟，24个循环，并且每个循环结束后，68°C作用时间再延长5秒，反应完成后， 68 °C保温5分钟。6. 如权利要求2所述的用于降低酵母双杂交文库假阴性率的反转录方法，其特征在于， 步骤(4)中，所述PCR产物纯化的具体过程如下:反应扩增反应结束后，等量合并扩增产物进 行后续割胶纯化步骤，配制质量比1%的琼脂糖凝胶，将扩增好的样品进行电泳，140V电压， 30-40分钟，电泳结束后，切取lkb以上的片段进行DNA片段的胶回收。7. 如权利要求2所述的用于降低酵母双杂交文库假阴性率的反转录方法，其特征在于， 步骤(5)中，所述酵母文库的克隆的具体过程如下：合并纯化后的PCR产物取80ng，2X连接 缓冲液5yL，加50ng/yL的T载体0.5yL，补ddH 20至总体积1 OyL，4 °C连接过夜，DH5a感受态转 化后涂板，蓝白斑筛选，37 °C培养过夜。8. 如权利要求2所述的用于降低酵母双杂交文库假阴性率的反转录方法，其特征在于， 步骤(6)的具体过程如下:每个文库随机挑取24个白斑克隆，并用10yL H20稀释后，各取UiL 作为扩增模板，并将PCR产物送测序，确定接头序列存在三种状态。
【文档编号】C12N15/10GK106047862SQ201610397749
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】肖云平, 赵仕兰, 李晖
【申请人】上海欧易生物医学科技有限公司