一种鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼的试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及3种黄颡鱼苗种的鉴定，具体地，涉及一种鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及 其杂交黄颡鱼的试剂盒及其使用方法，属于水产生物技术领域，应用于苗种鉴定及种质标 准制定。
【背景技术】
[0002]黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco)和瓦氏黄颡鱼（Pelteobagrus vachelli)均 隶属于鳇科（Bagridae)、黄颡鱼属（Pelteobagrus)鱼类，是黄颡鱼属已知的5个种类中经 济价值最高的两个种类。黄颡鱼适于池塘养殖，其耐低氧能力比瓦氏黄颡鱼高，但其个体较 小，生长速度较慢，在高密度的池塘养殖中，当年苗种较难长到上市规格；瓦氏黄颡鱼人工 养殖条件下1龄鱼即可上市。通过黄颡鱼（早）和瓦氏黄颡鱼（纟）杂交所获得的杂交黄 颡鱼具有体色诱人（黄褐色）、生长快速、抗逆性强（如比瓦氏黄颡鱼耐低氧和耐高温）等 优势。近年来，由于杂交黄颡鱼杂交优势的凸显，其养殖户愈来愈多，由此，如何识别杂交黄 颡鱼苗种变得越来越重要。由于黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交黄颡鱼亲缘关系相近，采用传 统的外观形状观察，主观性强，也很难进行有效的区分。因此，迫切需要开发一种鉴别黄颡 鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼的试剂盒应用于生产实践。
[0003] 微卫星是由2-6个核苷酸组成的具有高度变异性的简单重复DNA序列。广泛分布 于真核生物基因组中，具有信息含量大、共显性遗传、重复性好、特异性强、分布广及可快速 检测等优点。微卫星标记现已在水产动物的群体遗传结构的分析、物种遗传多样性的鉴定 以及遗传基因连锁图谱的构建等方面得到应用。同时微卫星侧翼序列在亲缘关系较近或种 属间相当保守。本发明在不处死鱼种的基础上，只需剪去少量尾鳍或其它鱼体组织部分，利 用微卫星标记对黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交黄颡鱼进行鉴别。可显著提高黄颡鱼属重要 经济苗种鉴定的效率和准确性，有助于黄颡鱼属鱼类遗传资源的保护和黄颡鱼养殖业的持 续健康发展。
[0004] 目前，尚未见将微卫星标记应用于鉴定不同种黄颡鱼属鱼类的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼的微卫星引 物。
[0006] 本发明另一目的是提供一种含有上述引物的检测试剂盒。该试剂盒准确度高、稳 定性强、重复性好、操作简单。可完善黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼苗种的鉴别方法，提 升黄颡鱼种质鉴别技术水平。
[0007] 本发明又一目的是提供一种鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼的检测方法。 弥补传统形态学鉴定法所存在的主观性强且不能有效地鉴定三种鱼苗的不足，解决水产养 殖及科研工作中黄颡鱼属鱼类苗种鉴定的难题。
[0008] 为实现本发明的目的，本发明的技术方案是：一种用于鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及 杂交黄颡鱼的引物，其序列为：
[0009] F:5' -TGTAAAACGACGGCCAGTAAACGCCAAAGAACCTGATG-3'（SEQ ID NO. 1);
[0010] R :5' -CTGACAAGACTGCAGCAAGC-3'（SEQ ID NO. 2)
[0011] 一种鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼的试剂盒，包括下列组成：
[0012] 试剂一 ：10 yM焚光引物，其序列为：
[0013] 5' -TGTAAAACGACGGCCAGTAAACGCCAAAGAACCTGATG-3，
[0014] 试剂二：10 yM反向引物，其序列为：
[0015] 5, -CTGACAAGACTGCAGCAAGC-3，
[0016] 试剂三：PCR 反应液，每 8. 8 y L 包括 M13-FAM (0. 16 y L)、灭菌水（5. 77 y L)， 10 X buffer 缓冲液（+Mg2+) (1. 77 y L)，2mM 的 dNTPs (1 y L)，5U 的 Taq 酶（0? 1 y L)
[0017] 一种利用上述试剂盒鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼的方法，包括下列步 骤：
[0018] 1)提取待鉴定的黄颡鱼或瓦氏黄颡鱼或杂交黄颡鱼DNA。
[0019] 2)用上述引物对待鉴定样本DNA进行PCR扩增，获得PCR产物。
[0020] 3)PCR产物在ABI 3500x1分析仪上进行毛细管电泳并进行图谱分析，与DL600 Marker标准图谱进行对比，在220bp位置扩增出1条特异性DNA条带的，则鉴定为普通黄颡 鱼；在243bp位置扩增出1条特异性DNA条带的，则鉴定为瓦氏黄颡鱼；在220bp和243bp 位置各扩增出1条特异性DNA条带的，则鉴定为杂交黄颡鱼。
[0021] 本发明的优点在于：
[0022] 黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼在苗种阶段不易通过形态特征进行识别，本发 明应用PCR和STR分型等组合技术筛选和研制出一种可快速、准确地鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡 鱼及其杂交黄颡鱼的微卫星引物和试剂盒，该试剂盒可服务于研宄黄颡鱼的科研及推广单 位、苗种生产企业（繁育场）及养殖户，一方面可用于鉴别3种黄颡鱼（黄颡鱼、瓦氏黄颡 鱼及其杂交黄颡鱼）苗种，另一方面，可用于黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交黄颡鱼的种质标准 制定，为以后杂交黄颡鱼新品种的培育奠定理论基础。
【附图说明】
[0023] 图1本试剂盒中引物自上而下在黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼3个群体中的 扩增结果。
【具体实施方式】
[0024] 以下结合附图实施例对本发明作进一步的详细描述。具体参数为说明本发明技术 方案所需，不应理解为对本发明保护范围的限制。
[0025] 实施例
[0026] 1 ?设计引物
[0027] 设计一对特异性的PCR扩增引物，引物序列为：
[0028] F:5' -TGTAAAACGACGGCCAGTAAACGCCAAAGAACCTGATG-3'（SEQ ID NO. 1);
[0029]R :5' -CTGACAAGACTGCAGCAAGC-3'（SEQ ID NO. 2)
[0030] 2?采取样本
[0031] 取待鉴别的鱼类样本。本发明选择黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼全体各32 尾，有足够数量，因此获得的结果具有统计学意义，准确可靠。
[0032] 3?提取样本的DNA
[0033] 采用上海捷瑞公司的细胞/组织基因DNA提取试剂盒快速提取采取样本的DNA，试 剂盒提取样品DNA较之传统方法提取样品DNA具有提取效率高、速度快、提取DNA质量高等 特点。
[0034] 4?进行PCR扩增
[0035] 用PCR仪检验1中引物在黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼中的扩增情况。
[0036] 1)PCR扩增体系
[0037] PCR扩增反应体系如下：试剂一（0. 04 y L)，试剂二（0. 16 y L)，试剂三（8. 8 y L)， 待鉴别的鱼类DNA样本（1 y L)。
[0038] 2)PCR扩增反应
[0039] 在PCR扩增仪上于94 °C预变性5min，32个循环：94 °C变性30sec，58 °C下退火 45sec，72°C延伸45sec，之后94°C预变性5min，8个循环：94°C变性30sec，53°C下退火 45sec，72°C延伸 45sec，最后 72°C延伸 10min，4°C保存。
[0040] 5?扩增产物的电泳及鉴定
[0041] 1)PCR产物在ABI 3500x1分析仪上进行毛细管电泳，记录电泳结果；
[0042] 2)与DL600Marker标准图谱进行对比：与标准图谱对比，读出待测样品的目的条 带所处的位置，如检测样本在靠近标准图谱220bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定 为是普通黄颡鱼；检测样本在靠近标准图谱243bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定 为瓦氏黄颡鱼；在靠近标准图谱220bp和243bp位置扩增出2条特异性DNA条带，则鉴定为 杂交黄颡鱼。
【主权项】
1. 一种鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼的引物，其特征在于，所述引物序列如 SEQIDNo. 1和 SEQIDNo. 2。
2. -种鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼的试剂盒，包括PCR反应液和引物，其特 征在于，所述引物的序列如SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示。
3. -种鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取待鉴定的黄颡鱼或瓦氏黄颡鱼或杂交黄颡鱼DNA。 2) 用序列如SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示的引物对待鉴定样本DNA进行PCR扩 增，获得PCR产物。 3. PCR产物在ABI3500x1分析仪上进行毛细管电泳并进行图谱分析，与DL600Marker 标准图谱进行对比，在220bp位置扩增出1条特异性DNA条带的，则鉴定为普通黄颡鱼；在 243bp位置扩增出1条特异性DNA条带的，则鉴定为瓦氏黄颡鱼；在220bp和243bp位置各 扩增出1条特异性DNA条带的，则鉴定为杂交黄颡鱼。
4. 如权利要求3所述的鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼的方法，其特征在于， PCR体系为IOyL:即为在200 yL PCR反应管中加入M13-FAM0.16 yL、灭菌水5.77 yL， IOXbufTer 缓冲液（+Mg2+) 1. 77yL、2mM 的 dNTPsIyL、5U 的 Taq 酶 0?IyL、浓度为IOpm/ yL的上游荧光引物0. 04 yL，浓度为10pm/yL的下游引物0. 16 yL，待鉴定样品的DNA样 本 IyL0
5. 如权利要求3所述的鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼的方法，其特征在于， 所述PCR扩增的反应条件为：94°C预变性5min，32个循环：94°C变性30sec，58°C下退火 45sec，72°C延伸45sec，之后94°C预变性5min，8个循环：94°C变性30sec，53°C下退火 45sec，72°C延伸 45sec，最后 72°C延伸 10min，4°C保存。
【专利摘要】本发明公开了一鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼的引物、试剂盒及方法，所引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。所述试剂盒包括上述引物和PCR反应液。本发明应用PCR和STR分型等组合技术筛选和研制出一种可快速、准确地鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼的微卫星引物和试剂盒，该试剂盒可服务于研究黄颡鱼的科研及推广单位、苗种生产企业(繁育场)及养殖户，一方面可用于鉴别三种黄颡鱼(黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交黄颡鱼)苗种，另一方面，可用于黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交黄颡鱼的种质标准制定。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104789676
【申请号】CN201510187408
【发明人】陶攀峰, 尹绍武, 王若然, 陈嘉玮
【申请人】南京师范大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月20日