基于dna条形码登革热传播媒介白纹伊蚊标准基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于DNA条形码登革热传播媒介白纹伊 蚊标准基因及应用。
【背景技术】
[0002] 目前昆虫媒介生物的传统鉴定方法为形态学鉴定方法，主要是依靠具有形态学鉴 定经验、媒介生物形态鉴定知识的实验室专业人员根据医学媒介分类检索表进行种类鉴 定。但种类相近昆虫的卵、蛹、幼虫、成虫的虫体形态特征差异小，有些特征在不同的发育时 期不够稳定，在鉴定分类上增加了难度。而且一些口岸截获的卵、蛹和幼虫等非成虫状态， 往往需要将其培养成成虫后再进行鉴定，整个鉴定过程大致需要数周的时间，如果截获的 是残缺种类或者是少见的国外种类，还要请国外专家协助鉴定，鉴定所需的时间就更多了。
[0003] 近代分子生物学技术的兴起，DNA条形码（DNA Barcoding)技术已经成为生物分类 和鉴定的新方向，是传统形态学鉴定的重要补充。DNA条形码技术指的是通过特定DNA片段 的核酸序列代表特定生物信息，达到识别生物的目的。该概念是在分子生物学和信息技术 发展的基础上，由加拿大生物学家Hebert首先提出，因其有不受发育阶段影响、不受个体 形态特征影响、不受物种的限制、可以鉴定出群体中的隐存分类单元、获取信息量大、精确 性高、操作简便且高效等优点使得DNA条形码技术受到分类鉴定工作者的普遍欢迎，并迅 速发展成为学科前沿之一。Herbert倡导利用线粒体C0I基因（线粒体细胞色素氧化酶亚 基I基因）作为通用序列，建立全球性的物种鉴别系统。与其它基因片段相比，C0I基因有 许多优点，相对保守又有足够的变异，并且序列长度适中（Hebert et al.，2003b) 登革热是由登革病毒引起的虫媒病毒性疾病，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。广 泛流行于热带和亚热带地区，目前已成为全球主要的公共卫生问题，每年的发病国家数，国 家发病人数都在增加。媒介调查和病毒分离证明，传播媒介是白纹伊蚊和埃及伊蚊在无埃 及伊蚊的地区，白纹伊蚊是当地登革热流行的唯一或主要传播媒介。
[0004] 白纹伊蚊（Ues a从属于双翅目（Diptera)长角亚目（Nematocera)蚊 科（Culicidac)伊蚊属（Aedes)，是登革热的重要传播媒介，在我国分布广泛，以北炜30。以 南省份地区为甚，包括海南、台湾、广东、广西、福建、浙江、江西、湖南、贵州、重庆和云南等 省。在福建全省分布着不同种间、不同地理株蚊虫其生态习性与传播疾病类别、能力有一定 的差异，故蚊虫的系统分类有重要的意义。从生理特征、形态结构中辨别的传统形态学在蚊 虫的系统分类发展史中具有重要的意义，但由于存在诸如形态特征信息量的不足，趋同进 化的干扰等客观条件的限制使得传统的形态学在蚊虫复合体近缘种鉴别产生困难，而分子 生物学技术拟补了这不足。
[0005] 由于目前没有登革热疫苗以及特效的临床治疗办法，因此控制登革热的流行，媒 介蚊虫的防制成为重要的手段。不同地理株蚊虫的生态习性、媒介效能影响了其流行病学 特征，在形态接近的情况下难以用传统的形态学鉴别手段加以区分。为了保证实施有效的 媒介控制策略，运用分子生物学技术，通过检测蚊虫基因，是评估登革热传播风险的分子基 础。
【发明内容】
[0006] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于鉴定白纹伊蚊 的DNA条形码标准基因。
[0007] 本发明的另一目的在于提供所述的基于DNA条形码登革热传播媒介白纹伊蚊标 准基因及应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明所述的用于鉴定白纹伊蚊的DNA条 形码标准基因，其特征在于：所述条形码标准基因为CO I基因，为如下所述的基因序列SEQ ID NO. 1 ：
【主权项】
1. 一种用于鉴定白纹伊蚊的DNA条形码标准基因，其特征在于：所述条形码标准基因 为CO I基因，为如下所述的基因序列SEQ ID NO. 1 : aacattatac tttattttcg gtatttgatc tggaatagtc ggaacttcac taagagtttt 60 aattcgtatt gaacttagac atcctggtat atttattgga aatgatcaaa tttataatgt 120 aattgttact gctcatgctt ttattataat tttttttata gtaataccta tcataattgg 180 aggatttgga aactgactag tacccttaat actaggagcc cctgatatag cttttcctcg 240 aataaataat ataagttttt gaatattacc cccctcttta acactactgc tttctagttc 300 tatagtagaa aacggagctg gaacagggtg aacggtttat cctcctcttt cttctggaac 360 agctcatgct ggggcttcag ttgatttagc aattttttct ttacatttag cgggaatctc 420 atctatttta ggagcagtaa attttattac aactgtaatt aatatacgat cagctggtat 480 tactcttgat cgactacctt tatttgtgtg atcagtagta attacagcta ttttattact 540 tctttctcta cccgtattag ccggagctat tactatatta ttaacagacc gaaatttaaa 600 tacatctttt tttgatccaa ttggaggggg agaccctatt ttatatcaac atttattt 658〇
2. 权利要求1所述的用于鉴定白纹伊蚊的DNA条形码标准基因在鉴定待检标本中的应 用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的待检标本为非成虫虫态、残缺不全 的虫体或成虫。
4. 一种重组载体，其特征在于：将权利要求1所述的用于鉴定白纹伊蚊的DNA条形码 标准基因与载体构建得到。
5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述的载体为克隆载体。
6. 根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述的载体为T载体。
7. -种鉴定白纹伊蚊的分子生物学方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 提取待检标本的DNA ; (2) 以该DNA为模板使用如下引物进行PCR，得到PCR产物； 正向引物 Lcol490 :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATAITGG-3'； 反向引物 Hco2198 :5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'； (3) 将PCR产物进行电泳分析；如果能扩增出658bp的条带，则送生物公司测序； (4) 当测序得到的结果与基因序列SEQ ID NO. 1的的同源性在98%以上时，则能判断待 检标本为白纹伊蚊。
8. 根据权利要求7所述的鉴定白纹伊蚊的分子生物学方法，其特征在于：步骤（1)中所 述的待检标本为非成虫虫态、残缺不全的虫体或成虫。
9. 根据权利要求7所述的鉴定白纹伊蚊的分子生物学方法，其特征在于：步骤（2)中所 述的PCR的条件为：94°C变性 3min; 94°C30S、55°C30S、72°C45S，30 个循环；72°C延伸 5min； 步骤（2)中所述的PCR的体系为：10倍含有20 mM Mg2+Plus的汉7? Buffer缓冲 液 5W，2. 5mM dNTPs 4W，10mM 的正向引物 Lcol4901W，10mM 的反向引物 Hco21981W， TaKaRa EX Taq 0.25rt，基因组 DNA 8耵，用 ddH20 补足 50W ; 步骤（2)中所述的PCR在进行时设置阴性对照和阳性对照； 所述的阳性对照为基因序列SEQ ID NO. 1或含有基因序列SEQ ID NO. 1 ; 步骤（3)中所述的目的条带为在DNAMarker700bp条带位置的电泳带，或是与阳性对 照同一位置的电泳带。
10.根据权利要求9所述的鉴定白纹伊蚊的分子生物学方法，其特征在于：所述的含有 基因序列SEQIDNO. 1为将该基因序列SEQIDNO. 1与载体构建得到的重组载体。
【专利摘要】本发明公开一种基于DNA条形码登革热传播媒介白纹伊蚊标准基因及应用。所述用于鉴定白纹伊蚊的DNA条形码标准基因，为COⅠ基因，为基因序列SEQ ID NO.1。本发明的用于鉴定白纹伊蚊的DNA条形码标准基因应用于鉴定待检标本是否为白纹伊蚊。该DNA条形码标准基因的应用，实现了对蛹、幼虫等非成虫态、残缺不全的虫体以及成虫的快速鉴定；且克服了现有技术中的如下不足之处：对非成虫态需要培养，耗时较长；对残缺不全的虫体基本上不能检测；对成虫的检测需要对白纹伊蚊形态非常熟悉的专业人员。
【IPC分类】C12N15-53, C12Q1-68
【公开号】CN104789666
【申请号】CN201510157758
【发明人】方义亮, 张建庆, 高博, 吴荣泉, 钱茜茜, 游小花
【申请人】福建国际旅行卫生保健中心
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月4日