单核苷酸多态性rs4839469在分析检测脊柱裂易感性方法中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种单核苷酸多态性rs4839469在分析 检测脊柱裂易感性方法中的应用。 技术背景
[0002] 脊柱裂（spina bifida，SB)是由于胚胎发育过程中椎管闭合不全而引起的一组出 生缺陷性疾病。根据病变部位有无明显体征，把脊柱裂分为隐性脊柱裂和显性脊柱裂两类， 隐性脊柱裂指只有椎管的缺损而无椎管内容物的膨出，病变较隐蔽，一般无需特殊治疗；显 性脊柱裂指棘突及椎板有不同程度的缺如，椎管向背侧开放，好发于腰骶部。目前较普遍的 观点认为脊柱裂是一种由多因素引起的畸形，包括遗传和环境因素及两者的相互作用。近 年来，模式动物研宄表明平面细胞极性（planar cell polarity，PCP)信号通路在胚胎神 经胚形成过程的汇聚延伸（convergent extension，CE)运动中发挥着重要作用，且已证实 PCP信号通路核心基因的突变可引发脊柱裂。对不同人群进行的初步研宄也表明PCP信号 通路基因与人类脊柱裂的发生密切相关，且在不同的种族和国家之间，发病率存在差异。
[0003] PCP核心基因之一的VANGL基因，在人类中分别有VANGL1和VANGL2基因，两 者都落在1号染色体上，分布于着丝粒的两端（VANGL1位于lpll-pl3. 1，VANGL2位于 Iq22-q23)，VANGL1基因全长56Kb，编码524个氨基酸；VANGL2基因全长28Kb，编码521个 氨基酸。VANGL蛋白属于高度保守的膜蛋白，N-端有四个跨膜结构域，C-端在细胞质面，含 有一个PDZ结构域，与细胞内信号转导或与细胞内其他信号分子相互作用有关。研宄结果 显示在原肠胚和神经胚发育过程中，如果VANGL基因受到干扰，会导致高度组织特异性的 上皮结构失去正常的极性，从而有可能导致不同程度脊柱裂的发生。
[0004] 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水 平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一 种。研宄SNP有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病的易感性。本发明研宄 应用病例-对照的研宄方法，能够获知VANGL1基因rs4839469多态性与中国北方汉族儿童 脊柱裂易感性的关联。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种单核苷酸多态性rs4839469在分析检测脊柱裂易感 性方法中的应用，所述rs4839469位点为VANGL1基因的位点。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007] -种单核苷酸多态性rs4839469在分析检测脊柱裂易感性方法中的应用。
[0008] 而且，所述rs4839469为VANGL1基因多态性位点。
[0009] 本发明的优点和积极效果：
[0010] 本发明将等位基因G、C、A以及基因型GG、GA、GC、AA，在病例-对照组间的频率分 布具有显著差异（P值分别为〇. 030和0. 021)，显示VANGL1基因是中国北方汉族人群脊柱 裂的易感基因。新发现的等位基因C的OR值为5. 840 (1. 282-26. 599)，基因型GC的OR值 为6. 399 (1. 387-29. 530)，显示等位基因C、基因型GC是中国北方汉族人群脊柱裂发病的 易感因素。GC基因型，即mRNA序列G -C，导致第116个氨基酸由丙氨酸（Ala)-脯氨酸 (Pro)〇
【附图说明】
[0011] 图1为rs4839469位点基因型GC测序图；
[0012] 图2为rs4839469位点PCR产物的全序列图。
[0013] 具体的实施方式
[0014] 为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例是说明性 的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0015] -种单核苷酸多态性rs4839469在分析检测脊柱裂易感性方法中的应用，本发明 为证实该应用，进行以下分析和鉴定，具体过程如下：
[0016] -、研宄对象
[0017] 162例脊柱裂患儿为2003年11月至2013年10月天津市儿童医院神经外科收治 的患儿，结合患儿症状、体征、影像学资料及手术所见做出诊断。入组病例为长期居住在中 国华北、西北及东北地区的汉族家庭。正常对照组（162例儿童）也来自天津市儿童医院， 排除脊柱裂、先天性心脏病、智力低下等出生缺陷和重大疾病。病例组和对照组的样本采集 均获得天津市儿童医院医学伦理委员会的批准，并签署知情同意书。
[0018] 二、基因组DNA提取与鉴定
[0019] 分别取患儿及对照组血液2mL，枸橼酸钠抗凝，使用TIANamp Blood DNAKit (北京 天根公司）提取基因组DNA，操作按试剂盒说明进行，步骤如下：
[0020] ①取全血200 y 1，加入20 y 1蛋白酶K溶液，混匀后加入200 y 1缓冲液GB，充分 颠倒混匀，于56°C放置10min，其间颠倒混匀数次，至溶液彻底清亮为止；
[0021] ②加人200 y 1无水乙醇，充分混匀。将溶液加入一个吸附柱CB3中，12000rpm离 心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
[0022] ③向吸附柱CB3中加入500 y 1缓冲液⑶（加过无水乙醇），12000rpm离心30sec， 倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
[0023] ④向吸附柱CB3中加入600 y 1漂洗液PW(加过无水乙醇），12000rpm离心30sec， 倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
[0024] ⑤重复以上步骤；
[0025] ⑥12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾 干吸附材料中残余的漂洗液；
[0026] ⑦将吸附柱CB3转入1. 5ml离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 y 1 洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
[0027] 紫外分光光度计检测DNA的浓度与纯度。鉴定结束后，将可用的DNA分装、标记， 部分置于_20°C冰箱储存备用，其余长期保存的置于-80°C冰箱。
[0028] 三、PCR 反应
[0029] 采用Primer进行引物设计。
[0030] F:5,-CAGCCAAACAGACAGAAAG-3，
[0031] R:5'-AGGTCCCTATGAGCAGAAT-3'
[0032] PCR反应体系为：10XEx Taq缓冲液2.5yl，dNTP 2yl，正反义引物各0.3yl，模 板 DNA2 y 1，Ex Taq 0? 2 y 1，水 17. 7 y 1。
[0033] 反应条件：94 °C 预变性 5min，35 个循环（94 °C 40s，56 °C 40s，72 °C 40s)， 72°C lOmin，12°C保存。目的基因片段分别长约549bp。
[0034] 四、PCR产物纯化
[0035] 按照Millipore公司96纯化板规范操作流程操作。具体操作程序如下：向PCR产 物孔中加入100 U 1重蒸水（ddH20)，取出全部液体至96纯化板中室温静置10分钟，以真空 抽滤泵抽10分钟至抽干，向96孔纯化板中加入50 y 1 ddH20,室温溶解10分钟，取出对应 的孔中的纯化产物至另一 96孔PCR板中。
[0036] 五、测序反应
[0037] 测序反应体系共 5 y 1 :DNA 3 y 1 (30-50ng)，Primer (3pM) 1 y 1，Bigdye 0? 5 y 1， ddH20 0. 5 y 1。测序反应条件：95 °C变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为 95 °C 15s，50 °C 15s，60 °C 90s，35个循环，扩增结束后设置12 °C保温。分析出测序图谱 (ABI3730XL 型 DNA 测序仪）。
[0038] 六、统计学分析
[0039] Hardy-Weinberg遗传平衡检测样本是否符合孟德尔遗传规律，所用软件为 hwe(http://www. biology, ualberta. ca/jbrzusto/hwenj. html)。SNP 分型数据输入 SPSS 17. 0软件，病例-对照组间等位基因和基因型分布的比较采用卡方检验或Fi sher精确 检验，P〈0. 05为具有统计学意义；以优势比（OR)及95%可信区间（CI)表示各基因型发生 频率在不同比较组间的相对危险度。
[0040] 七、结果
[0041] rs4839469(c. 346G>A p. Alall6Thr)位点在测序实验中病例组成功157例，对照 组成功158例，其余由于测序结果低质量剔除。该位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡（P>0. 05,见表1)。该位点在中国北方汉族人群中除检测出等位基因G、A，还发现了等 位基因C(基因型GC测序图见图1)。
[0042] 等位基因G、C、A以及基因型GG、GA、GC、AA，在病例-对照组间的频率分布具有 显著差异（P值分别为〇. 030和0. 021)，显示VANGL1基因是中国北方汉族人群脊柱裂的 易感基因。新发现的等位基因C的OR值为5. 840(1. 282-26. 599)，基因型GC的OR值为 6. 399 (1. 387-29. 530)，显示等位基因C、基因型GC是中国北方汉族人群脊柱裂发病的易感 因素。GC基因型，即mRNA序列G - C，导致第116个氨基酸由丙氨酸（Ala)-脯氨酸（Pro)。
[0043] 表1两组样本Hardy-Weinberg遗传平衡检测结果
[0044]
【主权项】
1. 一种单核苷酸多态性rs4839469在分析检测脊柱裂易感性方法中的应用。
2. 根据权利要求1所述的单核苷酸多态性rs4839469在分析检测脊柱裂易感性方法中 的应用，其特征在于：所述rs4839469为VANGLl基因多态性位点。
【专利摘要】本发明涉及一种单核苷酸多态性rs4839469在分析检测脊柱裂易感性方法中的应用，所述rs4839469为VANGLl基因多态性位点，VANGLl基因rs4839469位点的基因多态性与脊柱裂的发生密切相关。本发明首次在中国北方汉族人群中发现rs4839469位点存在等位基因C，且等位基因G、C、A以及基因型GG、GA、GC、AA，在病例-对照组间的频率分布具有显著差异(P值分别为0.030和0.021)，显示VANGL1基因是中国北方汉族人群脊柱裂的易感基因。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104789665
【申请号】CN201510155506
【发明人】蔡春泉, 石鸥燕, 王春祥, 王东随, 沈永明, 王旖旎
【申请人】天津市儿童医院
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月3日