以rhDSL重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法

专利名称:以rhDSL重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程技术领域：
的细胞扩增方法，特别的是一种以rhDSL重组 蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法。
背景技术：
iS^jft,l&ik^MM^M (Haematopoietic stem cell transplantation, HSCT) 已成为治疗血液系统恶性肿瘤、实体瘤、自身免疫系统疾病及某些基因缺陷疾病的重要手 段之一。造血干细胞主要来源于骨髓、脐带血及动员后的外周血。尽管与其他来源的干细 胞相比，脐血干细胞具有来源丰富、抗原性弱、移植后并发症少等优点，但又存在数量不足 的缺陷，造成了成人移植的限制。为得到治疗所需的细胞数量，研究人员试图通过不同手 段对HS/PCs进行规模化扩增。但是目前常用的方法扩增HS/PCs (Haematopoietic Stem/ ProgenitorCells)的效率十分有限，而且HS/PCs在体外扩增的过程中自我更新能力下降 并显示出分化的特征，导致其归巢和长期造血重建能力的降低，所以从根本上解决HSCT面 临的供体严重短缺已成为亟待解决的问题。
Notch信号传导通路广泛存在于脊椎和非脊椎动物中，是影响细胞决定的重要通 路之一，在进化上具有高度的保守性。Notch信号传导通路由Notch受体、配体及其下游的 信号传导共同组成。相邻细胞间通过Notch受体传递信号可以调节包括干细胞在内的多种 细胞的分化、增殖和凋亡，影响器官形成和形态发生。
干细胞是一类具有自我更新(self-renewing)和多向分化潜能的细胞，能够产生 高度分化的功能细胞。Notch信号对多潜能干细胞的定向分化和自身复制具有决定性的调 控作用。以干细胞为中心的再生医学是用功能正常的细胞或组织替代功能减退或受损的 细胞组织，将定向分化后的细胞用于治疗阿尔茨海默症、帕金森病、糖尿病、白血病等疾病， Notch信号传导通路通过调节干细胞的分化增殖将在这一领域中发挥重要作用。在少数情 况下，例如神经干细胞向星形胶质细胞分化的过程中，Notch信号传导通路具有促进分化作 用。对于其它多种干细胞而言，当Notch受体与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖； 而当Notch信号活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞，Notch信号传导通 路目前被认为是解决干细胞扩增的最有前途的研究方向之一。目前，Notch信号传导通路在 干细胞再生医学中的应用主要集中在通过活化Notch信号通路进行干细胞的体外扩增培 养。在干细胞培养过程中，活化Notch信号传导途径可以调控其增殖分化从而服务于以干 细胞生物治疗和组织工程，其策略主要是在含有可溶性配体的培养基中培养干/祖细胞、 或者将配体结合于固相表面以模拟体内配体的跨膜结构来培养干/祖细胞。由于每一种 类型的细胞需要与其相适应的含有适量细胞因子和生长因子的独特培养条件，所以通过激 活Notch通路来维持干细胞的培养和进行组织工程的研究还存在一些困难，尽管如此，在 造血干细胞的培养中，通过激活Notch通路来维持干细胞的自我更新已经取得了一定的进 展。鲁茁壮等(中国实验血液学杂志，2003，11 (3) :222 226)克隆表达了人Notch配体 Delta-likel(hDlll)的胞外区(hDlI-Iext)，并经集落培养检测证实其对原始的造血祖细胞
4具有扩增作用。Han等(Blood，2000，95 (5) :1616 1625)构建了来自于人hDlll的可溶 性重组蛋白hDlll·、由DSL结构域及N-端序列构成)，经小鼠细胞体外实验证实，在联合 其它细胞因子的情况下，可以抑制造血干细胞的分化并促进其增殖。
目前已经发现的人的 Notch 配体有 Jaggedl、Jagged2、DeltaU Delta3、Delta4。 Notch配体的胞外区含有数量不等的EGF样重复序列以及N端保守的DSL (Delta/Serrate/ Lag2)结构域，该DSL结构域在结合与活化Notch受体的过程中起关键作用。来自于野 生Notch配体的重组蛋白或者多肽被认为是有效的Notch激活剂。体外实验已经证明，从 JaggedUDeltal中衍生而来的重组蛋白及多肽具有Notch激活特性(Shimizu K, et al. J Biol Chem,1999,274(46) :32961 32969)。
经对现有技术的文献检索发现，中国专利公开号为CN101096654A，发明名称为 “以GST-hDSL重组蛋白增殖人造血干细胞及祖细胞的方法”，该专利提及的方法步骤为 "(1)从髓、外周血或脐带血中取样，用密度梯度离心分离出单核细胞，然后用CD34分离试 剂盒对CD34细胞进行标记，采用免疫磁珠技术对CD34细胞进行纯化，得到CD34+细胞；(2) 采用含10% -20%胎牛或人血清的细胞培养基对上述CD34+细胞进行培养，加入细胞因子， 加入蛋白，培养1周，换入细胞培养基，并重新加入蛋白再继续培养扩增1周，得到增殖了的 造血干细胞、祖细胞。，，该发明中使用的GST-hDSL相对本发明中的rhDSL重组蛋白，分子量 大、结构复杂，不利于相关实验操作中的使。且该发明中对造血干/祖细胞的扩增时间为一 周，扩增时间过长，可能影响了造血干/祖细胞的分化潜能。

发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种以rhDSL重组蛋白扩增造血干 细胞及祖细胞的方法，首次将rhDSL运用于人脐血干细胞及祖细胞的扩增，并提供优化了 的扩增条件，为Notch信号传导通路在造血干细胞体外扩增中的应用和发展提供了实验基 石出。
本发明是通过如下技术方案实现的，本发明包括如下步骤
第一步，rhDSL重组蛋白的制备首先构建rhDSL的重组表达质粒pQE30_hDSL，然 后以大肠杆菌DH5ci为宿主表达rhDSL，并采用Q S印harose阴离子交换层析与金属离子 Ni2+亲和层析相结合的纯化方法进行rhDSL重组蛋白的纯化，得到rhDSL重组蛋白。
所述rhDSL重组蛋白，为含有6 XHis (组氨酸)标签的Notch配体Delta-Iike-I 的衍生多肽。
所述的衍生多肽，由含有进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨 基酸构成，共99个氨基酸，其氨基酸序列为LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHS SGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。
所述构建rhDSL的重组表达质粒pQE30_hDSL，是指以重组质粒pGEX_2T/ hDSL (林小娟等，现代生物医学进展，2008，8 (4) 612)为模板，PCR的方法扩增hDSL基因片 段，包括进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸，共99个氨基酸，共 298bp。割胶回收后的PCR目的产物和原核表达质粒pQE30(含6XHis标签)经限制性内 切酶HindIILBamH I双酶切。连接割胶回收后的酶切产物，并将连接产物转化到预先制备 的DH5ci感受态细胞中，挑选阳性克隆，经测序证实无突变且读框正确。(以上为常规技术和条件，可以重复实施)
所述以大肠杆菌DH5 α为宿主表达rhDSL重组蛋白，是指挑取转化有 pQE30-hDSL质粒的DH5a的单菌落，25 30mL LB培养基(含100 μ g/mL Amp)，37°C振荡培 养过夜；次日将过夜菌液按2%的接种量转接到IL 2L的LB培养基(含100 μ g/mL Amp) 内，转接后37°C培养2. 5 3. Oh左右，待0D600 = 0. 6 0. 8的时候停止培养，加入IPTG 至终浓度为ImM，诱导表达4h，收集菌体。
所述rhDSL重组蛋白的纯化，是指收集的菌体经超声裂解和溶菌酶裂解细菌后， 高速离心，收集沉淀包涵体(表达产物以包涵体形式存在)。包涵体经8M尿素变性后，用稀 释法缓慢复性。取复性后的上清液经Q Sepharose阴离子交换层析，得到初步纯化的rhDSL 重组蛋白。将阴离子交换层析后所得蛋白溶液进一步通过金属离子(Ni2+)亲和层析并透 析，得到高纯度(纯度>99%)低内毒素含量(鲎试剂测定内毒素含量为0. 117EU/yg)的 rhDSL重组蛋白。
第二步，在HS/PCs体外培养体系中加入rhDSL重组蛋白及早期造血因子，采用这 两者结合扩增造血干细胞和祖细胞。
所述rhDSL重组蛋白通过Notch信号传导通路促进造血干细胞和祖细胞的扩增。
所述rhDSL重组蛋白扩增浓度为0. 5 μ g/ml 4. 5 μ g/mL·
所述rhDSL重组蛋白最佳扩增浓度为1. 5 μ g/mL·
所述早期造血因子为干细胞因子，浓度为20ng/ml。
所述rhDSL重组蛋白及早期造血因子的结合扩增造血干细胞和祖细胞的时间为 0 7天。
所述rhDSL重组蛋白及早期造血因子的结合扩增造血干细胞和祖细胞的最佳时 间为2. 5天。
本发明所述rhDSL重组蛋白衍生于Notch配体Delta-like-1，包括进化中的保守 结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸。通过与早期造血因子相结合，所述rhDSL 重组蛋白，经体外检测细胞计数、⑶34及⑶38表面抗原的检测、集落形成实验包括总CFU、 HPP-CFU、GM-CFU 计数以及进一步的连续稀释扩增(sequential dilution expansion)检 测证明，具有造血干/祖细胞的扩增特性。
在HS/PCs体外培养体系(DMEM/F-12，15% FBS)中加入rhDSL和/或KL，在分别 培养了 2. 5天、4. 5天、6. 5天后，对细胞进行显微镜计数、集落培养、⑶34+检测，比较不同组 之间的结果差异。结果表明，与单加KL相比，rhDSL与KL联合作用明显使HS/PCs数量得到 了扩增，该扩增作用具有时间及剂量依赖性，1. 5 μ g/ml的rhDSL的扩增效果较好，培养2. 5 天的扩增效果为最佳(见表1)。选择最佳的培养时间，对扩增后的细胞进行连续稀释扩增 (sequential dilutionexpansion)，进一步检测造血干/祖细胞经药物作用后分化潜能的 维持状况。结果表明，rhDSL实验组细胞在除去药物后细胞的分化潜能较高。
本发明中rhDSL的运用可有效扩增HS/PCs数量并维持其分化增殖的潜能。相对其 他文献报道的Notch配体固定化扩增HS/PCs的方法，rhDSL可以可溶形式直接进行HS/PCs 的扩增培养，具有方法简便易行，成本较低的特点。同时，rhDSL的分子量远低于另一可溶 形式的重组蛋白GST-hDSL，大大降低了扩增中使用的药物剂量，节约成本。对于通过Notch 信号传导通路解决临床HSCT所面临的细胞数量不足，rhDSL提供了一种新的选择。


图1为本发明实施例中rhDSL重组蛋白的纯化示意图；
其中
(A)Q Sepharose FF阴离子交换纯化rhDSL。M 蛋白标志物；1 洗脱液；
(B)离子交换层析后rhDSL的亲和纯化M 蛋白标志物；1 洗脱液；
(C)阴离子交换层析与亲和层析纯化后蛋白的银染检测M 蛋白标志物；1 纯化 后的rhDSL。
图2为连续稀释扩增法测定扩增后细胞的分化潜能示意图；
其中脐血来源的⑶34+细胞分四组经不同浓度rhDSL进行扩增培养，分组 为(l)KL(20ng/ml)(对照组)，(2) KL (20ng/ml) +rhDSL (0. 5 μ g/ml), (3)KL(20ng/ ml)+rhDSL(l. 5μ g/ml)，(4) KL (20ng/ml) +rhDSL (4. 5 μ g/ml)。2. 5 天后，以连续稀释扩增 法测定扩增后细胞的分化潜能，即将药物洗去，继续以KL，ΤΡ0, FL, IL-3(浓度均为IOng/ mL)进行长期液体培养，其间每隔7天进行细胞计数、集落形成细胞包括总CFU、HPP-CFU、 GM-CFU计数，计算相应细胞对于0天未扩增前的扩增倍数。A 细胞数；B :总CFU ；C HPP-CFU ；D :GM-CFU。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前 提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下 述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所用的试剂均 可以在市场上购买。
设备和试剂[0034]1FACSCalibur (流式细胞仪)美国 Becton Dickinson(BD)公司[0035]2MiniMACSTM细胞分选器/MACS分选架德国美天旎生物技术有限公司[0036]3蛋白纯化分析仪(AKTA PURIFIER-10)，pharmacia公司产品[0037]4超声波细胞粉碎仪(Sonipr印150)，三洋公司产品[0038]5核酸蛋白电泳仪(Power pac Basic)，Bio-Rad公司产品[0039]6凝胶图像处理系统(TanonGIS-2008)，上海天能科技有限公司[0040]7原核表达载体PQE30，Qiagene[0041]8限制性内切酶 BamH I、HindIII，IOXBuffer (酶切)，T4DNA 连接酶，10XT4DNA
Ligase Buffer, Ferments 公司产品
9. 10 X PCR Buffer,Mg2+ (25mM)，dNTP (2mM)，Tag DNA 聚合酶，上海生工生物工程技 术服务有限公司产品
10.试剂盒华舜小量PCR产物纯化试剂盒；天为时代琼脂糖凝胶DNA回收试剂 盒；V-gene日常型质粒DNA小量快速制备试剂盒；
11.Q Sepharose Fast Flow, Amersham 产品
12. HIS-Select Nickel Affinity Gel，Sigma 产品
13.脐血样品上海市国际和平妇幼保健院，自愿者捐赠的健康足月分娩儿脐血，枸橼酸钠抗凝
14. Ficoll分离液分离脐血，密度1. 077士0. 002g/mL，上海华精生物高科技有限 公司
15. DMEM/F-12(Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium/Nutrient F-12Ham' s, 1: IMixture)，SIGMA 公司产品
16.甲基纤维素(Methyl Cellulose, MC)美国 SIGMA 公司产品
17. IMDM(Iscove' s Modified Dulbcco' s Medium)美国 GIBCO 公司产
18.胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)美国 HyClone 公司
19.细胞因子 FL、TPO、IL-3、FcR-blocking Reagent、CDlIb-PE, CD14-PE 美国 eBioscience 公司
20. EPO 益比奥重组人红细胞生成素注射液，10000U/瓶，沈阳三生制药股份有限 公司
21. GM-CSF 特尔立注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，1 X 150 μ g，厦门 特宝生物工程股份有限公司
22.抗体 IgG-PE/FITC (阴性对照)、CDIM-FITC、CD38-PE =Caltag
23. PI (Propidium Iodicle，碘化丙锭)=Sino-American Biotec
24. Bufferl :PBS/2% FBS orO. 5% BSA(CD marker 缓冲液 / 溶解细胞因子)
i. Buffer2 :PBS/2% FBS/2 μ g/mL PI (CD marker 染液)
ii. Buffer3 :PBS/0. 5% BSA/2mM EDTA(磁性分选缓冲液)
25.双抗(加于培养基)100U/mL的青霉素和100 μ g/mL的链霉素 实施例IrhDSL重组蛋白的制备
以克隆质粒pGEX_2T/hDSL为模板，通过PCR方法扩增目的片段hDSL。割胶回收后 的PCR目的产物和原核表达质粒PQE30经限制性内切酶HindIII、BamH I双酶切。连接割 胶回收后的酶切产物，并将连接产物转化到预先制备的DH5 α感受态细胞中，挑选阳性克 隆，经测序证实无突变且读框正确。(以上为常规技术和条件)
挑取转化有pQE30_hDSL质粒的DH5a的单菌落，25 30mL LB培养基(含100 μ g/ mL Amp)，37°C振荡培养过夜；次日将过夜菌液按2%的接种量转接到IL 2L的LB培养基 (含100 μ g/mL Amp)内，转接后37°C培养2. 5 3. Oh左右，待0D600 = 0. 6 0. 8的时候 停止培养，加入IPTG至终浓度为ImM，诱导表达4h，收集菌体。用30mL预冷1 XPBS洗涤菌 体。收集的菌体用 30mL 预冷 Sonicatebuffer (PBS，ImM EDTA, 5mM DTT, 0. ImM PMSF，pH7. 3) 重悬，经超声裂解(中等程度超声，每次超声30sec、停30sec，共20次)和溶菌酶(100 μ g/ mL)裂解细菌后，高速离心，收集沉淀包涵体。每g包涵体用18mL Pellet Wash Buffer (PBS, 1% Triton X-100，IOmM EDTA, 50mM NaCl，100 μ M PMSF，pH7. 3)洗涤 3 次。
洗涤后的包涵体用Buffer/Urea (8M urea, 50mM Tri s_HCl，lmM EDTA, 50mM NaCl， 0. ImM PMSF，pH8. 5)变性，离心取上清。将上清缓慢滴加到10倍体积的复性液Alkaline Buffer A(50mM NaH2PO4,0. ImM PMSF,pH10. 7)内，Alkaline Buffer A(50mM NaH2PO4,0. ImM PMSF, pHlO. 7)内，再将复性液同体积的稀释液(20mM Tris_HCl，0. ImM PMSF, ρΗ8. 0)缓慢 加入复性蛋白液中。
用Wash Buffe (20mM Tris_HCl，pH9. 1)平衡后的Q S印harose 阴离子柱后，将复性后的上清过柱纯化，用elution buffer (20mM Tris_HCl，lM NaCl，pH9. 1)梯度洗脱，得到初 步纯化的 rhDSL 重组蛋白。用 IXHis-Tag BindingBuffer(0. 05M imidazole，0. 5M NaCl, 20mM Tris, pH8. 5)平衡金属离子(Ni2+)，将阴离子交换层析后所得蛋白溶液过柱纯化，用 IXHis-Tag ElutionBuffer (0. 2M imidazole，0. 5M NaCl, 20mM Tris, ρΗ8· 5)洗脱目的蛋 白，得到高纯度(纯度>99 % )的rhDSL重组蛋白。
如图1所示。(A)为Q Sepharose FF阴离子交换纯化后的结果，可见纯化后的蛋白 液中含有杂蛋白。(B)为离子交换层析后再经亲和纯化的结果，可见rhDSL纯度较高，未见 杂蛋白。(C)为阴离子交换层析与亲和层析纯化后蛋白的银染检测，蛋白上样量为lOOng， 未见杂带。因银染检测蛋白的灵敏度为0. 3ng,因此纯化后rhDSL重组蛋白的纯度>99%。
实施例2脐血单个核细胞(mono-nuclear cells, MNC)的获取和⑶34+细胞的分 离纯化
脐血样品，用枸橼酸钠抗凝，采取Ficoll分离液分离脐血，获得脐血单个核细胞 (许文荣，胡嘉波，顾可梁，等.脐血造血干/祖细胞的密度分离实验研究[J].临床检验 杂志· 2001，19(2) :73-76)。按300 μ L/108细胞的量加入Buffer3，重新悬浮细胞后待用。 Buffer3 :PBS/0. 5% BSA/2mM EDTA(磁性分选缓冲液)
⑶34+细胞的分选步骤
(1)免疫磁珠标记
加入FcR-blocking Reagent (100 μ L/108 细胞)，轻柔混勻，再加入抗 CD34+ 磁珠 (100μ L/108细胞)，轻柔充分混勻，4°C冰箱孵育30min，期间每隔IOmin取出，手动轻柔振 荡使磁珠与细胞充分接触；
(2) MS+分离柱的准备
将MiniMACS磁铁用酒精消毒，连接到MiniMACS架子上，将MS+分离柱放入 MiniMACS磁铁中，柱下接一 15mL无菌离心管。分离细胞前在柱顶上加入500 μ L buffer3 润洗柱子；
(3) MS+分离柱阳性分选
将标记好的细胞悬液加到柱上，收集的流出物为阴性成分，用bufferf洗涤分离 柱3次，每次500 μ L。加ImL buffer3于分离柱中，将其取下，置于一新的15mL无菌离心管 上，用活塞将⑶34+细胞洗脱；
(4)第二次过柱分选
为了提高CD34+细胞的纯度，可进行第二次过柱，重复实验步骤(3)；
(5)收集到的细胞用DMEM/F-12培养基(含15% FBS,双抗)，悬浮混勻，计数并离 心(2000rpm,IOmin)；
(6)去除上清，加入一定量DMEM/F_12(含15% FBS，双抗)培养基重悬，取出部分 细胞用于纯度测定，其余按实验需要加入药物或细胞因子进行分组培养。
实施例3流式测定表面标志的表达(⑶34/⑶38)——样品处理
(1)按彡2X IO4的量吸取细胞悬液于1. 5mL离心管，室温离心(2000rpm, IOmin)；
(2)吸去上清，100 μ L bufferl 重悬，加入 2 μ L FcR-blocking Reagent,轻柔混 勻；
(3)分别加入 2 μ L IgG-FITC Isotype Control、CD34-FITC 或 IgG-PE
9[0084]Isotype Control、CD34-PE ；
(4) 4°C避光孵育 3Omin ；
(5)取出，加入 ImL bufferl 洗涤一遍(2000rpm，IOmin)；
(6)加入300 μ L bufferl重悬细胞，移入流式管；
(7)4°C保存，当天进行检测。
实施例4rhDSL对脐血干/祖细胞扩增作用的条件优化
此次实验分为四组，对实施例2得到的⑶34+细胞进行短期扩增培养。四组分 别是(l)KL(20ng/ml)(对照组)，(2) KL (20ng/ml) +rhDSL (0. 5 μ g/ml), (3)KL(20ng/ ml)+rhDSL(l. 5μ g/ml), (4) KL (20ng/ml) +rhDSL (4. 5 μ g/ml).采用 24 孔培养板，每孔添 加培养基15% FBS的DMEM/F-12，另外附加各种细胞因子或药物溶液，终体积为lmL，细胞 密度为8. 5X 104/mL。置37°C，5% CO2培养箱，全湿条件下培养。第一轮分别培养2. 5天、 4. 5天、6. 5天后，收集各孔细胞进行显微镜计数、集落培养及流式细胞仪检测⑶34、⑶38 抗原表达等各项指标，计算相应细胞对于0天未扩增前的扩增倍数。集落培养第0天将 磁柱分离后的CD34+细胞2X IO3铺于MC培养基中，加入细胞因子KL(50ng/l. 5mL MC)， IL-3(10ng/l. 5mL MC)，GM-CSF(10ng/l. 5mL MC)，EP0(3U/1.5mL MC)。37°C，5% CO2，全湿 条件下培养，14天后进行集落的计数。实结果如表1所示。
2. 5天时，与对照组相比，rhDSL (1. 5 μ g/ml)组总细胞数及⑶34+细胞数分别显著 性扩增1. 57及1. 68倍，总CFU、HPP-CFU及GM-CFU也分别显著性扩增1. 31、1. 79及1. 39 倍。4. 5 天后，rhDSL (1. 5 μ g/ml)组总细胞、CD34+ 细胞数、总 CFU、HPP-CFU 及 GM-CFU 较 对照组也有显著性增加。6. 5天时，rhDSL组总细胞、⑶34+细胞数较对照组减少。各组 ⑶34+CD38_细胞数与对照组相比无显著性变化，并且随着培养时间的延长，⑶34+CD38_细胞 数呈降低趋势，说明延长培养时间增加了造血干/祖细胞的分化。因此，确定2. 5天是最佳 培养条件。
表1造血干/祖细胞扩增效率
权利要求
1. 一种以rhDSL重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤第一步，rhDSL重组蛋白的制备首先构建rhDSL的重组表达质粒pQE30_hDSL，挑取转 化有pQE30-hDSL质粒的DH5 α的单菌落，25 30mL含100 μ g/mLAmp的LB培养基，37°C 振荡培养过夜；次日将过夜菌液按2%的接种量转接到IL 2L的含100 μ g/mL Amp的LB 培养基内，转接后37 °C培养2. 5 3. Oh左右，待0D600 = 0. 6 0. 8的时候停止培养，加 入IPTG至终浓度为ImM，诱导表达4h，收集菌体，用30mL预冷1 XPBS洗涤菌体，收集的菌 体用30mL预冷Sonicate buffer重悬，经超声裂解和100 μ g/mL的溶菌酶裂解细菌后，高 速离心，收集沉淀包涵体，每克包涵体用18mL Pellet Wash Buffer洗涤3次；洗涤后的包涵体用Buffer/Urea变性，离心取上清，将上清缓慢滴加到10倍体积的复 性液Alkaline Buffer A内，再将复性液同体积的稀释液缓慢加入复性蛋白液中；用Wash Buffer平衡Q S印harose阴离子柱后，将复性后的上清过柱纯化，用elution buffer梯度洗脱，得到初步纯化的rhDSL重组蛋白，之后采用金属离子Ni2+亲和层析纯化， 用IXHis-Tag Binding Buffer平衡金属离子Ni2+，将阴离子交换层析后所得蛋白溶液过 柱纯化，用IXHis-Tag Elution Buffer洗脱目的蛋白，得到纯度> 99%的rhDSL重组蛋 白；所述构建rhDSL的重组表达质粒pQE30-hDSL是指以重组质粒pGEX_2T/hDSL为模板， PCR的方法扩增hDSL基因片段，包括进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个 氨基酸，共99个氨基酸，共298bp，割胶回收后的PCR目的产物和含6 XHis标签的原核表达 质粒pQE30经限制性内切酶Hindlll、BamH I双酶切，连接割胶回收后的酶切产物，并将连 接产物转化到预先制备的DH5 α感受态细胞中，挑选阳性克隆，经测序证实无突变且读框 正确；所述的rhDSL重组蛋白为含有6XHis标签的Notch配体Delta-Iike-I的衍生多肽， 所述的衍生多肽由含有进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸构成， 共 99 个氨基酸，其氨基酸序列为LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYS YRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI ；所述的 Sonicate buffer 为含 ImM EDTA, 5mM DTT，0. ImM PMSF, ρΗ7· 3 的 PBS ； 所述的超声裂解为中等程度超声，每次超声30sec、停30sec，共20次； 所述的 Pellet Wash Buffer 为含 1 % Triton X-100, IOmM EDTA, 50mMNaCl, 100 μ M PMSF, ρΗ 7. 3 的 PBS ；所述的 Buffer/Urea 为 8Μ urea, 50mMTris-HCl, ImM EDTA, 50mMNaCl, 0. ImM PMSF, pH8. 5 ；所述的复性液 Alkaline Buffer A 为 50mM NaH2PO4,0. ImM PMSF, pHlO. 7 ；所述的稀释液为 20mM Tris-HCl，0. ImM PMSF, pH 8. 0 ；所述的 Wash Buffer 为 20mMTris_HCl，pH 9. 1 ；所述的 elution buffer 为 20mM Tris-HCl, IM NaCl，pH 9. 1 ；所述的 IXHis-Tag Binding Buffer 为 0· 05M imidazole，0· 5M NaCl, 20mMTris, ρΗ8· 5 ；所述的 IXHis-Tag Elution Buffer 为 0· 2M imidazole，0· 5M NaCl, 20mMTris, pH`8. 5 ；第二步，在HS/PCs体外培养体系中加入上述制备的rhDSL重组蛋白及早期造血因子， 采用这两者结合扩增造血干细胞和祖细胞。
2.根据权利要求
1所述的以rhDSL重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法，其特征 是，所述的rhDSL重组蛋白扩增浓度为0. 5 μ g/ml 4. 5 μ g/ml。
3.根据权利要求
1或2所述的以rhDSL重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法，其 特征是，所述的rhDSL重组蛋白扩增浓度为1. 5 μ g/ml。
4.根据权利要求
1所述的以rhDSL重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法，其特征 是，所述的早期造血因子的浓度为10ng/ml-30ng/ml。
5.根据权利要求
1或4所述的以rhDSL重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法，其 特征是，所述的早期造血因子为干细胞因子，浓度为20ng/ml。
6.根据权利要求
1所述的以rhDSL重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法，其特征 是，所述的结合扩增造血干细胞和祖细胞的时间为0 7天。
7.根据权利要求
1或6所述的以rhDSL重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法，其 特征是，所述的rhDSL重组蛋白及早期造血因子的结合扩增造血干细胞和祖细胞的时间为 2. 5 天。
专利摘要
本发明涉及一种生物工程领域的以rhDSL重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法，在HS/PCs体外培养体系中加入rhDSL重组蛋白及早期造血因子，采用这两者结合扩增造血干细胞和祖细胞。所述rhDSL重组蛋白为含有6×His标签的Notch配体Delta-like-1的衍生多肽，衍生多肽由含有进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端50个氨基酸构成，共99个氨基酸，其氨基酸序列为LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。本发明中rhDSL重组蛋白在造血干/祖细胞扩增中具有分子量小，使用方便，节约成本的特点。
文档编号C07K14/47GKCN101363012 B发布类型授权 专利申请号CN 200810200654
公开日2011年4月6日 申请日期2008年9月27日
发明者赵梅, 韩伟 申请人:上海交通大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3),