一种含内标的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒和检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒和一种测定检测丙型肝炎病毒核酸的方法。试剂盒中在RT?PCR反应液中采用了UNG酶去除可能存在的污染产物，可以避免假阳性结果产生，也使检测结果更为准确；同时用Tth酶体系进行反转录及扩增，避免了双酶体系反应条件差异带来的干扰；此外引物在引物覆盖区域较易发生变异的位点引入了核苷类似物I碱基，可避免因丙型肝炎病毒基因突变而引起漏检，同时保证不同基因型样本的检测灵敏度；所设计的参与整个样本检测的内标避免了假阴性结果的产生。因此该试剂盒可高灵敏度、高特异性的检测人血清或血浆样本中的丙型肝炎病毒核酸。此外检测方法中采用RT?PCR一步法对丙型肝炎病毒核酸进行检测，减少了操作步骤也缩短了操作时间。
【专利说明】
-种含内标的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒和检测 方法
技术领域
[0001] 本发明设及丙型肝炎病毒核酸的检测。更具体的本发明设及一种用于检测人血 清、血浆中的丙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法;尤其设及高灵敏度、高 特异性的用于临床辅助诊断丙型肝炎病毒的感染和丙型肝炎病毒感染治疗的疗效监测的 丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎病毒属于黄病毒科丙型肝炎病毒属，其基因组为单股正链RNA，全基因组 长约9.化b。丙型肝炎病毒基因组含有一个开放读框，编码10余种结构和非结构蛋白，NS3蛋 白是一种多功能蛋白，氨基端具有蛋白酶活性，簇基端具有螺旋酶/ =憐酸核巧酶活性； NS5B蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶，为丙型肝炎病毒复制所需，是抗病毒治疗的重要祀位，其 末端具有核巧酸转移酶活性，但由于RNA酶缺乏矫正功能不能修正错配，多次复制后易导致 丙型肝炎多种变异的产生。目前可将丙型肝炎病毒分为6个基因型及50多种不同亚型，按照 国际通行的方法，W阿拉伯数字表示丙型肝炎病毒的基因型，W小写的英文字母表示基因 亚型（如la、2b、3a等）。
[0003] 丙型肝炎呈全球性流行，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。据世界 卫生组织统计，估计约有1.85亿人感染丙型肝炎病毒，其中约有1.5亿为慢性感染，每年有 35-50万人死于丙肝并发症，每年新发丙型肝炎病例约300万-400万例。基因型1型呈全球性 分布，占所有丙型肝炎病毒感染的70% W上。在我国主要W化和2a基因型为常见，其中化型 为主，某些地区有la、2b和3b型报道，6型主要见于香港和澳口。
[0004] 丙型肝炎病毒的定量检测主要用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断及丙型肝炎病 毒携带患者的治疗监测。辅助诊断是否已感染丙型肝炎病毒，感染者血清或血浆中的丙型 肝炎病毒的载量决定了是否需要对患者进行抗病毒治疗。用药治疗后，丙型肝炎病毒载量 的变化趋势也是治疗监测的一个重要内容。所W要求丙型肝炎病毒检测方法具有高效性、 高灵敏性、高特异性和准确性。
[0005] 目前，国内市场上存在国产或进口的多种巧光定量PCR试剂。国产试剂普遍价格便 宜，但相对于进口试剂，其灵敏度低，重复性较差，对于较低病毒载量的丙型肝炎病毒往往 不能准确的检出。目前在国内占主导地位的进口试剂主要为罗氏的COBAS AmpliPrep/ COBAS化qman肥V测试。COBAS化qman肥V测试是一种自动化的检测试剂盒。该试剂盒具 有灵敏度高、线性范围广、重复性好等优点，其检测限为15IU/ml，检测范围可达43IU/ml~ 6.9X10 7IU/ml。但其设备昂贵，检测费用高，目前还难W在临床广泛应用，特别是欠发达地 区的中小医院。另外，治疗后的丙型肝炎病毒水平可能低于罗氏COBAS化qman HCV测试的 检测下限，从而导致漏检。因此，针对我国现有情况，仍然需要一款价格相对便宜、高灵敏 度、高特异性、重复性好的丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒和一种高效的检测丙型肝炎病毒 核酸的方法，W指导丙型肝炎病毒的临床诊断及治疗。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明的目标在于提供一种高灵敏度、高特异性的用于检测 丙型肝炎病毒核酸的试剂盒和一种高效检测丙型肝炎病毒核酸的方法。
[0007] 本发明的一个技术方案是提供一种高灵敏度、高特异性的含内标的用于检测丙型 肝炎病毒核酸的试剂盒。该试剂盒包括:RT-PCR反应液、阴性质控品、阳性质控品、校准品和 内标。
[000引其中所述RT-PCR反应液包括:RT-PCR预反应液、第一引物、第二引物、第一探针和 第二探针；
[0009] 其中所述第一引物为具有SEQ ID NO.1所示核巧酸序列的引物;所述第二引物为 具有SEQ ID NO.2所示核巧酸序列的引物;所述第一探针为具有SEQ ID NO.3所示核巧酸序 列的探针，或为具有所述SEQ ID NO.3所示核巧酸序列的反向互补序列的探针;所述第二探 针为具有SEQ ID NO.4所示核巧酸序列的探针，或为具有所述SEQ ID NO.4所示核巧酸序列 的反向互补序列的探针。所述第一探针和第二探针的5'端采用巧光基团进行标记，且所述 第一探针和第二探针的3'端采用泽灭基团进行标记。所述巧光基团为FAM、化kima Yellow、 ROX、CY5、CY3、肥D、TAMRA、TAXAS RED、VIC、TET、皿X和JOE中的任意一种。所述泽灭基团为 B册、TAMRA、DABCTL和MGB中的任意一种。所述内标由内标假病毒颗粒用憐酸缓冲液稀释制 备而成，其中内标假病毒颗粒为按照SEQ ID NO.5所示的核巧酸序列人工合成制备所得。所 述RT-PCR预反应液包括RT-PCR缓冲液、UNG酶、T化酶、dNTPs和加 TP。所述内标参与丙型肝炎 病毒核酸检测的全过程，且所述内标的浓度最优为化+4copies/ml。
[0010] 本发明的另一个技术方案是提供一种采用上述试剂盒中所述引物和/或探针进行 丙型肝炎病毒核酸检测的方法，该检测方法包括下述步骤：（1)提取和纯化样本中丙型肝炎 病毒核酸；（2)对提取和纯化好的丙型肝炎病毒核酸进行特异性检测;其中所述特异性检测 所使用的引物和/或探针如下所述:其中所述引物包括第一引物和第二引物，且所述第一引 物为具有SEQ ID NO. 1所示核巧酸序列的引物;所述第二引物为具有SEQ ID NO. 2所示核 巧酸序列的引物;所述探针包括第一探针和第二探针，且所述第一探针为具有SEQ ID NO.3 所示核巧酸序列的探针，或为具有所述SEQ ID NO.3所示核巧酸序列的反向互补序列的探 针;所述第二探针为具有SEQ ID NO.4所示核巧酸序列的探针，或为具有所述SEQ ID NO.4 所示核巧酸序列的反向互补序列的探针;所述第一探针和第二探针的5'端采用巧光基团进 行标记，且所述第一探针和第二探针的3'端采用泽灭基团进行标记;所述巧光基团为FAM、 化kima Ye 11OW、ROX、CY5、CY3、肥D、TAMRA、TAXAS RED、VIC、TET、肥X和JOE中的任意一种；所 述泽灭基团为B册、TAMRA、DABCTL和MGB中的任意一种。其更进一步的技术方案是:所述特异 性检测为使用上述试剂盒中的RT-PCR反应液对丙型肝炎病毒核酸进行实时巧光定量检测。
[0011] 本发明的有益技术效果是:本发明提供了一款灵敏度高、假阴性率低、线性范围 广、定量准确且精密度高的丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒和一种高效检测丙型肝炎病毒核 酸的方法，其中所述试剂盒成本低，检测时间短，适用于临床实验室推广;所述检测方法准 确率高、减少了操作步骤且缩短了操作时间，不论是试剂盒还是检测方法均具有很好的临 床前景和市场价值。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明所述试剂盒的线性范围，结果可得本发明试剂盒的线性范围为IOIU/ ml~lXl〇9lU/ml。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合具体实施例来详细说明本发明所请求保护的技术范围，但本申请并不限 于下述具体实施例。
[0014] (一)对美国国立生物技术信息中屯、(NCBI)中已报道的丙型肝炎病毒全基因组序 列进行对比分析，设计用于检测丙型肝炎病毒核酸的引物序列和第一探针序列，并人工合 成上述所设计的引物序列和第一探针序列：
[0015] 第一引物：5'-GAGTAGIGTTGGGTIGCGAA-3'（沈Q ID N0.1);
[0016] 第二引物：5'-GTGCACGGTITACGAGACCTC-3'（沈Q ID N0.2);
[0017] 第一探针：5'-TGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGC-3'（SEQ ID N0.3)。
[0018] 上述第一引物和第二引物的设计中使用了能够避免因丙型肝炎病毒基因突变而 引起漏检的核巧类似物I碱基，I碱基在RT-PCR扩增过程中可W与A/T/G/C碱基配对结合，同 时保证了不同基因型样本的检测高灵敏度。该I碱基为脱氧次黄巧（英文名称为 deoxyinosine)，其为G碱基的类似物，为本领域技术人员所公知的技术内容，本申请中不 再寶述。
[0019] (二)设计针对内标的第二探针序列，并人工合成该第二探针序列：
[0020] 第二探针：5'-ACCAGACACACGCTCACACCTCCC-3'（沈Q ID N0.4)。
[0021 ](=)设计内标模板序列，并参照该内标模板序列人工制备内标假病毒颗粒：
[0022] 1.内标模板序列为如SEQ ID NO.5所示的核巧酸序列：
[0023] 5'-atcgtcctgggtggttatagcataattgggaacgacttgaactgagcttaactctttaatagccga gt过gtgttgggtcgcg过过g过过ggttt过Ctctg过CC过g过C过C过Cgctc过C过CCtCCCg过t过gtg过ggtctcgt过g过CC gtgc过CC过tg过gc过Cg过过tcct过过过CCtC过过过g过过过过过CC过过tctgc过过tt过tc过ggc过过gttcc过CtcgCCCgtg过 cgaccaaac-3'(沈Q ID N0.5)
[0024] 2.参照SEQ ID NO. 5所示核巧酸序列进行内标假病毒颗粒的制备，制备方法可参 考文献资料所报道的方法，然后用pH值为8.0的憐酸缓冲液将制备好的内标假病毒颗粒稀 释到化+4copies/mL，将该稀释好的液体作为所述试剂盒中的内标样本。
[0025] (四）设计丙型肝炎假病毒颗粒的核巧酸序列，并参照该序列人工制备丙型肝炎假 病毒颗粒：
[00%] 1.丙型肝炎假病毒颗粒序列为如SEQ ID NO.6所示的核巧酸序列：
[0027] 5'-taatacgactcactatagggcgtcgagccatggcgttagtatgagtgtcgtacagcctccaggacc CCCCCtcccgggagagccatagtggtctgcggaaccggtgagtacaccggaattgccaggacgaccgggtcctttct tgg过t过过过cccgctc过过tgcctgg过g过tttgggcgtgcccccgc过过g过Ctgct过gccg过gt过gtgttgggtcgcg过过 过ggccttgtggt过ctgcctg过t过gggtgcttgcg过gtgCCCCggg过ggtctcgt过g过CCgtgC过CC过tg过gc过Cg过过 tcct过过过CCtC过过过g过过过过过CC过过过Cgt过过C过CC过过CCgtCgCCC过C过gg过Cgtc过过gttcccgggtggcggtc过g过 tcgttggtggagtttacttgttgccgcgcaggggccctagattgggtgtgcgcgcgacgaggaagacttccgagcgg tc邑caacctc邑a邑邑ta邑ac邑tea邑cctatccccaa邑邑cac邑tc邑邑CCC邑一3'（SEQ ID NO.6)
[00%] 2.参照SEQ ID NO.6所示核巧酸序列进行丙型肝炎假病毒颗粒的制备，制备方法 参考文献资料报道的方法，然后用pH值为8.0的憐酸缓冲液将制备好的丙型肝炎假病毒颗 粒稀释成合适的浓度，将该稀释好的液体作为高值的丙型肝炎病毒颗粒样本。
[0029] (五)丙型肝炎病毒核酸标准品：
[0030] 1 .W册定量标准品：购买W册定量标准品（WHO International Standard for 4th WHO International Standard for Hepatitis C Virus for Nucleic Acid Amplification Techniques，NIBSC code:06/102)。按照说明书要求用0.5ml DEPC水将标 准品复溶，得到260000IU/ml的样本，然后将该样本用外观澄清的市售阴性标准血浆稀释至 合适的浓度。
[0031] 2.胖110不同基因型标准品：购买胖1阳的丙型肝炎病毒基因型盘(齡11 WHO Reference Material 3nd HCV RNA Genotype Panel for Nucleic Acid Amplification Techniques，NIBSC code: 12/172)。采用WHO定量标准品进行定量，然后用外观澄清的市售 阴性标准血浆稀释至合适的浓度。
[0032] (六)高值的临床样本
[0033] 由罗氏公司的COBAS化qman HCV test试剂盒进行定量，使用外观澄清的市售阴 性标准血浆稀释至合适的浓度。
[0034] (屯)丙型肝炎病毒核酸检测用RT-PCR反应液
[0035] 包括5XRT-PCR预反应液、第一引物、第二引物、第一探针和第二探针。根据下述表 1配置RT-PCR反应液：
[0036] 表1 「00971
LUUJB」 肥制元々乂旧，按i化i/嘗分巧判FUK化应嘗甲，开リU八3Wi巧联徘化好W巧本。
[0039] 采用的巧光定量PCR仪为上海宏石的SLAN-96P，扩增检测程序为：50°C 2min; 60°C 25111111;95°(：1111111;95°(：153,56°(：1111111，采集巧光巧41和〔￥5)，共50个循环；25°(：1111111。
[0040] (八)质控品的选用
[0041] 阴性质控品：市售阴性的标准血浆，外观澄清
[0042] 临界阳性质控品：使用市售阴性的标准血浆对丙型肝炎假病毒颗粒样本进行稀 释，使其浓度在50IU/ml~lOOOIU/ml(采用W册定量标准品进行定量）。
[0043] 强阳性质控品：使用市售阴性的标准血浆对丙型肝炎假病毒颗粒样本进行稀释， 使其浓度在lOOOOIU/ml~lOOOOOIU/ml (采用W册定量标准品进行定量）。
[0044](九)校准品
[0045] 校准品包括SPC1、SPC2、SPC3和SPC4,使用市售阴性的标准血浆对丙型肝炎假病毒 颗粒样本进行10倍梯度稀释，使其浓度SPC1、SPC2、SPC3和SPC4在lOOOIU/ml~1000 OOOOIU/ ml之间(采用WHO定量标准品进行定量）。每个相邻的校准品之间浓度相差大约10倍。
[0046] (十)丙型肝炎病毒核酸样本的提取纯化试剂盒
[0047] 丙型肝炎病毒样本的提取纯化采用QIAGEN的QIAamp Viral RNA Mini Kit(货号： 52904)，具体操作按照说明书进行。
[004引下列实施例中未注明具体条件的实施方法，通常按照常规条件或者试剂盒生产厂 家推荐的方法进行。
[0049]具体实施例1:本发明所述含内标的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒的抗污 染能力
[(K)加]使用纯水将424000000copies/ml的丙型肝炎病毒扩增产物梯度稀释成 lOOOOOOcopies/ml、lOOOOOcopies/ml、lOOOOcopies/ml、1000copies/ml 等浓度，分别加入 本试剂盒中的RT-PCR反应液中，每个浓度做4个重复，离屯、混匀，进行RT-PCR扩增检测。结果 如表2所示，显示lOOOOcopies/ml的样本可W完全被UNG酶消化，说明本发明的试剂盒的抗 污染能力较强。
[0051]表2抗污染能力
[0nc；9l
[0化3]
[0054]具体实施例2:本发明所述含内标的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒的最低 检出限(LOD)
[0055]将W册定量标准品（W册 International Standard for 4th W册 International Standard for Hepatitis C Virus for Nucleic Acid Amplification Techniques, NIBSC code:06/102)用阴性血浆稀释到20、10、5111/1111。采用91466加勺914曰111口￥^曰11?魁 Mini Kit进行丙型肝炎病毒核酸的提取纯化，并使用本发明试剂盒进行扩增检测，每个浓 度的样本重复检测24次。计算各浓度下样本的检出率，从而确定最低检出限(按照最低检出 限的定义，将检出率含95%的最低浓度定为最低检出限），结果如表3所示。由结果可知， 10111/1111样本的检出率可达到100.00%，511]/1111样本的检出率可达到91.67%，说明本发明 试剂盒的最低检出限为lOIU/ml。
[0化6] 表3检出限
[00571
[UUSbJ 具体头砸例3 :本友明所还巧内称的用于極测闪型化炎炳專核酸的巧刑盈的足量 限(LOQ)
[0化9] 将胖册定量标准品用阴性血浆稀释到10、20、30111/1111。采用91466加勺914曰1119￥^曰1 RNA Mini Kit进行丙型肝炎病毒核酸的提取纯化，并使用本发明试剂盒进行扩增检测，每 个浓度的样本重复检测10次。要求定量限浓度的样本必须全部检出，并计算定量结果的对 数值及对数值的变异系数CV，并与理论值的对数值相比，计算两者的差值ALog,将ALog不 高于±0.51og值视为定量准确，定量准确且CV小于10 %可设定为定量限。实验结果如表4所 示，当样本浓度为lOIU/ml时，本发明试剂盒的定量准确率为100%且CV值小于10%。因此， 本发明试剂盒的定量限为lOIU/ml。
[0060] 表4定量限
[0061]
[0062]
[0063] 具体实施例4:本发明所述含内标的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒的线性 范围
[0064] 取经过WHO定量标准品标定的丙型肝炎假病毒颗粒，用阴性血浆对其进行梯度稀 释，从4 X l〇9lU/ml稀释成 1 X l〇9lU/ml、1 X l〇8lU/ml、1 X l〇7lU/ml、1 X l〇6lU/ml、1 X l〇5lU/ ml、I X l〇4lU/ml、I X l〇3lU/ml、I X l〇2lU/ml、50IU/ml、20IU/ml、lOIU/ml、5IU/ml。采用 QIAGEN的QIAamp Viral RNA Mini Kit进行丙型肝炎病毒核酸的提取纯化，并使用本发明 试剂盒进行扩增检测，每个浓度作3个重复。计算每一样本浓度的对数值的绝对偏差（A Log): ALog = TL。g-ML。g(TL。g为测试结果对数值，ML。g为标示浓度对数值），若该样本浓度的绝 对偏差ALog不高于± 0.51og值，且S个重复样本间的对数值的CV不高于10 %，则此浓度样 本的准确度符合要求，可用于线性范围分析。然后W符合要求的样本浓度标示值的对数值 和Ct值，W浓度对数值为Xi，Ct值为Yi，进行线性拟合，计算其线性相关系数r，若I r I含 0.980,则该系列浓度处于本试剂盒的线性范围之内。检测数据结果如表5所示。
[00化]表5
[0066]
[0067]
[0068] 从结果中可知，当样本浓度为5IU/ml时，其检测结果不符合准确度要求，故其不纳 入线性范围之内。将lOIU/ml~IX IO9IlVml各浓度的数据进行拟合，结果如图1所示。结果 显示，R2 = 0.99929，r = 0.9996〉0.98。因此，得到本试剂盒的线性范围为为10IU/ml~lX 10?IU/ml〇
[0069] 具体实施例5:本发明所述含内标的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒对不同 基因型的覆盖
[0070] 将WHO的丙型肝炎病毒基因型盘（Non WHO Reference Material 化(1 HCV RNA Genotype Panel for Nucleic Acid Amplification Techniques,NIBSC code:12/172)中 的化、2b、3a、Ar、5a和61基因型样本，采用WHO定量标准品定量。用阴性人血浆将各样本稀释 至lOIU/ml，采用QIAGEN的QIAamp Viral RNA Mini Kit进行丙型肝炎病毒核酸的提取纯 化，并使用本发明试剂盒进行扩增检测，每个浓度作24个重复。计算每个基因型的检出率。 结果如表6所示。从结果中可W看出，本发明试剂盒对化、26、3曰、4'、5曰和61基因型样本的 检出率均在95% W上，说明本发明试剂盒对1~6基因型均能检出，且检测限均为lOIU/ml。
[0071] 表6不同基因型检测
[0072]
[0073] 具体实施例6:本发明所述含内标的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒的精密 度
[0074] 用阴性血浆将高值临床样本(经罗氏公司的COBAS化qman HCV test试剂盒进行 定量)稀释至两个不同的浓度：100IU/na和lOOOOIU/ml。采用QIAGEN的QIAamp Viral RNA Mini Kit进行丙型肝炎病毒核酸的提取纯化，并使用本发明试剂盒进行扩增检测，每个浓 度的样本分别重复检测24次。计算同一浓度样本检测结果对数值的变异系数(CV，％ )，结果 如表7所示。使用本发明试剂盒检测两个浓度的样本的变异系数(CV，％ )均小于5%，说明本 发明试剂盒具有较好的检测精密度。
[00巧]表7精密度
[0076]
[0077] 本发明提供了一种高灵敏度、高特异性的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒和 一种高效检测丙型肝炎病毒核酸的方法。本发明采用RT-PCR-步法对丙型肝炎病毒核酸进 行检测，既减少了操作步骤也缩短了操作时间，且RT-PCR反应体系中采用了UNG酶去除可能 存在的污染产物，运样可W避免假阳性结果产生，也使检测结果更为准确。本发明在RT-PCR 反应体系中采用单一的Tth酶体系进行反转录及扩增，省去了双酶体系带来的各种反应条 件的干扰。本发明中的特异性引物和探针可W检测丙型肝炎病毒全基因组中保守区的UTR 区，且在引物覆盖区域较易发生变异的位点引入了核巧类似物I碱基，I碱基在RT-PCR扩增 过程中可W与A/T/G/C碱基配对结合，可避免因丙型肝炎病毒基因突然而引起的漏检，同时 保证了不同基因型样本检测的高灵敏度。本发明中还设计了内标，内标参与样本检测的整 个过程，避免了假阴性结果的发生。由RT-PCR反应液、阴性质控品、阳性质控品、校准品和内 标组成的试剂盒，可W高灵敏度、高特异性的检测人血清或血浆样本中的丙型肝炎病毒核 酸。
[0078]本领域的技术人员应该明白，本文所述发明除明确阐述的内容外，还容许变化和 修改，特别是等同的变化和修改。应该理解，所有运样的变化和修改均落入本发明。
【主权项】
1. 一种含内标的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括： RT-PCR反应液、阴性质控品、阳性质控品、校准品和内标； 其中所述RT-PCR反应液包括:RT-PCR预反应液、第一引物、第二引物、第一探针和第二 探针； 其中所述第一引物为具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的引物;所述第二引物为具有 SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的引物;所述第一探针为具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的 探针，或为具有所述SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的反向互补序列的探针;所述第二探针为 具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的探针，或为具有所述SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的反 向互补序列的探针;所述RT-PCR预反应液包括RT-PCR缓冲液、UNG酶、Tth酶、dNTPs和dUTP。2. 根据权利要求1所述的一种含内标的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征 在于:所述第一探针和第二探针的5'端采用荧光基团进行标记，且所述第一探针和第二探 针的3'端采用淬灭基团进行标记。3. 根据权利要求2所述的一种含内标的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征 在于：所述荧光基团为FAM、Yakima Yellow、R0X、CY5、CY3、NED、TAMRA、TAXAS RED、VIC、TET、 HEX和JOE中的任意一种。4. 根据权利要求2所述的一种含内标的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征 在于:所述淬灭基团为BHQ、TAMRA、DABCYL和MGB中的任意一种。5. 根据权利要求1所述的一种含内标的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征 在于:所述内标由内标假病毒颗粒用磷酸缓冲液稀释制备而成，其中内标假病毒颗粒为按 照SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列人工合成制备所得。6. 根据权利要求5所述的一种含内标的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征 在于:所述内标参与丙型肝炎病毒核酸检测的全过程。7. -种丙型肝炎病毒核酸的检测方法，其特征在于:包括下述步骤：（1)丙型肝炎病毒 核酸的提取和纯化步骤；（2)使用权利要求1至4中任一权利要求所述的引物和/或探针对提 取和纯化好的丙型肝炎病毒核酸进行特异性检测； 其中所述引物包括第一引物和第二引物，且所述第一引物为具有SEQ ID NO. 1所示核 苷酸序列的引物;所述第二引物为具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的引物； 其中所述探针包括第一探针和第二探针，且所述第一探针为具有SEQ ID NO.3所示核 苷酸序列的探针，或为具有所述SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的反向互补序列的探针;所述 第二探针为具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的探针，或为具有所述SEQ ID NO.4所示核苷 酸序列的反向互补序列的探针;所述第一探针和第二探针的5'端采用荧光基团进行标记， 且所述第一探针和第二探针的3'端采用淬灭基团进行标记;所述荧光基团为FAM、Yakima Ye 11 ow、R0X、CY5、CY3、NED、TAMRA、TAXAS RED、VIC、TET、HEX和JOE 中的任意一种；所述淬灭 基团为BHQ、TAMRA、DABCYL和MGB中的任意一种。8. 根据权利要求7所述的一种丙型肝炎病毒核酸的检测方法，其特征在于:所述特异性 检测为实时荧光定量PCR检测。
【文档编号】C12Q1/70GK105861743SQ201610160974
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月21日
【发明人】邓京, 宋冰燕
【申请人】珠海丽珠试剂股份有限公司