专利名称：一株适用于油藏环境的假单胞菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株适用于油藏环境的假单胞菌菌株及其应用。
背景技术：
微生物提高原油米收率技术(Microbial Enhanced Oil Recovery, MEOR)是指利用各种微生物(主要是细菌)及其代谢产物与油藏岩石、流体等发生生物化学作用，以提高原油采收率的技术。MEOR是继聚合物驱、热力驱、化学驱等方法之后新兴的提高原油采收率的方法，该技术具有成本低、对油藏适应性强、不伤害地层和不污染环境等优点，被认为是二十一世纪最有发展前景的提高采油收率技术。至今，在世界上已有三十多个国家开展了相关的研究，在一些现场实验，也取得了显著的效果。微生物提高原油采收率的机理十分复杂，微生物来源的表面活性剂以及基于微生物生物量的微生物调剖是最主要的作用机理。鼠李糖脂是其中最常用的表面活性剂之一，它是一类阴离子型的糖脂。因其良好的生物相容性和高效的乳化、增溶以及降低表面张力等能力而被广泛应用于石油工业等领域。微生物生物量可以选择性或非选择性的封堵一些油层，改变岩石表面润湿性，降低原油粘度，因此，对于原油采收率的提高也非常重要。生物被膜(biofilm)，也称生物膜，是一种或多种微生物为适应自然环境而形成的膜性聚合体。它由胞外基质包裹微生物细胞形成，能够增强其中微生物对环境的抗逆性，使其更好的在各种环境中定殖。因此，油藏环境中生物被膜的形成也将有助于菌体生物量的积累，从而增强其生物调剖效果。
发明内容
本发明的目的是提供一株适用于油藏环境的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)及其应用。本发明所提供的铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)MP68，其保藏编号为CGMCC N0.7267。本发明所提供的铜绿假单胞菌MP68CGMCC N0.7267的应用为如下任一所述:(I)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267在制备具有耐多环芳烃性能的微生物产品中的应用；(2)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在制备能在含有多环芳烃的环境中生长的微生物产品中的应用；(3)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267在油藏环境中提高原油采收率中的应用；(4)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在修复多环芳烃污染中的应用；(5)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在制备表面活性剂和/或乳化剂中的应用；
(6)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌中的任意一种或其组合。上述任一所述应用中，所述含有多环芳烃的环境为含有多环芳烃的铜绿假单胞菌培养基或含有多环芳烃的油藏。上述任一所述应用中，所述多环芳烃具体为荧蒽、苯并菲或芘。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 发酵后得到的发酵产物也属于本发明的保护范围。所述发酵产物的制备方法可为:将铜绿假单胞菌IMP68接种于低磷酸培养基中，37°C培养，搅拌，发酵2天，离心去除菌体后即得发酵产物；所述低磷酸培养基具体为PPGAS培养基。PPGAS培养基的溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度如下:氯化铵0.02M，氯化钾
0.02M, Tris-HCl0.12M，硫酸镁0.0016M，蛋白胨I % (质量百分含量)，甘油lg/100ml，余量为水。 上述发酵产物的如下任一应用也属于本发明的保护范围:(I)上述发酵产物在作为表面活性剂和/或乳化剂中的应用；(2)上述发酵产物在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌中的任意一种或其组
口 ο上述发酵产物中的提取物也属于本发明的保护范围。所述提取物的制备方法为:将上述任一所述发酵产物去除菌体，保留发酵液上清，调节发酵液上清的PH值至2，然后4°C放置过夜，离心，取沉淀，再用氯仿甲醇混合液抽提，取有机相，即得；所述氯仿甲醇的体积比为2: I。所述提取物含有鼠李糖脂。上述提取物的如下任一应用也属于本发明的保护范围:(I)上述任一所述提取物在作为表面活性剂和/或乳化剂中的应用；(2)上述任一所述提取物在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌中的任意一种或其组合。本发明的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 可以在含有多环芳烃的培养基中生长，并且合成大量的鼠李糖脂，合成的鼠李糖脂具有很强的表面活性剂性能和乳化能力，并且可以抑制其他细菌的生长；同时，该菌也可以在含有多环芳烃的培养基中生长形成生物被膜。因此，该菌具有应用于多环芳烃污染环境的修复和油藏环境中提高原油采收率的潜能。
图1 为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 提取物中鼠李糖脂的薄层层析图，其中迁移率(Rf)为0.6的是双鼠李糖脂，迁移率为0.9的是单鼠李糖脂。图2 为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在含有荧蒽培养基中的生长、表面活性剂的产生以及生物被膜的形成能力实验数据统计结果图，其中A为菌株在三种培养基中的生长曲线；B为菌株在三种培养基中鼠李糖脂的产量；C为菌株在三种培养基中生物被膜的形成情况。图3 为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在含有苯并菲培养基中的生长、表面活性剂的产生以及生物被膜的形成能力实验数据统计结果图，其中A为菌株在三种培养基中的生长曲线；B为菌株在三种培养基中鼠李糖脂的产量;C为菌株在三种培养基中生物被膜的形成情况。图4 为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在含有芘培养基中的生长、表面活性剂的产生以及生物被膜的形成能力实验数据统计结果图，其中A为菌株在三种培养基中的生长曲线；B为菌株在三种培养基中鼠李糖脂的产量；C为菌株在三种培养基中生物被膜的形成情况。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例1、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 菌株的分离和鉴定
取新疆克拉玛依油田8区8805井附近的原油污染土壤样品，使用LB培养基进行分离培养得到菌株IMP68。检测菌株MP68的16s rDNA的序列，测得序列为SEQ ID N0.1所示。将该序列在Genbank数据库进行BLAST比对,结果该序列与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株IXD12的相似性为99%。结果鉴定IMP68为Pseudomonas aeruginosa铜绿假单胞菌，本发明中称其为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68。该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.7267，保藏日期为2013年3月I日，分类命名为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。保藏中心的地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编100101。实施例2、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 菌株的功能验证一、菌株发酵物中提取物的制备发酵:将菌株接种于PPGAS培养基中，37°C培养，搅拌速度为200转/分钟，发酵周期为2天，离心去除菌体后得到发酵液上清。PPGAS培养基的溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度如下:氯化铵0.02M，氯化钾0.02M, Tris-HCl0.12M，硫酸镁0.0016M，蛋白胨1%(质量百分含量)，甘油lg/100ml，余量为水。提取物的制备:用盐酸调节发酵液上清pH值至2，然后4°C放置过夜，离心，取沉淀，然后再用氯仿甲醇(体积比为2: I)抽提，取有机相，即为抽提产物(即提取物)，该提取物为较高纯度的鼠李糖脂。提取物的含量检测:将抽提产物进行干燥，得到固体提取物，直接称量干重。结果IMP68菌株发酵液上清中提取物的含量为4.2±0.01克/升。同样条件下，对照菌株铜绿假单胞菌PAOl发酵液上清中提取物的含量为2.8±0.1克/升。提取物中鼠李糖脂的鉴定:用薄层层析法鉴定，结果如图1，迁移率(Rf)为0.6的是双鼠李糖脂，迁移率为0.9的是单鼠李糖脂。二、提取物的表面活性剂性能及乳化剂性能:MP68菌株提取物具有高效的表面活性和乳化能力。MP68产生的提取物在水中的表面张力值为31.27mN/mm,临界胶束浓度为80毫克/升，汽油乳化指标值为60，柴油的乳化指标值为65。PAOl产生的提取物在水中的表面张力值为31.23mN/m,临界胶束浓度为60毫克/升，汽油乳化指标值为65，柴油的乳化指标值为70。在高温、高盐以及不同pH等环境下，MP68菌株产生的提取物都能保持较高的表面活性和乳化能力。三、菌株发酵物中提取物的抑菌 功能验证。(一 )最低半数抑菌浓度的检测将生长12小时的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的细菌数调整为IO5个/毫升，然后加入实验一制得的MP68的提取物溶液进行浓度梯度实验，过夜生长，细菌浓度与对照组相比，0D_减少一半的提取物的浓度即为该提取物的最低半数抑菌浓度。对照组:未添加提取物。结果:MP68来源的提取物对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的最低半数抑菌浓度值分别为6 μ g/ml, 16 μ g/ml, 16 μ g/ml,6 μ g/ml,说明实验一制得的提取物能够较好的抑制枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生长。PAOl来源的提取物对上述四种菌的最低半数抑菌浓度值分别为10 μ g/ml, 30 μ g/ml, 25 μ g/ml, 20 μ g/ml,说明实验一制得的提取物能够较好的抑制枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生长。( 二)管碟法测抑菌能力将实验一制得的来源于MP68的固体提取物重新溶解后进行实验。通过管碟法，加入浓度为lmg/ml实验一制得的来源于IMP68的提取物，然后检测对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌以及结核分支杆菌的抑菌圈，结果頂P68来源的提取物对上述五种菌的抑菌圈分别为27.5土 1.5mm, 16土 1.5mm, 25土 1.0mm, 16.5±0.5mm和17.5±lmm。说明MP68来源的提取物具有很好的抑菌活性，而且可以抑制慢性感染病原菌结核分支杆菌的生长。PAOl来源的提取物对上述五种菌的抑菌圈分别为22±3mm，14mm± 1.5mm, 24mm± lmm, 20mm± Imm和20.5± 1mm。说明IMP68来源的提取物具有很好的抑菌活性，而且可以抑制慢性感染病原菌结核分支杆菌的生长。四、菌株在含有多环芳烃培养基中的生长、表面活性剂的产生以及生物被膜的形成能力。(一)菌株在含有荧蒽培养基中的生长、表面活性剂的产生以及生物被膜的形成能力将菌株分别接种到PPGAS培养基、由等量荧蒽替代甘油的PPGAS培养基和同时含有荧蒽和甘油的PPGAS培养基中(荧蒽和甘油的质量比为1: 1)，然后，在371:，200转/分钟条件下连续培养10天，每天取样，检测菌液OD值，制备菌株在上述三种培养基中的生长曲线；在第5天和第10天，检测菌株在三种培养基中合成的表面活性剂产量；取第I天，第5天和第10天的菌液，以每孔200微升的量接种到96孔板中，37°C过夜培养后，弃去液体，然后用1%的结晶紫染结合在96孔板板管壁上的生物被膜，然后用95%的乙醇溶解结合在生物被膜上的结晶紫，检测0D560读数。检测结果见图2。实验结果显示，尽管荧蒽代替甘油作为碳源，菌株基本无法生长，但是，在同时含有荧蒽和甘油的PPGAS培养基中，菌体可以生长繁殖形成较高的生物量(图2A)，同时，保持较高的合成鼠李糖脂的能力(图2B)，而且，形成生物被膜的能力更强(图2C)。(二)菌株在含有苯并菲培养基中的生长、表面活性剂的产生以及生物被膜的形成能力将菌株分别接种到PPGAS培养基、由等量苯并菲替代甘油的PPGAS培养基和同时含有苯并菲和甘油的PPGAS培养基中(苯并菲和甘油的质量比为1: 1)，其它方法与实验(一)相同。检测结果见图3。实验结果显示，在用苯并菲代替甘油作为碳源的培养基中，菌体在后期有略微生长，说明菌体可以直接代谢少量的苯并菲；而且，在同时含有苯并菲和甘油的培养基中，菌体生长(图3A)、表明活性剂的产量(图3B)和生物被膜(图3C)的形成基本无影响，说明菌株可以适应含有苯并菲的环境。(三)菌株在含芘培养基中的生长、表面活性剂的产生以及生物被膜的形成能力将菌株分别接种到PPGAS培养基、由等量芘替代甘油的PPGAS培养基和同时含有芘和甘油的PPGAS培养基中(芘和甘油的质量比为1:1)，其它方法与实验(一)相同。检测结果见图4。实验结果显示，在用芘代替甘油作为碳源的培养基中，菌体4天后，就有比较明显的生长(图4A)，说明菌体可以直接代谢芘。在同时含有芘和甘油的培养基中，前7天，菌体生长基本无影响，7天后不再增殖，但仍保持较高生物量，且表面活性剂的产量(图4B)和生物被膜(图4C)的形成 能力一直略强于只有甘油的培养基。说明该菌很好地生活在含有芘的环境中，而且，同时能合成鼠李糖脂。
权利要求
1.一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267。
2.权利要求1所述的铜绿假单胞菌MP68CGMCCN0.7267的如下任一应用: (1)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267在制备具有耐多环芳烃性能的微生物产品中的应用； (2)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在制备能在含有多环芳烃的环境中生长的微生物产品中的应用； (3)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267在油藏环境中提高原油采收率中的应用； (4)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在修复多环芳经污染中的应用； (5)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在制备表面活性剂和/或乳化剂中的应用； (6)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌中的任意一种或其组合。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述含有多环芳烃的环境为含有多环芳烃的铜绿假单胞菌培养基或含有多环芳烃的油藏。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于:所述多环芳烃为荧蒽、苯并菲或芘。
5.权利要求1 所 述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267发酵后得到的发酵产物。
6.权利要求5所述发酵产物的如下任一应用: (1)权利要求5所述发酵产物在作为表面活性剂和/或乳化剂中的应用； (2)权利要求5所述发酵产物在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌中的任意一种或其组合。
7.权利要求5所述发酵产物中的提取物。
8.根据权利要求7所述的提取物，其特征在于:所述提取物的制备方法为:将权利要求3所述的发酵产物去除菌体，保留发酵液上清，调节发酵液上清的pH值至2，然后4°C放置过夜，离心，取沉淀，再用氯仿甲醇混合液抽提，取有机相，即得；所述氯仿甲醇的体积比为2: 10
9.根据权利要求7或8任一所述的提取物，其特征在于:所述提取物含有鼠李糖脂。
10.权利要求7-9任一所述提取物的如下任一应用: (1)权利要求7-9任一所述提取物在作为表面活性剂和/或乳化剂中的应用； (2)权利要求7-9任一所述提取物在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌中的任意一种或其组合。
全文摘要
本发明公开了一株可以在含有多环芳烃的培养基中生长，合成鼠李糖脂，并且可以形成生物被膜的菌株及其应用。该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，其保藏编号为CGMCC NO.7267。本发明的菌株具有很强的产高效抑菌鼠李糖脂的功能。所产鼠李糖脂能够用于多环芳烃污染环境的修复，原油的开采等，在医药、环境保护以及能源开采等方面具有重要应用价值。
文档编号A61K31/7024GK103215207SQ20131013509
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月18日 优先权日2013年4月18日
发明者马旅雁, 王世伟, 王迪, 杨新平 申请人:中国科学院微生物研究所