一种有效降低铜绿假单胞菌生物膜耐药性的用药方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细菌感染的治疗和工业微生物生物膜污染的控制领域，具体涉及为一 种有效降低铜绿假单胞菌生物膜耐药性的用药方法。
【背景技术】
[0002] 生物膜（biofilm)是由微生物在自然界、某些工业生产环境以及人体和动植物表 面通过粘附生长及自身分泌的细胞外基质（Extracellularpolymericsubstances，EPS) 包裹所形成的高度组织化的多细胞群落。生物膜可由纯种或多种属微生物混合而成，其中 含有大量的水份以及不同微生物所分泌的细胞外基质，比如蛋白质、多糖、DNA等。形成在 工业、生活管道以及医疗器械管道内的生物膜能够导致腐蚀、堵塞管道、降低热能传输、污 染食品、引发持续慢性感染等问题，对人类社会造成巨大的经济损失。
[0003] 生物膜的形成是一个动态的过程，早起的生物膜比较容易去除。晚期的成熟生物 膜对物理方法（UV，冲洗等）和化学方法（表面活性剂、抗生素等）极其耐受。因此，能够有 效的控制生物膜的生长对于治疗慢性反复感染和控制食品安全有着极为重要的作用。
[0004] 铜绿假单胞菌是一类能够引发人类和动植物感染的重要革兰染色阴性致病菌，它 存在于土壤、尘埃、水和少数人体肠道中，亦可暂时寄生于皮肤。在医院内的铜绿假单胞菌 通常都对多种抗生素极其耐药，铜绿假单胞菌感染可招致败血症，患者有发热、黄疸、脾大， 并可发生肺炎、泌尿系感染、脑膜炎。当机体抵抗力低下时可致病，还可引起病人死亡。
[0005] 铜绿假单胞菌致病的一类重要原因是其能够在环境中和感染部位形成坚固的生 物膜结构。铜绿假单胞菌的生物膜在遇到抗生素处理时能迅速分化成对不同抗生素耐药的 亚群落，几乎能完全抵抗住高剂量的抗生素处理。目前，能够对铜绿假单胞菌快速杀伤的抗 菌类药物比较少（比如多粘菌素（polymyxin))。但是，铜绿假单胞菌生物膜还是能迅速分 化出对抗菌肽类药物耐药的亚群落。
[0006] 铜绿假单胞菌生物膜的形成需要群体感应系统（quorum-sensing，QS)的参 与。铜绿假单胞菌的群体感应系统包括Las信号系统和Rhl信号系统两类以酰基高 丝氨酸内醋化合物（acyl-homoserinelactone，AHL)为信号分子的系统，Las信号系 统由LasI基因和LasR基因组成，分别编码信号分子N-3-氧代十二酰-L-高丝氨酸 内醋（N-3-oxododecanoyl-L-homoserinelactone，3-〇x〇-C12_HSL)合成酶和转录激 活蛋白LasR，Rhl信号系统包含RhlI基因和RhlR基因，分别编码丁基高丝氨酸内酯 (N-butylhomoserinelactone，C4-HSL)合成酶和转录激活蛋白RhlR。铜绿假单胞菌的群 体感应系统还包括一个喹诺酮信号分子（PQS)介导的系统。
[0007] 最近，非编码RNA(ncRNA)被发现在细菌中起到重要的调控作用，其中RsmY/RsmZ 这两个ncRNA被发现能够全局调控铜绿假单胞菌的三个群体感应系统。能够抑制RsmY/ RsmZ的药物（比如红霉素（Erythromycin)和Iberin)最近被报道能够抑制铜绿假单胞菌 的群体感应系统（AzithromycininhibitsexpressionoftheGacA-dependentsmall RNAsRsmYandRsmZinPseudomonasaeruginosa.AntimicrobialAgentsAndChemoth erapy.2011. 55(7):3399-3405ComparativeSystemsBiologyAnalysisToStudythe ModeofActionoftheIsothiocyanateCompoundIberinonPseudomonasaeruginosa. AntimicrobialAgentsandChemotherapy.2014. 58(11):6648-6659)〇
【发明内容】
[0008] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种有效降低铜绿假单 胞菌生物膜耐药性的用药方法。该方法通过开发并联合使用非编码RsmY的抑制剂和抗菌 肽类药物来有效杀死和抑制铜绿假单胞菌生物膜，有效控制了由铜绿假单胞菌生物膜引发 的感染和工业污染。
[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0010] 一种有效降低铜绿假单胞菌生物膜耐药性的用药方法，同时向铜绿假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)生物膜中使用非编码RsmY的抑制剂和抗菌肽类药物。
[0011] 所述的非编码RsmY的抑制剂优选为大环内酯类抗生素；
[0012] 所述的抗菌肽类药物优选为多粘菌素；更优选为多粘菌素E;
[0013] 所述的非编码RsmY的抑制剂的用量是RsmY抑制IC50的浓度的2~10倍；
[0014] 所述的IC50是指所测量的RsmY抑制剂对其表达的半抑制浓度。
[0015] 所述的抗菌肽类药物的用量是MIC(最低抑菌浓度）的2~10倍；
[0016] 通过铜绿假单胞菌RsmY表达报告菌株筛选其菌群体感应系统抑制剂；其中，PAOl rsmY-gfp用来筛选能够抑制非编码RsmY的抑制剂，如红霉素（Erythromycin)等；
[0017] 通过铜绿假单胞菌LPS合成调控报告菌株PA01-Pp"_gfp筛选其敏感的抗菌肽类 药物，如多粘菌素；
[0018] 通过同时向铜绿假单胞菌生物膜中使用非编码RsmY的抑制剂和抗菌肽类药物， 能够有效控制其体外生物膜的生存和扩散。激光共聚焦显微镜观察体外铜绿假单胞菌生物 膜在被非编码RsmY的抑制剂和抗菌肽类药物联合使用时的死亡率比单独使用其中一种药 物时要高。
[0019] 通过同时向铜绿假单胞菌生物膜中使用非编码RsmY的抑制剂和抗菌肽类药物， 能够有效控制小鼠体内植入假体上生物膜的生存和扩散。假体上剩余的铜绿假单胞菌生物 膜和脾脏内的游离铜绿假单胞菌数量在被非编码RsmY的抑制剂和抗菌肽类药物联合使用 时比单独使用其中一种药物时要低。
[0020] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0021] (1)通过本发明的方法能够有效控制其体外生物膜的生存和扩散。激光共聚焦显 微镜观察体外铜绿假单胞菌生物膜在非编码RsmY的抑制剂和抗菌肽类药物联合使用时的 死亡率比单独使用其中一种药物时要高。
[0022] (2)通过本发明的方法能够有效控制小鼠体内植入假体上生物膜的生存和扩散。 假体上剩余的铜绿假单胞菌生物膜和脾脏内的游离铜绿假单胞菌数量在被非编码RsmY的 抑制剂和抗菌肽类药物联合使用时比单独使用其中一种药物时要低。
【附图说明】
[0023] 图1是RsmYRNA抑制剂（红霉素，Erythromycin)对报告基因rsmY-gfp的浓度 依耐型抑制图；其中，Gfp和0D600nm是培养16小时后的读数。
[0024] 图2是抗菌肽类抑制药物（多粘菌素E，colistin)对报告基因Pp"_gfp的浓度依 耐型激活图；其中，Gfp和0D600nm是每隔15分钟读取的数值。
[0025] 图3是铜绿假单胞菌PAOl菌株体外生物膜的用药结果活/死细菌数的柱形结果。
[0026] 图4是铜绿假单胞菌PAOl菌株小鼠体内假体生物膜的用药结果图。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0028] 以下材料在文献"ComparativeSystemsBiologyAnalysisToStudytheMode ofActionoftheIsothiocyanateCompoundIberinonPseudomonasaeruginosa. AntimicrobialAgentsandChemotherapy. 2014. 58(11):6648_6659" 中公开：PA01 rsmY-gfp〇
[0029] 以下材料在文献"Bis-(3,-5'）-cyclicdimericGMPregulatesantimicrobial peptideresistanceinPseudomonasaeruginosa.AntimicrobialAgentsand Chemotherapy. 2013. 57:2066-2075" 中公开：PA01-Pp"-gfp。
[0030] 实施例I
[0031] 第一歩，倍比稀释非编码RsmY的抑制药物（红霉素）。药物原液浓度为100mg/mL。 原液稀释好以后用过滤法除菌，小量分装备用。800yL原液加入IOOmLLB肉汤培养基中，混 合后抗菌药物的最高浓度为800yg/mL。吸取IOOyL最高浓度的药物