疫，第14天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与第二 次免疫相同，免疫途径同上；
[0146] 实施例6抗体的检测
[0147] 第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后，IgG、 IgGl、IgG2a体液应答水平。
[0148] 1.制备液体
[0149] 1)包被液的配制：称取NaHC03 1.6g，Na2C03 2.9g，溶于1L ddH20,用pH计将pH调至 9.6；
[0150] 2)封闭液的配制：lg牛血清V，溶于100mL抗体稀释液（1:100);
[0151] 3)抗体稀释液的配制:将磷酸盐溶于1L ddH2〇,再加入500yL Tween 20,再用pH计 将pH调至7.4;
[0152] 4)洗涤液的制备：称取2.42g Tris溶于1L ddH20,再加入500yL Tween 20,再用pH 计将pH调至7.4;
[0153] 5)显色液(TMB)，为天根公司产品；
[0154] 6)终止液(2M H2S〇4)的制备:将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH20中。
[0155] 2.ELISA检测Vacl4重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价
[0156] 1)用包被液将纯化后的Vacl4重组蛋白稀释为：lug/mL、5ug/mL、10ug/mL;
[0157] 2)包被:将重组蛋白稀释液加入酶标板，200μ!7孔，4 °C过夜后用洗涤液洗涤3遍， 空干后用保鲜膜包上，置于4°C冰箱中备用；
[0158] 3)封闭:酶标板加封闭液100μL7孔，置于37 °C孵育箱中2小时，洗涤3遍；
[0159] 4)将血清进行 1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000 等倍比稀释；
[0160] 5)取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL孔，，置于37°C孵育箱30min，洗 涤3遍，空干；
[0161] 6)将加 HRP标记的羊抗小鼠 IgG、IgGl、IgG2a抗体保存液，稀释1:5000，制成抗体工 作液；
[0162] 7)加入稀释抗体工作液，100μL7孔，置于37 °C孵育箱lh，洗涤三遍，空干；
[0163] 8)加入底物显色液(TMB)lOOyL/孔，室温避光反应5min;
[0164] 9)加入终止液(2M H2S〇4)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定0D值；
[0165] 10)结果判断:A样品/A阴性值^2.1为阳性（阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍 稀释）。
[0166] 结果:检测Vacl4蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:512000;免疫后第7天 的抗体阳性率达到1〇〇%，说明本发明构建的Vacl4重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗 体。
[0167] 实施例7通过免疫小鼠确定Vacl4重组蛋白免疫动物的攻毒保护
[0168] Vacl4蛋白抗原末次免疫后10-14天，用生理盐水将准备PA XN-1菌液并调节浓度 至1.5 X 101()CFU/mL，用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染，每只小鼠感染量为20yL，采 用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况，观察周 期为7天，观察期结束后剩余动物以C0 2吸入法安乐处死。统计各组小鼠
[0169] 的存活率。结果示于表1。
[0170] 表1 Vacl4重组蛋白免疫小鼠后的攻毒保护效果
[0171]
[0172] 表1显示：阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率分别为25%和20%，重组融 合蛋白Vacl4加 A1(0H)3佐剂组的平均免疫保护率为75%。因此，本发明的Vacl4重组蛋白具 有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答，并且能够对PA XN-1的感染起到保护作 用，可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防铜绿假单胞菌的感染。
【主权项】
1. 一种铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗候选抗原Vacl4,其特征在于:该抗原的 核酸序列如SEQ ID N0:1所示、氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。2. 根据权利要求1所述抗原的纯化方法，其特征在于，包括步骤:收集制备的所述抗原 Vac 14;按照高压破菌、离心;GST亲和纯化;SP HP层析纯化;G25层析纯化;Q HP层析纯化的 顺序组合对制备的抗原进行纯化。3. 根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于： 1) 高压破菌 将收集的Vacl4菌体作为目标蛋白，用pH为7.0-7.5的10mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷 后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清； 2. GST亲和纯化 GST亲和层析填料进行初步纯化，使用A液对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶进行酶切洗脱： 3. SP HP层析纯化 经步骤2)收集的目标蛋白，用A液平衡层析系统及SP HP层析柱，B液（2〇11^他2耶〇4-NaH2P〇4，1M NaCl，pH7 · 0-7 · 5)线性梯度洗脱； 4. G 25层析纯化 将经步骤3)纯化的目标蛋白，用G25层析柱纯化，C液平衡层析系统及层析柱，分离纯化 目标蛋白，置换缓冲液； 5. Q HP层析纯化 将经步骤4)纯化的标蛋白，C液平衡层析系统及Q HP层析柱，去除痕量非目标蛋白，内 毒素等杂质，分离纯化目标蛋白； 其中，A液为pH值7 · 0-7 · 5的20mM Na2HP〇4-NaH2P〇4缓冲溶液，B液为pH7 · 0-7 · 5的20mM Na2HP〇4-NaH2P〇4，1M NaCl缓冲溶液，C液为pH6 · 0的 10mM Hi s，0 · 9 %NaCl缓冲溶液。4. 根据权利要求3所述纯化方法，其特征在于：步骤1)所述的高压匀浆破菌采用60-80MPa，高速离心获取破菌上清。5. 根据权利要求3所述纯化方法，其特征在于:步骤2)所述的GST亲和层析使用的填料 为Glutathione Sepharose 4B或Glutathione Sepharose 4FF或Glutathione Sepharose HP 〇6. 根据权利要求3所述纯化方法，其特征在于:步骤2)所述的Prescission Protease酶 带有GST标签。7. 根据权利要求3所述纯化方法，其特征在于：步骤3)所述的SP HP层析柱的填料为SP Sepharose HP或SP Sepharose FF或Capto SP〇8. 根据权利要求3所述纯化方法，其特征在于：步骤4)所述的G 25层析柱的填料为 Sephadex G_25Coarse或Sephadex G_25Medium或Sephadex G_25Fine或Sephadex G_ 25Superfine〇9. 根据权利要求3所述纯化方法，其特征在于：步骤5)所述的Q HP层析柱的填料为Q Sepharose HP或Q Sepharose FF或Capto Q〇10. 根据权利要求2-9任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述抗原Vacl4采用以下方 法制备： 1) 设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成获得铜绿假单胞菌亚单位重组 基因工程疫苗Vacl4蛋白片段的核苷酸序列； 2) 将步骤1)获得的核苷酸序列克隆表达至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体 转化至宿主菌； 3) 诱导转换后的宿主菌表达重组蛋白。
【专利摘要】本发明公开了一种铜绿假单胞菌(PA)重组亚单位基因工程蛋白疫苗Vac14的纯化方法。Vac14蛋白为铜绿假单胞菌抗原分子的活性功能片段重组融合，通过大肠杆菌基因工程菌表达获得。采用对基因工程菌进行高压破菌、GST亲和层析、PP酶酶切、SP？HP层析、G？25层析、Q？HP层析等技术，获得高纯度的铜绿假单胞菌(PA)重组亚单位基因工程蛋白Vac14。该发明纯化工艺简捷、容易放大、重复性好，所获目标蛋白纯度高，动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。
【IPC分类】C07K1/22, C07K14/21, C07K1/16
【公开号】CN105622734
【申请号】CN201610118286
【发明人】敬海明, 顾江, 邹全明, 章金勇, 孙红武, 付强, 牟道华, 张玉东, 徐丽敏
【申请人】中国人民解放军第三军医大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年3月2日