专利名称：野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种野猪a-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法。
背景技术：
干扰素作为生物体内的第一病毒防御系统， 一直是各种生物体内重要的细 胞因子之一。利用干扰素来防治家畜的病毒性疾病，也是一种非常有效的手段。 野猪(X-干扰素是一种诱生蛋白，正常情况下动物机体是不产生的。目前，国内 主要是体外培养猪白细胞并诱导生产干扰素，然后从培养上清中提取干扰素。 这种方法生产的干扰素生物活性低，成本高，且猪血有各种病毒污染，也会给 产品的安全带来问题。通过基因工程技术，可以在体外大规模生产重组干扰素 蛋白。干扰素的非糖基化形式也具有生物活性，因而可以使用原核表达系统表 达该种蛋白。目前国内虽已开展了相关的研究，但是，还是没有一条完整的可 供生产的下游工艺，国内重组菌株的或者是表达量不高，或者是产物是以融合 状态表达，或者是产物带有纯化标签，或者是没有高密度发酵工艺，存在诸多 问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种野猪a-干扰素基因的合成序列、表达载体构建及 产物的制法，为在工业化大规模生产野猪Ol-干扰素提供一条高效、安全、经济、 稳定的生产工艺。
上述的目的通过以下的技术方案实现
野猪a-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，其组成包括用 大肠杆菌偏爱密码子以及密码子对合成了野猪a -干扰素基因，构建高效表达载 体并转化高效表达菌株，工程菌高密度发酵、包涵体的分离纯化、目的蛋白的 变性、复性和纯化以及表达产物的生物活性测定方法，所述的人工合成的编码 野猪a -干扰素的基因含有如下核苷酸序列ATG TGT GAT CTG CCG CAA ACC CAT AGC CTG GCG CAC ACC CGT GCG CTG CGT CTG CTG GCG CAG ATG CGT CGC ATC AGC CCG TTT AGC TGC CTG GAT CAC CGT CGC GAT TTT GGT TTC CCG CAG GM GCG CTG
GGC GGC AAC CAG GTG CAG AAA GCG CAA GCC ATG GCG CTG GTG CAT GAG ATG CTG CAG CAG ACC TTC CAG CTG TTC AGC ACC GAA GGC AGC GCG GCG GCC TGG GAT GAG AGC CTG CTG CAC CAG TTC TAT ACC GGT CTG GAT CAG CAG CTG CGC GAT CTG GM GCG TGC GTG ATG CAG GAG GCG GGC CTG GAA GGC ACC CCG CTG CTG GAG GAG GAT AGC ATT CTG GCG GTG CGT AAA TAT TTC CAT CGT CTG ACG CTG TAT CTG CM GM AAA AGC TAC AGC CCG TGT GCG TGG GAA ATT GTG CGT GCG GM GTG ATG CGC GCG TTC AGC AGC AGC ACC AAC CTG CAA GAT CGT CTG CGT, MA MA GM TAA，将含 有所述的核苷酸序列的野猪(x-干扰素的基因插入到带有PL、 pR启动子、Cits 温控阻遏蛋白基因的表达载体pWL中，构建成野猪a-干扰素的基因的表达质粒 pWL-poIFN-a，转化大肠杆菌DH-5a后，野猪a-干扰素获得高效表达。
所述的野猪a -干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，对所述的 工程菌进行30'C培养过夜，以10%接种量接种至发酵罐中，诱导表达时机为0D6。。 达到4 10时，42。C诱导发酵培养2. 5 5. 5小时，包涵体粗提液为50毫摩tris、 1毫摩乙二胺四乙酸、0.1毫克/亳升溶菌酶、0. l 0.4%TritonX-100，包涵 体精提液为50毫摩tris、 l毫摩乙二胺四乙酸、0.5 2摩尔脲，蛋白变性液 为8 10摩尔脲、50亳摩tris、 l毫摩乙二胺四乙酸、10毫摩二硫苏糖醇， 蛋白复性液为50毫摩tris、 1毫摩乙二胺四乙酸、5毫摩还原型谷胱甘肽、1 亳摩氧化型谷胱甘肽、10毫摩NaCl，分离纯化采用S印hacry S-200和 DEAE-S印harose FF层析柱纯化。
所述的野猪a -干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，所述的核 苷酸序列的5'端ATG TGT GAT CTG CCG CAA ACC CAT AGC CTG GCG以及3'端 CTG CAA GAT CGT CTG CGT AAA MA GAA TAA为经过自由能和mRNA 二级结构优 化的序列。
所述的野猪a-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，所述的 高效表达载体是含有核苷酸序列的野猪a -干扰素的表达载体使用了质粒载体 pWL，它含有pL、 pR启动子、Cits温控阻遏蛋白基因，以及特定的SD序列和起 始密码子ATG之间的序列为GAATTCAAA，以及野猪a-干扰素基因构建的载体， 所述的核苷酸序列的5'端起始密码子前面的核苷酸序列为GAATTCAAA。
所述的野猪a -干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，所述的 野猪a-干扰素的表达载体转化为大肠杆菌DH-5a，表达蛋白占菌体总蛋白的 25% 33%。
所述的野猪a -干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法,生产的重 组野猪a-干扰素分子量为19kD ，且在体外有效保护Wish细胞和胎猪体细胞 免受水泡性口炎病毒的攻击。
这个技术方案有以下有益效果
1. 本发明利用生物学软件改变了野猪a-干扰素基因中稀有密码子，使之变 成大肠杆菌的偏爱密码子，并且优化了 5'端起始密码子区域和3'端终止密码子 区域30个碱基的自由能和摩尔RNA 二级结构。5'端起始密码子前面的核苷酸 序列为GAATTCAAA,含有￡",R I酶切位点；3'端的终止密码子后加上了 I 酶切位点。该基因虽然改变了稀有密码子，但是氨基酸序列并无改变，表达水 平有很大提高。
2. 本发明所生产的重组野猪a-干扰素，其分子量为19kD，且在体外有效 保护Wish细胞和胎猪体细胞免受水泡性口炎病毒的攻击。
3. 本发明利用生物信息学，对野猪a-干扰素进行了全基因组扫描。优化设 计并合成了野猪a-干扰素基因，带有该基因的表达载体转化宿主大肠杆菌 DH-5a，获得高效表达，表达蛋白占菌体总蛋白的25% 33%。本发明也提供了 一套完整的下游生产工艺，包括高密度发酵、包涵体的分离纯化、目的蛋白的 变性、复性和纯化以及表达产物的生物活性测定方法。是一条可大规模工业化 生产重组野猪a -干扰素的方法。
4. 本发明提供了一整套工程菌高密度发酵、包涵体分离和纯化、蛋白复性 和纯化工艺。野猪a-干扰素具有高效抗病毒和功能，可用于猪病毒性传染病的 预防和治疗。并且由于存在交叉活性，该干扰素可用于牛、羊等动物的病毒性 疾病的治疗。
5. 本发明能够生产高活性、低成本的野猪a-干扰素，可以工业化大量生产 重组野猪a-干扰素。
附图1是本发明实施例野猪a-干扰素的成熟肽的核苷酸序列与其氨基酸 序列比对图。
附图2是本发明实施例天然野猪a-干扰素的成熟肽的核苷酸序列及其氨 基酸序列比对图。
附图3是本发明实施例野猪a -干扰素的序列的测定图谱。测定结果可见5' 端ATG之前引入了 EcoR I酶切位点，3'TAA之后引入了 Sal I酶切位点。
附图4是本发明实施例野猪a-千扰素的酶切鉴定图谱。
附图5是本发明实施例优化工程菌高密度发酵表达条件鉴定图谱。1为标准 分子量蛋白、2为未诱导的菌体、3为高密度发酵诱导条件表达的菌体。
附图6是本发明实施例工程菌表达野猪a-干扰素在大肠杆菌中存在形式 的鉴定图谱。
附图7是本发明实施例分离纯化的重组野猪a -干扰素SDS-PAGE电泳检定 图谱。
附图8是本发明实施例分离纯化的重组野猪a -干扰素HPLC的检测结果。
本发明的
具体实施例方式
实施例l:
野猪a-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，其组成包括用 大肠杆菌偏爱密码子以及密码子对合成了野猪a -干扰素基因，构建高效表达载 体并转化高效表达菌株，工程菌高密度发酵、包涵体的分离纯化、目的蛋白的 变性、复性和纯化以及表达产物的生物活性测定方法，所述的人工合成的编码 野猪a -干扰素的基因含有如下核苷酸序列ATG TGT GAT CTG CCG CAA ACC CAT AGC CTG GCG CAC ACC CGT GCG CTG CGT CTG CTG GCG CAG ATG CGT CGC ATC AGC CCG TTT AGC TGC CTG GAT CAC CGT CGC GAT TTT GGT TTC CCG CAG GAA GCG CTG GGC GGC AAC CAG GTG CAG AAA GCG CAA GCC ATG GCG CTG GTG CAT GAG ATG CTG CAG CAG ACC TTC CAG CTG TTC AGC ACC GAA GGC AGC GCG GCG GCC TGG GAT GAG AGC CTG CTG CAC CAG TTC TAT ACC GGT CTG GAT CAG CAG CTG CGC GAT CTG GAA GCG TGC GTG ATG CAG GAG GCG GGC CTG GAA GGC ACC CCG CTG CTG GAG GAG GAT AGC ATT CTG GCG GTG CGT AAA TAT TTC CAT CGT CTG ACG CTG TAT CTG CAA GAA
AAA AGC TAC AGC CCG TGT GCG TGG GAA ATT GTG CGT GCG GAA GTG ATG CGC GCG TTC AGC AGC AGC ACC AAC CTG CAA GAT CGT CTG CGT AAA AAA GAA TM，将含 有所述的核苷酸序列的野猪oi-干扰素的基因插入到带有pL、 pR启动子、Cits 温控阻遏蛋白基因的表达载体pWL中，构建成野猪(x-干扰素的基因的表达质粒 pWL-poIFN- a ，转化大肠杆菌DH-5 a后，野猪a-干扰素获得高效表达。
所述的野猪a -干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，对所述的 工程菌进行3(TC培养过夜，以10%接种量接种至发酵罐中，诱导表达时机为0D600 达到4 10时，42°C诱导发酵培养2. 5 5. 5小时，包涵体粗提液为50亳摩tris、 1毫摩乙二胺四乙酸、0.1毫克/毫升溶菌酶、0. l 0.4%TritonX-100，包涵 体精提液为50毫摩tris、 l亳摩乙二胺四乙酸、0.5 2摩尔脲，蛋白变性液 为8 10摩尔脲、50毫摩tris、 l毫摩乙二胺四乙酸、10毫摩二硫苏糖醇， 蛋白复性液为50毫摩tris、 l毫摩乙二胺四乙酸、5毫摩还原型谷胱甘肽、1 毫摩氧化型谷胱甘肽、10毫摩NaCl，分离纯化采用S印hacryS-200和DEAE-FF 层析柱纯化。
所述的野猪a -干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，所述的核 苷酸序列的5'端ATG TGT GAT CTG CCG CAA ACC CAT AGC CTG GCG以及3'端 CTG CAA GAT CGT CTG CGT AAA AAA GAA TM为经过自由能和mRNA 二级结构优 化的序列。
所述的野猪a-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，所述的 高效表达载体是含有核苷酸序列的野猪a -干扰素的表达载体使用了质粒载体 pWL，它含有pL、 pR启动子、Cits温控阻遏蛋白基因，以及特定的SD序列和起 始密码子ATG之间的序列为GAATTCAAA，以及野猪a -干扰素基因构建的载体， 所述的核苷酸序列的5'端起始密码子前面的核苷酸序列为GAATTCAAA。
所述的野猪a-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，所述的 野猪a-干扰素的表达载体转化为大肠杆菌DH-5a，表达蛋白占菌体总蛋白的 25% 33%。
所述的野猪a -干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，生产的重 组野猪a-干扰素分子量为19kD ，且在体外有效保护Wish细胞和胎猪体细胞
免受水泡性口炎病毒的攻击。
本发明中，利用生物学软件改变了野猪a-干扰素基因中稀有密码子，使之 变成大肠杆菌的偏爱密码子，并且优化了 5'端起始密码子区域和3'端终止密码 子区域内30个碱基的自由能和mRNA 二级结构，使之适合转录的起始。该序 列的5'端起始密码子前面的核苷酸序列为GAATTCAAA，含有五"RI酶切位点； 3'端的终止密码子后加上了6WI酶切位点。克隆至载体pWL之中，得到表达质 粒pWL-poIFN-a 。图1和图2分别显示了野猪a -干扰素的成熟肽的核苷酸序 列与氨基酸序列比对图和天然野猪a -干扰素的成熟肽的核苷酸序列及其氨基 酸序列比对图。
参考附图3，本发明实施例野猪a-干扰素的序列的测定图谱。测定结果可 见5'端ATG之前引入了 EcoR I酶切位点，3TAA之后引入了 Sal I酶切位点。 参考附图4，本发明实施例将表达质粒pWL-poIFN-a转化大肠杆菌。采用
氯化钓转化法，宿主菌为大肠杆菌DH-5ci。重组菌种的筛选随机挑取8-10 个单菌落分别接种于含10(Hig/ml氨苄青霉素钠的5m LB液体培养基之中，30 。C 220 r/min过夜培养。次日，收集菌体，微量碱变性方法提取质粒，质粒经 过酶切鉴定片断大小与设计结果一致。其中l为单酶切，2为EcoRl和Sal1 双酶切，3为标准分子量
参考附图5，本发明实施例将野猪a -干扰素工程菌接种于含100jig/ml氨 苄青霉素钠的液体LB培养基之中，30°C 220 r/min培养15 h，至00600约1.5， 次日按10%的接种量接种发酵罐中，发酵罐内含有4 L已灭菌的分批培养的基 础培养基(蛋白胨10 g，丙三醇20ml，酵母粉5 g， Na2HP04 '12H;jO 8g， KH2P04 4g， MgS047H20 0.25 g， CaCl2 0.1 g，微量元素(微量元素储备液FeS04.7 H20 lg， MnS04.H20 1g， ZnS047H20 2.78 g， CoCl2.6H20 2g， Na2Mo04 2 H20 2 g， CuS045H20 1.85 g， H3B03 0. 5 g，定容至lL)4ml〕、 2ml消泡剂和4g 氨苄青霉素。初始发酵参数设置温度30'C , pH值7.2， DO值(溶氧浓度)100 %;起始搅拌速度230 r/min 。当DO值在3 min之内下降至60%以下，则开 始进行补料发酵，流加补料培养基(蛋白胨8 g，丙三醇3ml，酵母粉8 g， MgS04 7H20 0.25 g，定容至1 L)。当0D,达到4 5时，在5 min内将发酵
罐升温至42-C，进行诱导表达。诱导表达5小时的时候终止发酵。图5中，1:
标准分子量蛋白2:未诱导的菌体3:本实施例高密度发酵诱导条件表达的菌体。
参考附图6，本发明实施例用离心法收集发酵的菌体，经生理盐水洗涤后超 声波破碎菌体，离心后上清和沉淀作SDS-PAGE电泳鉴定。未诱导的菌作为空白 对照。结果表明表达野猪a-干扰素以包涵体的形式存在。
本发明实施例重组野猪a-干扰素的提取和变性离心收集发酵菌体，将细 菌溶于以下溶液TE(50mM tris、 1 mM EDTA)、 O.lmg /ml溶菌酶、0.1 0.4%TritonX-100，室温搅拌过夜。次日，在冰浴中进行超声破碎。离心弃上清。 沉淀用TE+0.5M的尿素搅拌清洗。离心弃上清。沉淀TE清洗，离心弃上清。 最后沉淀用Tris清洗，离心。得到初步纯化的包涵体，加入蛋白变性液(8 10 M脲、50mM tris、 1 mM EDTA、 10 mM DTT)，搅拌过夜后，12000r/min，离心， 20min，取上清，弃沉淀。图6中，1:标准分子量蛋白，2:包涵体。
参考附图7，本发明实施例重组野猪a-干扰素的复性和纯化以含6M尿 素和lOmM DT T的TE溶液作为流动相经过Sephacryl S-200凝胶层析，收集 第二个出样峰。将Sephacryl S-200凝胶层析收集的第二个样品峰，缓缓稀释到 4。C预冷的复性液之中。复性液中含有1mM GSSG，IO mM DTT以及TE(pH8.5) 缓冲液，并补充尿素使其终浓度为0.5M。4"C，过夜。复性的样品上样至DEAE-FF 柱上，用150 mM NaCl2的50 mM tris缓冲液洗下样品峰。SDS—PAGE电泳 鉴定纯化的重组野猪ot-干扰素(参考附图7)其纯度大于95%。图7中，1为 标准分子量蛋白，2为纯化蛋白还原电泳，3为纯化蛋白的非还原电泳。
本发明实施例重组野猪a-干扰素的活性检定用微量细胞病变抑制法，以 Wish细胞/VSV为基本检测系统。将抑制50%细胞病变(CPE)的干扰素的 最高稀释度定义为1个干扰素单位(U)。活性检测结果表明，野猪d干扰素的 生物学活性为4.45xl06UI/mg。
参考附图8， HPLC检测重组野猪ci-干扰素纯化蛋白的结果，纯度在98% 以上。
权利要求
1. 一种野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，其组成包括用大肠杆菌偏爱密码子以及密码子对合成了野猪α-干扰素基因，构建高效表达载体并转化高效表达菌株，工程菌高密度发酵、包涵体的分离纯化、目的蛋白的变性、复性和纯化以及表达产物的生物活性测定方法，其特征是所述的人工合成的编码野猪α-干扰素的基因含有如下核苷酸序列ATG TGT GATCTG CCG CAA ACC CAT AGC CTG GCG CAC ACC CGT GCG CTG CGT CTG CTG GCG CAGATG CGT CGC ATC AGC CCG TTT AGC TGC CTG GAT CAC CGT CGC GAT TTT GGT TTCCCG CAG GAA GCG CTG GGC GGC AAC CAG GTG CAG AAA GCG CAA GCC ATG GCG CTGGTG CAT GAG ATG CTG CAG CAG ACC TTC CAG CTG TTC AGC ACC GAA GGC AGC GCGGCG GCC TGG GAT GAG AGC CTG CTG CAC CAG TTC TAT ACC GGT CTG GAT CAG CAGCTG CGC GAT CTG GAA GCG TGC GTG ATG CAG GAG GCG GGC CTG GAA GGC ACC CCGCTG CTG GAG GAG GAT AGC ATT CTG GCG GTG CGT AAA TAT TTC CAT CGT CTG ACGCTG TAT CTG CAA GAA AAA AGC TAC AGC CCG TGT GCG TGG GAA ATT GTG CGT GCGGAA GTG ATG CGC GCG TTC AGC AGC AGC ACC AAC CTG CAA GAT CGT CTG CGT AAAAAA GAA TAA，将含有所述的核苷酸序列的野猪α-干扰素的基因插入到带有pL、pR启动子、Cits温控阻遏蛋白基因的表达载体pWL中，构建成野猪α-干扰素的基因的表达质粒pWL-poIFN-α，转化大肠杆菌DH-5α后，野猪α-干扰素获得高效表达。
2. 根据权利要求1所述的野猪a-干扰素的基因合成和载体构建及产物的 生产方法，其特征是对所述的工程菌进行3(TC培养过夜，以10%接种量接种 至发酵罐中，诱导表达时机为0De。。达到4 10时，42"C诱导发酵培养2.5 5.5 小时，包涵体粗提液为50毫摩tris、 1毫摩乙二胺四乙酸、0. 1毫克/毫升溶 菌酶、0. 1 0. 4%TritonX-100,包涵体精提液为50毫摩tris、 1毫摩乙二胺 四乙酸、0. 5 2摩尔脲，蛋白变性液为8 10摩尔脲、50毫摩tris、 1毫摩 乙二胺四乙酸、10毫摩二硫苏糖醇，蛋白复性液为50毫摩tris、 l毫摩乙二 胺四乙酸、5毫摩还原型谷胱甘肽、l毫摩氧化型谷胱甘肽、10毫摩NaCl，分 离纯化采用S印hacry S-200和DEAE-S印harose FF层析柱纯化。
3.根据权利要求1或2所述的野猪a -干扰素的基因合成和载体构建及产 物的生产方法，其特征是所述的核苷酸序列的5'端ATG TGT GAT CTG CCG CM ACC CAT AGC CTG GCG以及3'端CTG CAA GAT CGT CTG CGT MA AAA GM TM 为经过自由能和mRNA 二级结构优化的序列。
4. 根据权利要求1或2所述的野猪ci-干扰素的基因合成和载体构建及产 物的生产方法，其特征是所述的髙效表达载体是含有核苷酸序列的野猪a-干扰素的表达载体使用了质粒载体pWL，它含有pL、 pR启动子、Cits温控阻遏 蛋白基因，以及特定的SD序列和起始密码子ATG之间的序列为GAATTCAAA，以 及野猪a-干扰素基因构建的载体，所述的核苷酸序列的5'端起始密码子前面 的核苷酸序列为GAATTCAAA。
5. 根据权利要求1或2所述的野猪a -干扰素的基因合成和载体构建及产 物的生产方法，其特征是所述的野猪a -干扰素的表达载体转化为大肠杆菌 DH-5a，表达蛋白占菌体总蛋白的25% 33%。
6.根据权利要求l或2所述的野猪a -干扰素的基因合成和载体构建及产物 的生产方法，其特征是生产的重组野猪a-干扰素分子量为19kD，且在体外 有效保护Wish细胞和胎猪体细胞免受水泡性口炎病毒的攻击。
全文摘要
野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，国内重组菌株或者是表达量不高，或者是产物是以融合状态表达，或者是产物带有纯化标签，或者是没有高密度发酵工艺，存在诸多问题。本发明组成包括用大肠杆菌偏爱密码子以及密码子对合成了野猪α-干扰素基因，构建高效表达载体并转化高效表达菌株，工程菌高密度发酵、包涵体的分离纯化、目的蛋白的变性、复性和纯化以及表达产物的生物活性测定方法。本发明属于生物制药中的基因工程生产多肽药物技术领域。
文档编号C12N15/21GK101392256SQ20071014434
公开日2009年3月25日 申请日期2007年9月21日 优先权日2007年9月21日
发明者娣 刘, 李文辉, 王君伟 申请人:黑龙江省农业科学院畜牧研究中心;东北农业大学