专利名称：一个绿豆抗豆象的qtl作图区间的制作方法
技术领域：
本发明属于分子育种领域，具体地讲涉及一个绿豆抗豆象的QTL作图区间。
背景技术：
绿豆[Wgwa radiate wic/ze^是我国主要的食用豆类作物。然而，豆象(Genus 02//osoZ)rwc/i"W是对绿豆及其他豇豆属作物危害最严重的世界性仓储害虫，主要包括绿豆象 〖Ca//oso6r c/!iis. CW"esis L.)、 四纹豆象(Ca肠o6mc/ius. macw/ates F.) 禾口灰豆象 (01//0 ^^^/1"&/^0^0 G.)，其中以绿豆象和四纹豆象危害最重。豆象危害会造成绿豆产量、 品质和发芽率的降低。在绿豆l个生活周期内，因豆象危害可损失产量的30% 56%，如再 次侵染危害更重，甚至整仓绿豆受损。化学杀虫防治豆象势必造成绿豆生产成本的增加，还 会污染生态环境，威胁人类身体健康。因此，选育抗豆象绿豆品种是防治豆象的最佳途径。
20世纪80年代以来，日本、泰国、澳大利亚等国的食用豆类遗传育种学家致力于抗豆 象基因的发掘和利用。目前筛选出的抗豆象绿豆基因资源主要有马达加斯加野生种TC1966、 印度栽培种V2709、菲律宾栽培种V2802和澳大利亚野生种ACC41。 TC1966是研究最多的 抗源，Fujii等(1987)研究表明TC1966高抗绿豆象和四纹豆象。Kitamura等(1988)研究 发现TC1966对豆象的抗性由显性单基因控制，Young等(1992)和Kaga等(1998)分别构 建了绿豆F2:3群体和高代回交群体的遗传连锁图谱，并都将该抗豆象主效基因定位在第9连 锁群上。Tomooka等(1992)和Watanasit等(1996)分别利用TC1966做亲本成功地培育出 绿豆抗豆象高代品系。Ishimoto等(2004)也尝试着进行抗豆象基因的分离。Talekar等(1992) 研究表明V2709和V2802均抗绿豆象和四纹豆象，抗性均由1个主效显性基因控制，Prakit 等(2007)研究表明V2709和V2802对绿豆象和四纹豆象的抗性很可能在同一位点。
数量性状基因位点QTLs (Quantitative trait loci)是指对数量性状的变异有较大影响的单 个基因或紧密连锁的基因簇。QTL的提出为研究绿豆数量性状单基因作用及其互作效应，以 及建立在此基础上的遗传分析模型的应用提供了理论依据，为绿豆抗豆象育种方案的切实实 施开辟了新途径。
Kaga等(1996)利用饭豆和小豆杂交的中间作图群体定位了第2连锁群上的1个抗绿豆象 主效QTL。 Somta等(2006)利用栽培饭豆[Wgw. "wte//ate (Thunb.) Ohwi & Ohashi]与野生小 豆[Fiig"a. nafowWmae (Ohwi) Ohwi & Ohashi]杂交F2代作图群体，对不同发育时期的绿豆象和 四纹豆象进行动态QTL检测和遗传效应分析，在第7连锁群上检测到1个稳定的抗绿豆象主效 QTL，在第3连锁群上检测到1个稳定的抗四纹豆象主效QTL。目前，还未见有关绿豆抗豆象 QTL分析的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一个如图1所示的绿豆抗豆象QTL的连锁群作图区间 STSbrl VrCS161,该区间的STSbrl可作为选择绿豆抗豆象材料的分子标记。
本发明利用澳大利亚的高感豆象绿豆栽培种Berken (ra&ato ssp. ra&ato)和高抗豆 象绿豆野生种ACC41(Mgna. radz'ato ssp.犯Woteta)亚种内杂交得到的227个株系的Fwo代重组 近交系(Recombinant inbred line)群体及据此构建的包含79个RFLP分子标记的遗传连锁图 谱，通过对连续2年(即2005年7月和2006年7月)的3个种植环境条件下(即2000年在
澳大利亚，2005年在北京、南京)收获的RIL群体的室内人工接虫鉴定，分别评价重组近交 系群体的抗绿豆象表现。
利用Windows QTL cartographer Version 1.13作图软件的复合区间作图法，以IdD值^3.0 作为出现QTL的检测标准，对重组近交系的种子受害率进行QTL作图。结果在第I连锁群 发现了四个年份X地点环境下重复出现QTL的区间STSbrl VrCS161,如图1所示。
按照Humphry (2005)对QTL的命名方法，将位于第I连锁群的该QTL命名为6rt。该 抗绿豆象QTL,的丄OD值在12.99~82.74，解释表型变异的74.05%~79.27 %，距离左翼标记 STSbrl的距离为4.0 8.0 cM。该QTL的加性效应为负值，表明来自母本Berken的该位点等 位基因可增加种子受害率的40.75%~45.18%,即抗性等位基因来自父本ACC41 (表1)。因此， 无论从抗绿豆象QTL与STSbrl的距离还是从QTL对表型的贡献率来看，STSbrl VrCS161 都是抗绿豆象的理想标记区间。利用本发明提供的一个如图1所示的绿豆抗绿豆象QTL的作 图区间STSbrl VrCS161的重要意义在于，为绿豆抗豆象分子标记辅助育种，加快育种进程， 提高育种效率提供了一种经济有效的分子育种新途径。
表1四个年份X地点绿豆抗绿豆象的QTL作图
年份x地点(JTL所 连 群在 锁区间标记区间 长度 (cM)QTL峰离左 标记距离 (cM)加性效 应贡献率
2005澳大利 亚 2006澳大利 亚 2006北京 2006南京ISTSbrl VrCS16114.38.082.74-40.7579.27
ISTSbr卜VrCS16114.38.0115.12-45.1877.38
MI ISTSbr卜VrCS161 STSbrl VrCS16114.3 14.34.0 6.030.46 12.99-42.20 -41.9374.05 74.5
图l: 抗绿豆象QTL在连锁群I上的作图区间。
该图是由绿豆重组近交系群体(BerkenXACC41)构建的连锁群I的分子标记连锁图。 图中的空心长方形线代表连锁群，左侧数字是标记之间的遗传距离，单位是cM，右侧是RFLP 分子标记的名称，**表示标记表现0.05水平的极显著偏分离。其中Vr一表示绿豆克隆，Lp一表 示藕豆克隆，STSbr一表示绿豆STS标记。
连锁群右側的三角形表示不同年份不同环境下的QTL作图区间，其中白色表示2005澳 大利亚，浅灰色表示2006澳大利亚，灰色表示2006北京，黑色表示2006南京。四个年份X 地点的QTL作图区间均在STSbrl VrCS161。
具体实施例方式
实施例抗绿豆象的室内人工接虫鉴定
为保存种质，在保证家系内种子质量和群体结构仍为随机群体的情况下，分别选取2000 年在澳大利亚大田收获的2个重复各为210个和217个的F9RIL为试验材料，采用国家科技 攻关项目选用的室内人工接虫方法，分别于2005年7月和2006年7月接虫。并于2006年将 2005年分别在北京及南京种植其中一个重复的210份F9RIL收获72和59个F10RIL群体用 于接虫。2年接虫均用中绿1号作对照，设2次重复。从每个家系中随机选取60粒健康种子 分成2份，每份30粒种子，分别放入直径6cm和高lcin的小塑料盒中，不加盖，放入大塑料
盒内(66cmx44cmxl8cm)，上面盖2层黑布，置于养虫架上。养虫温度控制在(27±2) 。C， 并保持黑暗和相对高湿。每个大塑料盒中放入400 500对刚羽化l 3d的成虫，让其在盒内 各材料上随机产卵，至感虫亲本每粒种子着卵量大约在5粒以上时，除去成虫，将已接虫材 料继续在养虫室培养。待对照中绿1号种子受害率达100%时，调査每份材料的受害粒数，换 算成种子被害率(即受害百分数)。
绿豆抗绿豆象QTL的连锁群作图区间STSbrl VrCS161的确定
利用该RIL群体构建的具有79个RFLP分子标记的遗传连锁图谱的构建见文献(Humphry 等，2005)。图谱中的分子标记均匀的分布于13个连锁群上，覆盖了绿豆基因组约684.7cM， 其中最短连锁群5.6cM,最长连锁群85.9cM，标记间平均距离为10.4cM，最大距离为20.7cM。
用Windows QTL cartographer Version U3作图软件的复合区间作图法(composite interval mapping),以值23.0作为出现QTL的检测标准，对重组近交系的种子受害率进行QTL 作图。结果在第J连锁群发现了四个年^-地点环境下重复出现QTL的区间STSbrl VrCS161, 如图1、表l所示。
STSbrl VrCS161区间内抗绿豆象QTL对表型变异的贡献率在74.05%~79.27 %,距离左 翼标记STSbrl的距离为4.0~8.0 cM。因此，无论从抗绿豆象QTL与STSbrl的距离还是从 QTL对表型的贡献率来看，STSbrl VrCS161都是抗绿豆象的理想标记区间。 STSbrl VrCS161区间内抗绿豆象QTL的加性效应为负值，表明即抗性等位基因来自父本 ACC41。在利用STSbrl进行分子标记选择抗豆象绿豆材料时，要剔除与Berken具有相同标 记的育种材料。
权利要求
1一个绿豆抗绿豆象QTL的连锁群I的作图区间STSbr1～VrCS161。
全文摘要
本发明提供了一个绿豆抗绿豆象QTL的连锁群作图区间STSbr1～VrCS161，该区间的STSbr1可作为选择绿豆抗豆象材料的分子标记。本发明的意义在于提供的QTL作图区间，为绿豆抗豆象分子标记辅助育种，加快育种进程，提高育种效率提供了一种经济有效的分子育种新途径，以减轻绿豆象危害。
文档编号C12Q1/68GK101358233SQ20071014383
公开日2009年2月4日 申请日期2007年8月3日 优先权日2007年8月3日
发明者刘春吉, 刘长友, 蕾 孙, 宁 徐, 丽 梅, 王丽侠, 王素华, 程须珍 申请人:中国农业科学院作物科学研究所;刘春吉