一种海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备方法

专利名称：一种海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物粘合剂，尤其是涉及一种海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备 方法。
背景技术：
海洋贻贝属于软体动物门瓣鳃纲，是沿岸和近海中普遍存在的一种生物，其足丝腺能分 泌足丝附着在坚硬的基体上，使它们能在巨浪冲刷下仍紧紧附着于礁石而不分离。这种足丝 粘胶的主要成分足丝粘附蛋白具有高强度、高韧性和防水性。目前己有美国BD Bioscience 公司从紫贻贝(Mytiluseduis)的足部提取到粘附蛋白，用作细胞和组织粘附剂，该产品已商业 化，名称和货号分别为BD CELL-TAKTM CELL AND TISSUE ADHESIVE, Catalog No. 354240,354241。该产品可涂覆用于细胞培养和组织切片等的玻片、塑料或金属表面以增强与 样品的粘附。但是贻贝分泌粘附蛋白的量极少，从大约10000个贻贝中也仅能提取到lmg的 粘附蛋白，而且由此获得的粘附蛋白产品如CELL-TAKTM价格也十分昂贵，很难满足需要。
已有文献报道用基因工程手段表达重组的粘附蛋白用作生物粘合剂，他们用原核表达载 体pTrcHisA重组紫贻贝(M,7w ga/Z印raW"c^to)的Mgfp-3A、 Mgfp-5以及Mgfp-5与Mgfp-1 的十肽重复序列融合蛋白，结果表明表达的重组蛋白具有较好的粘附功能(1 、 Hwang DS, Gim Y, Cha HJ. Expression of functional recombinant mussel adhesive protein type 3A in Escherichia coli[J]. Biotechnol Prog, 2005, 21 (3): 965-970; 2、 Hwang DS, Gim Y, Kang DG， et al. Recombinant mussel adhesive protein Mgfp-5 as cell adhesion biomaterial[J]. J Biotechnology, 2007， 127 (4): 727—735; 3、 Hwang DS, Gim Y， Yoo HJ， et al. Practical recombinant hybrid mussel bioadhesive fp-151[J] .Biomaterials, 2007, 28(24): 3560-3568)。

发明内容
本发明的目的在于提供一种具有可降解性和防水性，且生物相容性好的海洋贻贝粘附蛋 白防水生物粘合剂的制备方法。
本发明的具体步骤如下
1) 从活的厚壳贻贝足部提取总RNA，反转录成cDNA;
2) 根据厚壳贻贝M. coruscus的Mcfp-1基因(序列来自GenbankNo. D63777)序列中编码Mcfp-l氨基酸序列从第692位到第811位氨基酸残基(序列来自GenbankNo. Q25434)的 12个连续的十肽重复序列的DNA片段设计PCR引物，在前向引物和反向引物末端分别设有 ￡coR I和Sa/1酶切位点，引物序列如下
弓I物F: 5' -ccgaattctataaacctaagaaaacttatcc -3'，
弓1斗勿R: 5 ， - atgtcgacttacgttggtggatagcgtatc -3 ，；
3) 以步骤l)提取的cDNA为模板，用引物F和引物R进行PCR扩增，获得厚壳贻贝 M. coruscus的Mcfp-l基因中编码Mcfp-l氨基酸序列从第692位到第811位氨基酸残基的12 个连续的十肽重复序列的DNA片段产物；其DNA片段(360 bp)序列如下
Tataaacctaagaaaacttatcctccaacatataaaccgaagataagttatccaccaacgtataaaacaaagccaagttatccagcatcttat aaacgtaagacaagttatcctccaacatataaacctaagataagttatccttcaacttataaagcaaagccaagttatccaccaacgtataagc caaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacgtataaaccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaaccta agatacgctatccaccaacgtataaaccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacg 编码的氨基酸(120 aa)序列为YKPKKTYPPTYKPKISYPPTYKTKPSYPASYKRKTSYPP
KPKPSYASSYKPKIRYPPT
4) 将PCR获得的DNA片段经克隆载体pMD18-T克隆，再切出连接到原核表达载体 pGEX-4T中构建重组质粒；
5) 将构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21菌株中，通过IPTG诱导，表达出融合有GST 的Mcfp-l第692位到811位氨基酸残基的多肽产物，标记为GST-Mcfp-1-12;
6) 用谷胱甘肽一琼脂糖树脂纯化该多肽产物；
7) 用凝血酶切除融合的GST，离心得到不溶性Mcfp-l功能肽段产物沉淀；
8) 最后用酪氨酸酶对纯化的多肽产物进行修饰，即得到厚壳贻贝粘附蛋白防水生物粘合 齐廿，命名为Mcfp-1-12。
本发明能快速获得粘附蛋白防水生物粘合剂。 一旦获得粘附蛋白功能片段的重组质粒， 就可以源源不断的由大肠杆菌BL21诱导表达粘附蛋白功能肽段。该多肽产物酶切和修饰方 法过程简单，所需原料只是微量凝血酶和酪氨酸酶。酶切过程只是在25'C条件下反应16—20 h，即可产生白色可见的不溶性粘附蛋白功能肽段产物沉淀，用PBS洗涤多肽沉淀后用5%的 醋酸溶解，然后用酪氨酸酶反应6 h即可，操作简单，成本低廉。所制备的粘附蛋白防水生 物粘合剂能在潮湿的环境下粘附在玻璃、金属钛、铝和塑料表面并且流水冲洗2 h也不掉， 能在短时间内粘附细胞，与CELL-TAKTM细胞和组织粘附剂相比有类似或者更好的效果，并 且没有发现细胞毒性。在潮湿的环境下，几微克的微量粘附蛋白防水生物粘合剂就能粘接塑料和小鼠股骨。避免为了微量的足丝粘附蛋白而大量捕杀海洋贻贝的资源浪费。所得防水粘 合剂不仅符合科研需要，且作为生物医用材料生物粘合剂在临床使用具有广泛的应用前景。


图1为实施例l￡coR I和1双酶切检验PCR片段(360 bp)插入pMD18-T载体的阳性 克隆质粒凝胶电泳图。M为DNA分子量标准，S为酶切的质粒样品，图左边的3000bp、 2250 bp、 500 bp和250 bp为相应DNA条带碱基数，图右边2692 bp表示pMD-18T载体的碱基数， 360 bp为插入目的片段的碱基数。
图2为实施例l￡coR I和5W I双酶切检验从pMD18-T载体切出的目的DNA片段(360bp) 插入pGEX-4T载体的阳性克隆质粒凝胶电泳图。Ml和M2为DNA分子量标准，S为酶切的 质粒样品，图左边4900 bp、 500 bp和250 bp为相应DNA条带碱基数，图右边4900 bp为 pGEX-4T载体碱基数，360 bp为插入目的片段DNA碱基数。
图3为pGEX-4T载体通过￡coR I和1位点插入目的片段重组质粒的测序结果图。 箭头指向分别为I和I位点。
图4为实施例2在潮湿的环境中粘合剂Mcfp-l-12在塑料(A)、玻璃(B)、金属钛(C) 和铝(D)材料表面粘附后流水冲洗2小时后考马斯亮兰染色图。其中W/OT表示未经酪氨 酸酶修饰，WT表示酪氨酸酶修饰。
图5为实施例3粘合剂Mc^-1-12在硅金片上吸附量的QCM(Quartz crystal microbalance) 图。其中横坐标为测试吸附量的蛋白质，纵坐标为蛋白质在硅金片上吸附量的频率参数一A F(Hz)， W/OT表示未经酪氨酸酶修饰，WT表示酪氨酸酶修饰。
图6为实施例4在潮湿的环境中粘合剂Mcfp-1-12粘接实验室塑料枪头与塑料培养皿示 意图。其中A、 B、 C分别表示粘合剂Mcfp-l-12、未经酪氨酸酶修饰的Mcfp-1-12和BSA。
图7为实施例5在潮湿的环境中粘合剂Mcfp-1-12粘接小鼠股骨示意图。A和B分别表 示用BSA和未经酪氨酸酶修饰的Mcfp-1-12粘合的股骨，C和D为粘合剂Mcfp-1-12粘合的 股骨。
图8为实施例6粘合剂Mcfp-1-12在1 h内粘附细胞的示意图。左边Mcfp-1-12 coated region 表示粘合剂Mcfp-1-12包被的区域，右边uncoated region为未包被的区域。 图9为实施例7粘合剂Mcfp-1-12对293T细胞的安全性分析图。 图10为实施例7粘合剂Mcfp-1-12对Hela细胞的安全性分析图。
在图9和10中，横坐标为时间Time (h)，纵坐标为吸光值Absorbance (490nm)， 一定 时间内测定样品在490 nm波长的吸光值，Uncoated表示没有粘合剂包被的培养皿，Mcfp-1-12 表示经Mcfp-1-12粘合剂包被的培养皿，293T表示人胚肾细胞，Hela表示子宫颈癌细胞。〇未包被Uncoated粘合剂Mcfp-1-12。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1:海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂Mcfp-l-12的制备
1. PCR获取目的基因片段，连接到克隆载体从活的厚壳贻贝M. comscus上切取其足 部，提取总RNA，反转录成cDNA。根据厚壳贻贝M. coruscus的Mcfp-l基因(序列来自Genbank No. D63777)序列中编码Mcfp-l氨基酸序列从第692位到第811位氨基酸残基(序列来自 Genbank No. Q25434)的12个连续的十肽重复序列的DNA片段设计PCR引物(由上海生工 生物工程技术服务有限公司合成)，设计引物时在前向引物和反向引物末端分别加上￡coRl 和1酶切位点，引物序列如下
弓I物F: 5 ，-ccgaattctataaacctaagaaaacttatcc -3 ，，
弓I华勿R: 5 ， - atgtcgacttacgttggtggatagcgtatc -3 ，； 以上述cDNA为模板，进行PCR扩增反应。
PCR扩增体系C50
模板cDNA 2.5 pi
引物F(0.2nM) 1 pi
引物R(0.2nM) lpl
dNTP (2.5 mM) 1 pi 10 x尸;;roZ)eW缓冲液
ddw 39.2 jxl
i>"o^rfTM DNA聚合酶(Takara公司大连分公司) 0.3 pi PCR反应循环94。C变性30s， 65。C退火30s， 72。C延伸30 s，循环30次。 PCR产物跑琼脂糖胶回收后直接连接到pMD18-T载体(购自Takara公司大连分公司)， 转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素100pg/ml的LB平板培养板，并在 37'C恒温培养箱中培养16 h。挑取单克隆，37'C液体LB (含氨苄青霉素100 pg/ml)摇菌过 夜，煮沸法小量提取质粒。EcoRl和Sall双酶切检验阳性克隆质粒(如图1)， M为DNA分 子量标准；S为酶切的质粒样品，其中两条带分别为pMD18-T载体和插入目的片段。 2. GST融合表达载体的构建 pGEX-4T载体的制备(50|al):
pGEX-4T 1昭
￡coR I 1 pl10 xH buffer 5 |il
ddw 42 (il
37'C温育lh后，在原酶切体系中加入碱性磷酸酶(CIP) 1 pi, 37匸温育45min。反应 产物跑琼脂糖胶回收。所用限制性内切酶和CIP酶均购自Takara公司大连分公司(以下同)。 目的DNA片段的制备(50 pi):
上述pMD18-T载体连接的克隆 5pl ￡coR I 1 |al
I 1 pi
10 xH buffer 5^1 ddw 38 pi
37'C温育lh后，反应产物跑琼脂糖胶回收。将以上所得载体与目的片段经T4 DNA连 接酶(购自美国Irwi加gen公司)于16。C连接过夜，连接反应体系如下(15pl体系) 载体 2 ^
片段 8 |al
5 x连接酶缓冲液3 pi T4DNA连接酶 1.5 |il 将连接产物转化到大肠杆菌DH5oc感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素100 ^g/ml的LB 平板培养板，并在37'C恒温培养箱中培养16 h。挑取单克隆，37'C液体LB (含氨苄青霉素 100吗/ml)摇菌过夜，煮沸法小量提取质粒。EcoR I和Sal I双酶切检验阳性克隆质粒，结 果见图2， Ml和M2为DNA分子量标准；S为酶切的质粒样品，其中两条带分别为载体和 插入目的片段。测序鉴定表明插入序列正确(见图3)。 3.融合多肽GST-Mcfp-1-12的诱导表达及纯化
1) 将上述pGEX-4T载体重组的质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布于含氨苄 青霉素100 pg/ml的LB平板培养板，并在37。C恒温培养箱中培养16 h;
2) 挑取单克隆菌株到含氨卞青霉素100pg/ml的LB培养基中，37'C摇床培养过夜；
3) 将培养的菌液用含氨卞青霉素lOOpg/ml的液体LB培养基按1:100的比例稀释，37°C 摇床培养至OD6oo为0.6 —1.0;
4) 加入终浓度为l.OmM的IPTG， 3CTC诱导5 h;
5) 将诱导的菌液转入离心管中，4°C， 8000g离心10min;
6) 去上清，将沉淀置于冰上，加入适量PBS(NaCl 140mM， KC12.7mM, Na2HP04 10mM， KH2P04 1.8 mM)洗涤沉淀，8000 g离心10 min，洗2次；
7) 去上清，将沉淀置于冰上，用冰预冷的PBS-T(PBS中加入1% Triton)重悬浮沉淀；
8) 工作频率小于200 Hz超声波破碎，每超声5 s间隔停止5 s，至菌液澄清；
9) 将超声波破碎产物置于冰上15min;
10) 4'C， 12000 g离心15min;
11) 将上清液转入另一离心管中，加入适量谷光苷肽琼脂糖珠；
12) 4。C混匀3 h左右后，4°C 500 g离心5 min;
13) 去上清，PBS洗涤沉淀3次，每次洗涤后4°C 500 g离心5 min，最后一次洗涤后吸 净PBS;
14) 加入1 ml洗脱液(0.154 g还原型谷光苷肽溶解在50 ml 50 mM的Tris-HCl (pH 8.0))， 室温下轻摇10min洗脱；
15) 4°C, 500 g离心5min，将洗脱液移入另一管中；同样洗脱3次，合并洗脱液，即 为表达纯化的GST-Mcfp-1-12多肽产物。
4. GST-Mcfp-1-12多肽产物的酶切和修饰
1) 用凝血酶(Thrombin, Sigma, T4648)按0.5 NIH UNIT/nmol多肽将GST-Mcfp-1-12多 肽产物在25。C酶切16—20 h;然后将酶切体系于4。C 12000 rpm离心60 min，去上清，PBS 洗涤沉淀两次，离心得到白色沉淀，用5%醋酸溶解，即得到Mcfp-l-12多肽溶液。
2) 将Mcfp-1-12多肽溶液稀释至1.44 mg/ml，加入酪氨酸酶(Tyrosinase mushroom, Sigma, T3824)至终浓度为10 UNIT/ml， 25'C反应6 h。即得到厚壳贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂 Mcfp隱l-12。
实施例2:在潮湿的环境中粘合剂Mcfp-1-12在不同材料表面的粘附 在清洗干净的塑料、玻璃、金属钛和铝材料表面各滴加10 pl浓度为1.44 mg/ml的粘合 剂Mcfp-1-12,同时滴加相同浓度的小牛血清白蛋白(BSA, bovine serum albumin)、没有进行 凝血酶酶切的融合多肽GST-Mcfp-1-12和CELL-TAK分别做阴性和阳性对照，另外还将该组 实验所加蛋白分别进行酪氨酸修饰和未修饰的两组蛋白进行对照。在潮湿的环境，25'C的条 件下放置12h，取出干燥后，用蒸馏水流水冲洗2h;然后考马斯亮兰染色，如图4所示，结 果表明在玻片A和金属钛C，粘合剂Mcfp-l-12与CELL-TAK的粘附能力类似，而在塑料培 养皿D和金属铝B,粘合剂Mcfp-1-12具有比CELL-TAK更强的粘附能力。 实施例3:粘合剂Mcfp-1-I2在硅金片上吸附量的测定
将浓度为1.44 mg/ml的粘合剂Mcfp-1-12 5 |il滴加到Pico EQCM石英晶片(欧特莱(天津) 科学仪器技术有限公司)表面，同时滴加相同浓度的BSA、没有进行凝血酶酶切的融合多肽GST-Mcfp-1-12和CELL-TAK分别做阴性和阳性对照，另外还将该组实验所加蛋白分别进行 酪氨酸修饰和未修饰的两组蛋白进行对照。在潮湿的环境，25。C的条件下放置12h,取出干 燥后，用蒸馏水流水冲洗2h;真空干燥后，用QCM仪测定其频率变化，得到其粘附量的值。 如图5，结果表明粘合剂Mcfp-1-12具有比其它对照组更强的粘附能力。 实施例4:粘合剂Mcfp-1-12粘接实验室塑料耗材
在实验室耗材塑料培养皿上滴加1.44 pg/^L的粘合剂Mcfp-1-12 4 nl，将白色塑料枪头放 置于该多肽点上，同时用BSA和未修饰的Mcfp-l-12多肽作为对照。在潮湿的环境，25'C的 条件下放置12h。如图6，结果表明粘合剂Mcfp-l-12将塑料培养皿与枪头粘合在一起，未进 行修饰的Mcfp-l-12也能粘合培养皿和枪头，但很易脱落，BSA未能进行该粘合。
实施例5:粘合剂Mcfp-l-12粘接小鼠股骨
取小鼠股骨3根，折断，分别在3根股骨的断面上滴加浓度为1.44 pg 1的粘合剂 Mcfp-1-12、未修饰的Mcfp-1-12多肽和BSA各8 nl，在潮湿的环境，25。C的条件下放置12 h。 见图7，结果粘合剂Mcfp-l-12将断开的小鼠股骨粘接在一起，未进行修饰的Mcfp-l-12也能 粘接断裂的股骨，但很容易再次断开，BSA未能进行该粘接。
实施例6:粘合剂Mcfp-1-12在短时间内粘附细胞
将玻片洗净，滴加5pll.44ng/nl的粘合剂Mcfp-l-12，超净台中干燥，然后用PBS洗两 次。将Hela细胞消化打散后低速离心，去上清，用PBS洗两次，然后用无血清的DMEM培 养基重悬细胞，计数，将细胞稀释到浓度为5xl(^个/ml，种入放有上述处理玻片的细胞培养 皿里，37匸培养lh后，将玻片取出，用PBS洗涤5遍，在显微镜下观察细胞粘附情况。见 图8，结果显示有粘合剂Mcfp-l-12包被的区域吸附了大量细胞，而未经处理的空白玻片上几 乎没有粘附细胞。
实施例7:粘合剂Mcfp-1-12的细胞毒性分析
在4个96孔细胞培养板上每孔滴加4 pi 1.44 pg/^il的粘合剂Mcfp-1-12，超净台中干燥， 然后用PBS洗2次，粘合剂包被与空白对照分别用4个孔的重复实验。按实施例6中同样处 理Hela细胞和293T细胞，加入细胞的量分别为5 x 1(^个/ml和1 x 10"个/ml浓度的100 |il 细胞液，分别培养12h、 24 h、 36h和48h，加入5 mg/ml的MTT 15 pl， 37。C培养4h，吸 去含有MTT的培养基，加入150plDMSO，室温下避光摇动1 h，然后置于酶标仪读取波长 为490 nm的吸光度值。如图9和10,结果表明粘合剂Mcfp-1-12无细胞毒性。序列表
引物序列如下
弓1华勿F: 5 ， -ccgaattctataaacctaagaaaacttatcc -3 ，， 弓i #1 R: 5 ， - atgtcgacttacgttggtggatagcgtatc -3 ，；
DNA片段(360 bp)序列如下 Tataaacctaagaaaacttatcctccaacatataaaccgaagataagttatccaccaacgtataaaacaaagccaagttatccagcatcttat 3肌cgte3gaca3gttatcctcc33catateaaccteagata3gttatccttc33cttataaagca肌gcca3gttatccaccaacgtata3gc caaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacgtataaaccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaaccta agatacgctatccaccaacgtataaaccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacg 编码的氨基酸(l20 aa)序列为YKPKKTYPPTYKPKISYPPTYKTKPSYPASYKRKTSYPP
KPKPSYASSYKPKIRYPPT
权利要求
1. 一种海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备方法，其特征在于其具体步骤如下1)从活的厚壳贻贝足部提取总RNA，反转录成cDNA；2)根据厚壳贻贝M.coruscus的Mcfp-1基因(序列来自Genbank No.D63777)序列中编码Mcfp-1氨基酸序列从第692位到第811位氨基酸残基(序列来自Genbank No.Q25434)的12个连续的十肽重复序列的DNA片段设计PCR引物，在前向引物和反向引物末端分别设有EcoR I和SalI酶切位点，引物序列如下引物F5’-ccgaattctataaacctaagaaaacttatcc-3’，引物R5’-atgtcgacttacgttggtggatagcgtatc-3’；3)以步骤1)提取的cDNA为模板，用引物F和引物R进行PCR扩增，获得厚壳贻贝M.coruscus的Mcfp-1基因中编码Mcfp-1氨基酸序列从第692位到第811位氨基酸残基的12个连续的十肽重复序列的DNA片段产物；其DNA片段(360bp)序列如下Tataaacctaagaaaacttatcctccaacatataaaccgaagataagttatccaccaacgtataaaacaaagccaagttatccagcatcttataaacgtaagacaagttatcctccaacatataaacctaagataagttatccttcaacttataaagcaaagccaagttatccaccaacgtataagccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacgtataaaccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacgtataaaccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacg编码的氨基酸(120aa)序列为YKPKKTYPPTYKPKISYPPTYKTKPSYPASYKRKTSYPPTYKPKISYPSTYKAKPSYPPTYKPKPSYASSYKPKIRYPPTYKPKPSYASSYKPKIRYPPTYKPKPSYASSYKPKIRYPPT4)将PCR获得的DNA片段经克隆载体pMD18-T克隆，再切出连接到原核表达载体pGEX-4T中构建重组质粒；5)将构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21菌株中，通过IPTG诱导，表达出融合有GST的Mcfp-1第692位到811位氨基酸残基的多肽产物，标记为GST-Mcfp-1-12；6)用谷胱甘肽—琼脂糖树脂纯化该多肽产物；7)用凝血酶切除融合的GST，离心得到不溶性Mcfp-1功能肽段产物沉淀；8)最后用酪氨酸酶对纯化的多肽产物进行修饰，即得到厚壳贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂，命名为Mcfp-1-12。
全文摘要
一种海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备方法，涉及一种生物粘合剂。提供一种通过生物基因工程方法制备具有可降解性和防水性，且生物相容性好的海洋贻贝-厚壳贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的方法。从活的厚壳贻贝足部提取总RNA，反转录成cDNA，根据厚壳贻贝的Mcfp-1基因序列设计PCR引物，经PCR扩增，将获得的DNA片段连接到原核表达载体pGEX-4T中构建重组质粒，再转化到大肠杆菌BL21菌株中，最后将表达的多肽产物纯化、修饰。制备方法简单，表达产物为可溶性，易于纯化，成本低，与CELL-TAK^TM细胞和组织粘附剂相比有类似或者更好的效果，未发现细胞毒性。符合科研需要，可作为生物医用材料。
文档编号C12N15/12GK101429508SQ20071014402
公开日2009年5月13日 申请日期2007年12月13日 优先权日2007年12月13日
发明者刘加鹏, 张其清, 金利华 申请人:厦门大学