专利名称：一种贻贝肉蛋白抗氧化肽及其制备方法
技术领域：
本发明涉及到蛋白抗氧化肽，具体指一种贻贝肉蛋白抗氧化肽及其制备方法。
背景技术：
抗氧化剂是一类可以减弱或者祛除自由基对人体损害和保护食品免受氧化损伤变质的一类物质，主要分为天然和化学合成两种类型。目前，以丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)和特丁基对苯二酚(TBHQ)为代表的化学合成抗氧化剂由于价格相对便宜、抗氧化活性好，从而被广泛地应用到食品工业中。但是，现有研究表明化学合成抗氧化剂在不同程度上对人体的肝脏、肾脏等器官均有不利影响。因此，化学合成抗氧化剂的应用受到了较大影响，部分发达国家已限量或禁止使用对人体有毒副作用的化学合成抗氧化齐U。因此，寻找高效、安全的天然抗氧化剂替代化学合成抗氧化剂成为研究热点。贻贝属软体动物门、瓣鳃纲、贻贝目、贻贝科，贻贝属，是海产双壳贝类，俗称青口、海红，素有“海中鸡蛋”之称，其蛋白质含有人体需要的缬氨酸、亮氨酸等8种必需氨基酸，且含量远高于鸡蛋、鸡、鸭、鱼、虾和肉类。已有研究表明，贻贝提取物或贻贝肉酶解物具有抗肿瘤、降血脂、抗凝血、降血压、抗氧化、提高免疫力等活性功能，专利号为ZL200510110096.8的中国发明专利公开了一种《厚壳贻贝的提取物、制造方法及其用途》，其是利用厚壳贻贝的提取物在抗流感和抗SARS病毒方面的应用；专利号为ZL200510024391.1的中国发明专利公开了《一种可提高免疫力功能的厚壳贻贝提取物》，其是关于厚壳贻贝的提取物在免疫调节方面的应用；申请号为201010296130.6的中国发明专利申请公开了一种《抗前列腺癌贻贝酶解提取物的制备方法及应用》，其是利用贻贝肉碱性蛋白酶(Alcalase)酶解提取物对前列腺癌细胞具有良好的增殖抑制作用。以上专利对贻贝的精深加工和活性开发具有重要意义。但是以上专利所提到的活性物质多为粗提取物或总酶解物，成分复杂，质量控制难度较大，从而在应用中受到多个方面的限制
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种能够清除自由基和抑制脂质过氧化作用的贻贝肉蛋白抗氧化肽，其可作为药品、保健食品和食品的安全添加剂。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种贻贝肉蛋白抗氧化肽的制备方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:该贻贝肉蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽为五肽化合物，氨基酸序列为YPPAK(Tyr-Pr0-Pr0-Ala-Lys)，ES1-MS检测给出分子离子峰m/z[M+H]+575.26。上述贻贝肉蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括下述步骤:I)将洗净、去壳的贻贝肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，然后按照料液比lg:2 4mL加入异丙醇，于30 35°C中脱脂20 24h，然后于2 6 °C、400(T5000rpm离心l(Tl5min除去异丙醇，收集脱脂贻贝肉固形物；
2)所述脱脂贻贝肉固形物按固液比lg:2(T25mL加入浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，调节PH为6.5 7.5，得到混合液；3)将所述混合液温度升至55 65°C搅拌预热l(Tl5min，以所述脱脂贻贝肉固形物的质量为基准加入2.(Γ4.0%的蛋白酶，在55 65°C酶解2 4h，得到酶解产物；4)将步骤3)所得的酶解产物升温至95 100°C后恒温保持ClOmin后，冷却至2(T25°C，然后离心，得到酶解液；5)将上述酶解液加入0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，使其浓度为2(T25mg/mL，按照大孔树脂重量与酶解液体积lg:4(T50mL的比例将酶解液加入到大孔树脂层析柱中，然后用纯度为45 55%的乙醇进行洗脱，最后在温度40°C以下，真空度-0.1MPa以下旋蒸除去乙醇，浓缩液进行冷冻干燥，得脱盐酶解物干粉；6)将上述脱盐酶解物干粉溶于pH为6.8 7.2的0.04 0.06mol/L的磷酸盐缓冲液中配成浓度为8 12mg/mL的溶液，于0.Γθ.15MPa的工作压力和2(T25°C的工作温度下采用超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于IkDa部分，得到超滤酶解液，超滤酶解液冻干后，得超滤酶解液冻干粉；7)将上述超滤酶解液冻干粉用pH为6.8 7.2的0.04 0.06mol/L的磷酸盐缓冲液配成浓度为8 12mg/mL的溶液，加入到阴离子交换树脂柱，然后分别用水、0.1mol/L、0.5mol/L和1.0mol/L NaCl溶液进行洗脱，每5mL洗脱液收集I试管，并根据每试管洗脱液在280nm下的吸光度绘制洗脱组分曲线图，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为离子交换酶解液，冻干，得干粉；将所述离子交换酶解液冻干粉末用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)配成10mg/mL的溶液,加入到凝胶层析柱中，用磷酸盐缓冲液(0.05mol/L, pH7.0)进行洗脱，每5mL洗脱液收集I试管，并根据每试管洗脱液在280nm下的吸光度绘制洗脱组分曲线图，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶制备酶解物，冻干，得干粉；将上述凝胶 制备酶解物冻干粉末用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(ρΗ7.0)配成IOmg/HiL的溶液，用反相高效液相色谱进行纯化，按照280nm下的吸光度曲线和抗氧化活性收集活性最高的多肽，即得高活性抗氧化肽YPPAK(Tyr-Pr0-Pr0-Ala-Lys)。较好的，所述的贻贝肉为紫贻贝肉。较好的，步骤3)中所述的蛋白酶为中性蛋白酶，酶活力> 2.0X105U/g。优选所用的大孔树脂为D101，阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所用的凝胶为葡聚糖凝胶G-25 ;所述反相高效液相色谱条件为:进样量20 μ L ;色谱柱为Zorbax C18(250mmX4.6mm，5ym);柱温为30°C ;流动相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈(含0.1%三氟乙酸)；梯度洗脱:0 55min乙腈浓度从O至50%,每5min增加5% ;洗脱速度1.0mL/min ；紫外检测波长为280nm。与现有技术相比，本发明所提供的贻贝肉蛋白抗氧化肽对DPPH自由基(EC502.62mg/mL)、羟基自由基(EC500.228mg/mL)和超氧阴离子自由基(EC500.072mg/mL)具有良好的清除作用；同时，YPPAK亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)可以作为药品、保健食品和食品的添加剂，且具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点。该贻贝肉蛋白抗氧化肽制备工艺科学合理，选用中性蛋白酶(neutrase )作为酶解用酶经济实惠，通过生物酶解法同时融合大孔树脂脱盐、超滤分级和色谱精制，酶解过程易监控，同时制得的抗氧化肽具有较高的活性。
图1葡聚糖凝胶G-25制备酶解物的RP-HPLC分析。图2YPPAK (Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)的质谱图。图3YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)的 DPPH 自由基清除活性。图4YPPAK (Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)的羟基自由基清除活性。图5YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)的超氧阴离子自由基清除活性。图6YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)的脂质过氧化抑制活性。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。贻贝肉蛋白抗氧化肽的制备方法，制备工艺流程如下:贻贝肉一脱脂一酶解一酶解物一大孔树脂脱盐一超滤一离子交换层析一凝胶过滤层析一高效液相色谱制备一抗氧化肽。具体步骤为:I)将洗净、去壳的紫贻贝肉用高速组织捣碎机将其处理成匀浆，然后按照料液比lg:3mL加入异丙醇于30 35°C脱脂 24h,于4°C、5000rpm离心15min除去异丙醇,收集固形物。2)脱脂贻贝肉固形物按固液比lg:25mL加入0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0),
得混合液；3)将混合液温度升至60°C搅拌预热lOmin，按照脱脂贻贝肉固形物质量的3%加入中性蛋白酶(neutrase)，酶解温度为60°C，酶解时间3h，得酶解产物；4)将步骤3)所得的酶解产物进行灭酶处理:①灭酶:酶解产物升温至9(T95°C，并于此温度保持IOmin后，冷却至2(T25°C，然后与5000rpm离心15min,得酶解液；②脱盐:将酶解液中加入0.05mol/L磷酸盐缓冲液，使其浓度为20mg/mL，按照大孔树脂重量与酶解液体积lg:50mL的比例将酶解液加入到大孔树脂层析柱中，然后用纯度为50%的乙醇进行洗脱，至洗脱液在280nm下吸光度小于0.05，最后在温度40°C以下，真空度-0.1MPa以下旋蒸除去洗脱液中的乙醇，剩余溶液冷冻干燥，得脱盐酶解物干粉；③超滤:将上述脱盐酶解物干粉溶于0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)配成浓度为10mg/mL的溶液，于0.Γθ.15MPa的工作压力和2(T25°C的工作温度下采用超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于IkDa部分，得超滤酶解液，将其冻干，得超滤酶解液冻干粉；④阴离子交换层析:将上述超滤酶解液冻干粉用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.0)配成10mg/mL的溶液，经过DEAE-52纤维素阴离子交换树脂分离，分别用水、
0.1mol/L,0.5mol/L和1.0mol/L NaCl溶液进行洗脱，每5mL洗脱液收集I试管，并根据每试管洗脱液在280nm下的吸光度绘制洗脱组分曲线图，每一色谱峰为一组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为离子交换酶解液，将其冻干，得离子交换酶解液冻干粉；
⑤凝胶色谱层析:将上述离子交换酶解液冻干粉用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)配成浓度为10mg/mL的溶液,经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离,用5倍柱体积磷酸盐缓冲液进行洗脱，每5mL洗脱液收集I试管，并根据每试管洗脱液在280nm下的吸光度绘制洗脱组分曲线图，每一色谱峰为一组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶制备酶解物，将其冻干，得凝胶制备酶解物冻干粉。⑥高效液相色谱精制:将上述凝胶制备酶解物冻干粉用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)配成浓度为10mg/mL的溶液，用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化；条件:进样量 20 μ L ;色谱柱为 Zorbax C18 (250mmX4.6mm, 5 μ m ;柱温为 30°C ;流动相:A 水(含 0.1%三氟乙酸)和B乙腈(含0.1%三氟乙酸)；梯度洗脱:0-55min乙腈浓度从O至50%，每5min增加5% ;洗脱速度1.0mL/min ;紫外线检测波长280nm，根据280nm下的吸光度曲线和抗氧化活性得I个高活性抗氧化肽。⑦结构检测:收集活性最高的I个抗氧化肽，经反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测为单一峰(图1)，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为YPPAK (Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)，ES1-MS 检测给出分子离子峰 m/z [M+H] +575.26 (图 2)。将制得的贻贝肉蛋白抗氧化肽YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)进行DPPH自由基清除实验，试验结果见图3 ;进行羟基自由基清除实验，试验结果见图4 ;进行超氧阴离子自由基清除实验，试验结果见图5 ;进行脂质过氧化抑制实验，试验结果见图6。由图3至图6的实验结果可以得知=YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)对DPPH自由基(EC502.62mg/mL)、羟基自由基(EC500.228mg/mL)和超氧阴离子自由基(EC500.072mg/mL)具有良好的清除作用；同时，YPPAK亦`显示出良好的脂质过氧化抑制作用。
权利要求
1.一种贻贝肉蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽为五肽化合物，氨基酸序列为YPPAK (Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)，ES1-MS 检测给出分子离子峰 m/z [M+H]+575.26。
2.如权利要求1所述的贻贝肉蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括下述步骤: 1)将洗净、去壳的贻贝肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，然后按照料液比lg:2 4mL加入异丙醇，于30 35°C中脱脂20 24h，然后于2 6°C、400(T5000rpm离心l(Tl5min除去异丙醇，收集脱脂贻贝肉固形物； 2)所述脱脂贻贝肉固形物按固液比lg:2(T25mL加入0.05mol/L磷酸盐缓冲液，调节pH为6.5 7.5，得到混合 液； 3)将所述混合液温度升至55飞5°C搅拌预热l(Tl5min，以所述脱脂贻贝肉固形物的质量为基准加入2.(Γ4.0%的蛋白酶，在55 65°C酶解2 4h，得到酶解产物； 4)将步骤3)所得的酶解产物升温至95 100°C后恒温ClOmin后，冷却至2(T25°C，然后离心，得到酶解液； 5)将上述酶解液加入0.05mol/L磷酸盐缓冲液，使其浓度为2(T25mg/mL，按照大孔树脂重量与酶解液体积lg: 4(T50mL的比例将酶解液加入到大孔树脂层析柱中，然后用纯度为45 55%的乙醇进行洗脱，最后在温度40°C以下，真空度-0.1MPa以下旋蒸除去乙醇，浓缩液进行冷冻干燥，得脱盐酶解物干粉； 6)将上述脱盐酶解物干粉溶于pH为6.8 7.2的0.04 0.06mol/L的磷酸盐缓冲液中配成浓度为8 12mg/mL的溶液，于0.Γθ.15MPa的工作压力和2(T25°C的工作温度下采用超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于IkDa部分，得到超滤酶解液，超滤酶解液冻干后，得到冻干粉末； 7)将上述冻干粉末用pH为6.8 7.2的0.04 0.06mol/L的磷酸盐缓冲液配成浓度为8 12mg/mL的溶液，加入到阴离子交换树脂柱，然后分别用水、0.1mol/L、0.5mol/L和1.0mol/L NaCl溶液进行洗脱，每5mL洗脱液收集I试管，并根据每试管洗脱液在280nm下的吸光度绘制洗脱组分曲线图，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为离子交换酶解液，冻干，得干粉；将所述离子交换酶解液冻干粉末用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)配成10mg/mL的溶液,加入到凝胶层析柱中，用磷酸盐缓冲液(0.05mol/L, pH7.0)进行洗脱,每5mL洗脱液收集I试管，并根据每试管洗脱液在280nm下的吸光度绘制洗脱组分曲线图，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶制备酶解物，冻干，得干粉； 将上述凝胶制备酶解物冻干粉末用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)配成10mg/mL的溶液，用反相高效液相色谱进行纯化，按照280nm下的吸光度曲线和抗氧化活性收集活性最高的多肽，即得高活性抗氧化肽YPPAK(Tyr-Pr0-Pr0-Ala-Lys)。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤I)中所述的贻贝肉为紫贻贝肉。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤3)中所述的蛋白酶为中性蛋白酶，酶活力≥2.0X105U/g。
5.根据权利要求2所述的层析方法，其特征在于所用的大孔树脂为D101，阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所用的凝胶为葡聚糖凝胶G-25 ;所述反相高效液相色谱条件为:进样量20 μ L ;色谱柱为Zorbax C18 (250_X4.6_，5 μ m);柱温为30°C ;流动相:Α水(含.0.1%三氟乙酸)和B乙腈(含0.1%三氟乙酸)；梯度洗脱:(T55min乙腈浓度从O至50%，每5min增加5% ;洗脱速度1.0mL/min ;紫外检测波长为280nm。
全文摘要
本发明涉及一种贻贝肉蛋白抗氧化肽及其制备方法，其特征在于该抗氧化肽为五肽化合物，氨基酸序列为YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)，ESI-MS检测给出分子离子峰m/z[M+H]+575.26。制备方法包括步骤匀浆、脱脂、混合、酶解、脱盐、超滤和层析等步骤。制备得到的高活性抗氧化肽YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用。YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品或食品添加剂等。
文档编号C07K7/06GK103204906SQ201310035469
公开日2013年7月17日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者王斌, 马佳卉, 栗丽, 罗红宇 申请人:浙江海洋学院