专利名称：一种以翡翠贻贝粘附蛋白制备生物粘合剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物粘合剂，尤其是涉及一种从翡翠贻贝提取粘附蛋白制备防水生物粘 合剂的方法。
背景技术：
海洋贻贝属于软体动物门瓣鳃纲，是沿岸和近海中普遍存在的一种生物，其足丝腺能分 泌足丝附着在坚硬的基体上，使它们能在巨浪冲刷下仍紧紧附着于礁石而不分离。这种足丝 粘胶的主要成分足丝粘附蛋白具有高强度、高韧性和防水性。目前已有美国BD Bioscience 公司从紫贻贝(M卯7^e^嗣的足部提取到粘附蛋白，用作细胞和组织粘附剂，该产品已商业 化，名称和货号分别为BD CELL-TAKTM CELL AND TISSUE ADHESIVE, Catalog No. 354240， 354241。该产品可涂覆用于细胞培养和组织切片等的玻片、塑料或金属表面以增强 与样品的粘附。但紫贻贝分泌粘附蛋白的量极少，从大约10000个贻贝中也仅能提取到lmg 的粘附蛋白，因此由此获得的粘附蛋白产品CELL-TAKTM价格十分昂贵，很难满足需要。
已有文献报道用基因工程手段表达重组的粘附蛋白用作生物粘合剂，他们用原核表达载 体pTrcHisA重组紫贻贝(MW/2^ga〃叩rav/"c/flfc)的Mgfy-3A、 Mgfp-5以及Mgfp-5与Mgfp-1 的十肽重复序列融合蛋白，结果表明表达的重组蛋白具有较好的粘附功能(1 、 Hwang DS, Gim Y, Cha HJ. Expression of functional recombinant mussel adhesive protein type 3A in Escherichia coli[J]. Biotechnol Prog， 2005, 21 (3): 965-970; 2、 Hwang DS, Gim Y, Kang DG, et al. Recombinant mussel adhesive protein Mgfp-5 as cell adhesion biomaterial[J]. J Biotechnology, 2007， 127 (4): 727—735; 3、 Hwang DS, Gim Y, Yoo HJ, et al. Practical recombinant hybrid mussel bioadhesive fp-151[J] .Biomaterials, 2007， 28(24): 3560-3568)
发明内容
本发明的目的在于提供一种从原料来源广泛、价格低廉的翡翠贻贝(P wW^fo)中提取粘附 蛋白，低成本制备具有良好生物相容性的防水生物粘合剂的方法。 本发明的具体步骤如下
1.取活的翡翠贻贝足部，用一5 0'C的PBS冲洗后，在一5 0'C的含蛋白酶抑制剂的 5%醋酸溶液中切碎，得切碎混合液；2. 用分散机/均质器将上述切碎混合液在冰上匀浆，得组织匀浆液；
3. 将组织匀浆液离心，取上清S1，记录体积V1，弃沉淀；
4. 将上清S1冰浴，加入60y。高氯酸(PCA)至终浓度为1%;
5. 温和搅拌20 40 min后离心，回收上清S2，记录体积V2;
6. 将上清S2在-10 -20'C的冰乙醇中冷却，搅拌时加入浓硫酸酸化，至终浓度为0. 3 M;
7. 向混合液中加入两倍体积的预冷的-82 -86'C丙酮；
8. 静置20 30min后离心，弃上清，取沉淀溶于5%乙酸中，再离心，取上清液，冻干；
9. 用5%冰醋酸溶液重新溶解冻干产物，离心去沉淀，将上清浓度调整到蛋白浓度为1.44 mg/ml，即得到一种以翡翠贻贝粘附蛋白制备生物粘合剂(Pvf^)。
所述的蛋白酶抑制剂为胃酶抑素A、亮肽酶素或苯甲基磺酸氟(PMSF)。 本发明通过从盛产于我国东南沿海的翡翠贻贝中快速获得粘附蛋白防水生物粘合剂。用 该方法制备的翡翠贻贝生物粘合剂具有产量高，成本低廉，粘附效果好等特点。在制备过程 中，仅在提取初期需要微量的胃酶抑素A、亮肽酶素和PMSF，其余的试剂均为常规化学试 剂，配制方便，价格低廉，制备操作便捷。所制备的粘附蛋白防水生物粘合剂能在潮湿的环 境下粘附在玻璃、金属钛、塑料表面并且流水冲洗2 h也不掉，能在短时间内粘附细胞，与 CELL-TAKTM细胞和组织粘附剂相比有更好的效果，没有发现细胞毒性。在潮湿的环境下， 几微克的微量粘附蛋白防水生物粘合剂就能粘接塑料和小鼠股骨。所得防水粘合剂作为生物 医用材料生物粘合剂在临床使用具有广泛的应用前景。
图1为实施例2中在潮湿的环境中翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合剂(Pvfp)在玻璃a、金属钛
表面b、塑料c粘附后流水冲洗2h后考马斯亮兰染色图。
图2为实施例3中翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合剂(Pvfp)粘接效果示意图。
图3为实施例4中翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合剂(Pvfp)粘接小鼠股骨效果示意图。
图4为实施例5中翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合齐'J(Pvfp)在1 h内粘附细胞的结果示意图。
图5为实施例6翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合剂(Pvfp)的细胞毒性分析图。a为293Tcel1，
b为Hela cell。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1:翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合剂(Pvfp)的制备
1、翡翠贻贝足部获得及匀浆:取壳长13 14 cm活的翡翠贻贝，切取其足部，称取鲜重为30 g的足，在冰预冷的PBS中清洗后，放入含0.5%甲醇的胃酶抑素A(中国Solarbio公司) 30 u M、亮肽酶素(美国Amersco公司)30 u M和PMSF (美国BBI公司)1 mM的冰预冷的 180 ml 5%醋酸中，用T18 basic (德国IKA公司)组织分散机在冰上匀浆2 min，将匀浆液倒入 离心管中，20000g， 4。C离心60 min;
2、 蛋白酸化:离心后弃沉淀，取上清S1，并记录体积V1，将上清Sl在冰上放置预冷， 同时缓慢加入60%高氯酸(PCA)至终浓度l%(V6。％PCA=Vl/59 ml)， 温和搅拌30 min后， 20000 g， 4'C离心60min，回收上清S2，记录体积V2，转移上清S2至烧杯中(〉500 ml)，在 冰乙醇(一15。C)中冷却，并在磁力搅拌器上搅拌，搅拌时加入浓硫酸酸化，至终浓度0.3M (V 浓硫酸二V2X 0.0168);
3、 丙酮沉淀蛋白用200 ml分液漏斗向混合液中逐滴加入预冷的丙酮(一85'C) (V丙酮 =V2X2)， 静置20 min后20000 g, 4'C离心60min，弃上清，取沉淀(粘稠似桨糊组织， 附有很薄外层)，溶于4 ml 5%乙酸中，20000 g， 4。C离心60 min,取上清液冻干；
4、 冻干产物用5%冰醋酸溶解，1000 g， 4'C离心15min，去沉淀，上清用5%冰醋酸溶 液调整蛋白溶液浓度为1.44mg/ml，即得到翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合齐lJ(Pvfp)。
实施例2:在潮湿的环境中翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合剂(Pvfp)在不同材料表面的粘附 在清洗干净的塑料、玻璃、金属钛等材料表面各滴加10 nl浓度为1.44 mg/ml的翡翠贻 贝生物粘合剂，同时滴加相同浓度的小牛血清白蛋白(BSA， bovine serum albumin)和 CELL-TAKTM分别做阴性和阳性对照，在潮湿的环境，25"C的条件下放置12 h，取出后干燥， 用蒸馏水流水冲洗2h，然后用考马斯亮兰R250染色，如图1所示，结果表明在玻片a和钛 材料b表面，翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合靴Pvfp)与CELL-TAKTM的粘附能力类似，而在塑 料培养皿c表面，翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合剂(Pv粉具有比CELL-TAKTM更强的粘附能力。 实施例3:翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合剂(Pvfp)粘接实验室塑料耗材 在实验室耗材塑料培养皿上滴加1.44pg L的翡翠贻贝生物粘合剂4pl，将白色塑料枪 头放置于该蛋白点上，同时用BSA作为阴性对照。在潮湿的环境，25'C的条件下放置12h。 结果见图2，翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合剂(Pvfp)将塑料培养皿与枪头粘合在一起，BSA未 能进行该粘合。
实施例4:翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合剂(Pvfp)粘接小鼠股骨
取小鼠股骨两根，折断，分别在两根股骨的断面上滴加浓度为1.44 jag/nl的翡翠贻贝生 物粘合剂和BSA各8pl，在潮湿的环境，25'C的条件下放置12 h。结果见图3，图中显示翡 翠贻贝生物粘合剂将断开的小鼠股骨粘接在一起，而BSA未能进行该粘接。实施例5:翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合剂(Pvfp)在短时间内粘附细胞
将玻片洗净，滴加5 pl 1.44 pg4d的翡翠贻贝生物粘合剂，超净台中干燥，然后用PBS 洗两次。将Hela细胞消化打散后低速离心，去上清，用PBS洗两次，然后用无血清的DMEM 培养基重悬细胞，计数，将细胞稀释到浓度为5xl(^个/ml，种入放有上述处理玻片的细胞培 养皿里，37'C培养lh后，将玻片取出，用PBS洗涤5遍，在显微镜下观察细胞粘附情况。 如图4所示，结果有翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合剂(Pvfp)包被的区域吸附了大量细胞，而未经 处理的空白玻片上几乎没有粘附细胞。
实施例6:翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合剂(Pvfp)的细胞毒性分析
在4个96孔细胞培养板上每孔滴加4 pl 1.44 pg"l的翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合剂 (Pvfp)，超净台中干燥，用PBS洗2次，粘合剂包被与空白对照分别用4个孔的重复实验。 按实施例5处理Hela细胞和293T细胞，加入细胞量分别为5 x 1()S个/ml和1 x 1(^个/ml浓 度的细胞液100 pl，分别培养12、 24、 36和48 h,加入5 mg/ml的MTT 15 pl， 37。C培养4 h， 吸去含有MTT的培养基，加入150plDMSO，室温下避光摇动1 h，置于酶标仪读取波长为 490nm的吸光度值。见图5，结果未发现翡翠贻贝粘附蛋白生物粘合剂(Pvfp)具有细胞毒性。
权利要求
1. 一种以翡翠贻贝粘附蛋白制备生物粘合剂的方法，其特征在于所述的以翡翠贻贝粘附蛋白制备生物粘合剂的过程如下1)取活的翡翠贻贝足部，用-5～0℃的PBS冲洗后，在-5～0℃的含蛋白酶抑制剂的5％醋酸溶液中切碎；2)用分散机/均质器将上述切碎混合液在冰上匀浆；3)将组织匀浆液离心，取上清S1，记录体积V1，弃沉淀；4)将上清S1冰浴，同时缓慢加入60％高氯酸(PCA)至终浓度1％；5)温和搅拌20～40min后离心，回收上清S2，记录体积V2；6)将上清S2在-10～-20℃的冰乙醇中冷却，并在搅拌时加入浓硫酸酸化，至终浓度0.3M；7)向混合液中逐滴加入两倍体积的预冷的-82～-86℃丙酮；8)静置20～30min后离心，弃上清，取沉淀溶于5％乙酸中，再离心，取上清液，冻干；9)用5％冰醋酸溶液重新溶解冻干产物，离心去沉淀，将上清浓度调整到蛋白浓度为1.44mg/ml，即得到一种以翡翠贻贝粘附蛋白制备生物粘合剂。
2. 如权利要求l所述的一种以翡翠贻贝粘附蛋白制备生物粘合剂的方法，其特征在于所 述的蛋白酶抑制剂为胃酶抑素A、亮肽酶素或苯甲基磺酸氟。
全文摘要
一种以翡翠贻贝粘附蛋白制备生物粘合剂的方法，涉及一种生物粘合剂。提供一种从原料来源广泛、价格低廉的翡翠贻贝(P.viridis)中提取粘附蛋白，低成本制备具有良好生物相容性的防水生物粘合剂的方法。从活的翡翠贻贝上切取其足部，切碎匀浆，经蛋白酸化、丙酮沉淀蛋白、纯化等处理后即得。通过从盛产于我国东南沿海的翡翠贻贝中快速获得粘附蛋白防水生物粘合剂。用该方法制备的翡翠贻贝生物粘合剂具有产量高，成本低廉，粘附效果好等特点。所制备的粘合剂能粘附在玻璃、金属钛、塑料表面，能在短时间内粘附细胞，粘接塑料或小鼠股骨，无细胞毒性。作为生物医用材料生物粘合剂在临床使用具有广泛的应用前景。
文档编号A61L24/10GK101450226SQ20071000996
公开日2009年6月10日 申请日期2007年12月7日 优先权日2007年12月7日
发明者刘加鹏, 张其清, 臻 蒋, 金利华 申请人:厦门大学