[014引大肠杆菌D册a购自艾德莱生物科技有限公司；
[0149] pAN7-l质粒载体来源于中国载体菌株基因储存中屯、度iovector);
[0150] pFGL59 来源于化tionalUniversityofSingapore;
[015。 载体祀ASY购自北京全式金生物技术有限公司；
[0152] D册a感受态购自艾德莱生物科技有限公司；
[0153] PMD18-T、PMD18-TSimple、T4DNA连接酶、限制性内切酶等购自大连宝生物；
[0154] 实施例1
[01巧]将来源于隧尼古下节杆菌（Art虹obacternicotinovorans)的麦芽寡糖基海藻糖 合成酶基因TreY与麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因TreZ融合，得到融合酶基因TreY-TreZ。
[0156] (i)WArt虹obacternicotinovorans基因组DNA为模板，分别设计引物Fl和 Rl(扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶化eY)、F2和R2 (扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶化eZ);
[016dWArt虹obacternicotinovorans基因组为模板，Fl和Rl为引物，通过PCR过程 获得产物TreY;WArt虹obacternicotinovorans基因组为模板，F2和R2为引物，通过PCR 过程获得产物化eZ;
[0162] 所述PCR体系为50y1 :
[016引 2XHiFi-PCRmaster25yl;上游引物Fl2. 5yl;下游引物Rl2. 5yl;模板 2. 5yl;(1地20 17. 5yl;
[0164] 所述PCR程序如下：
[0165] 95°C变性 5min;95°C变性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 2. 5min，共 30 个循环； 72°C延伸lOmin，-20°C保存；
[0166] (ii)将获得的产物TreY和产物TreZ通过重叠PCR方法实现两基因间的拼接，得 到产物TreY-TreZ-I;
[0167] 所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
[016引 95°C预变性5min ;95°C变性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸2. 5min，5个循环；
[0169] 所述的重叠PCR的补充扩增体系为25y1 :
[0170] 上游引物Fl2yl;下游引物R2 2yl!SXhqPCRMasterMix12. 5yl;d地2〇 8. 5yl;
[0171] 所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
[0172] 95°C预变性 5min;94°C变性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 8min，30 个循环； 72°C延伸lOmin，-20°C保存；
[0173] (iii)将融合目的片段与祀ASY-Blunt载体连接，转化大肠杆菌D册a获得质粒 pEASY-TreY-TreZ-1。
[0174] 实施例2
[01巧]W黑曲霉基因组为模板，克隆下游引物引入TreY-TreZ基因的前段序列的Gla5片 段，上游引物引入TreY-TreZ基因的末端序列的Gla3片段，Gla3a同源臂片段W及克隆上游 引物5'端引入黑曲霉GlaA基因分泌信号肤末端序列，下游引物5'端引入黑曲霉GlaA基 因终止子前端序列的TreY-TreZ基因片段，通过重叠PCR延伸拼接Gla5、TreY-TreZ、Gla3 S个片段，连接到T载体上，构建得到pSimple-TreY-heZ质粒载体、pMD-Gla3a质粒载体、 pEASY-Gla5质粒载体。
[0176] (i)根据Genbank中注释的黑曲霉基因序列W及融合TreY-TreZ基因序列，分别设 计黑曲霉glaA位点5'同源臂（Gla5)引物：
[0177] GlaS-F:5' -TCTAGACTCGGCGACTTGGTCTT-3'5' 引入甜al酶切位点
[0178] GlaS-R:5' -ATTTGCCAACCCTGTGC-3'
[0179] 下游重叠引物：
[0180] GlaS-R-I:5' -CGGTGTCAACACCATATTTGCCAACCCTGTGC-3'
[018。 黑曲霉glaA位点3'同源臂（Gla3)引物：
[0182] Gla3-F:5, -ACAATCAATCCATTTCGCTATAGTT-3'
[0183] Gla3-R:5' -ATGGATTGATTGTTCAGCCCAGGTCGACG-3'
[0184] 上游重叠引物：
[0185] Gla3-F-1 :5' -CAGGGTTGGCAAATATGGTGTTGACACCGAAATCGACCTA-3'
[0186] 黑曲霉黑曲霉glaA位点3'同源臂（Gla3a)引物：
[0187] Gla3a-F:5' -AGATCTACAATCAATCCATTTCGCTATAGTT-3' 5' 端引入BglII酶切位点
[018引 Gla3a-R:5' -TCTAGACATAAGGCGGGTTCACATCC-3'5' 端引入甜al酶切位点
[0189] 麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因TreY与麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因TreZ融合酶 基因加重叠延伸序列后引物：（鉴定引物）
[0190] TreY-TreZ-F: 5 > -CAGGGTTGGCAAATATGGTGTTGACACCGAAATCGACCTA-3 '
[0191] TreY-TreZ-R:5' -ATGGATTGATTGTTCAGCCCAGGTCGACG-3'
[0192] 鉴定同源重组所用引物，上游引物位于潮霉素抗性基因hph内，下游引物位于 3'GLA外侧，引物序列如下：
[0193] h地-F: 5，-GACAATGGCCGCATAACAG-3，
[0194] hph-R: 5，-GAAGCCTTGAGCGACGAAT-3，
[0195] (ii)W黑曲霉基因组为模板，用Gla5重叠特异引物（GlaS-F和GlaS-R-I)进 行PCR扩增，扩增得到片段Gla5 ;W黑曲霉基因组为模板，用Gla3重叠引物（Gla3-F-1和 Gla3-R)和Gla3a特异引物（Gla3a-F和Gla3a-R)进行PCR扩增，扩增得到片段Gla3和 Gla3a;WpEASY-TreY-TreZ-1 质粒为模板，用TreY-TreZ重叠特异引物灯reY-TreZ-F和 TreY-TreZ-R)进行PCR扩增，扩增得到片段TreY-TreZ,进行鉴定。
[0196] 所述的PCR扩增体系为50y1 :
[0197]2XTaqPCRMasterMix25U1，TreY-TreZ-F(10Umo1/L) 2.5U1， TreY-TreZ-R(10ymol/L) 2. 5yI，模板 2. 5yI，用d地2〇 补足 50yI;
[0198] 所述的PCR扩增程序如下：
[0199] 95°C预变性 5min;95°C变性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸SminareY-TreZ片 段PCR延伸8min)，30个循环；72°C延伸lOmin，-20°C保存；
[0200] (iii)将步骤（ii)制得的Gla5片段与制得的TreY-TreZ片段进行重叠PCR，制得 GlaS-TreY-TreZ片段；
[020。 所述的重叠PCR的初次扩增体系为25y1 :
[020引GlaS片段 4y1JreY-TreZ片段 4y1!SXhqPCRMasterMix12. 5y1 ;d地20 4. 5y1 ;
[020引所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
[0204] 95°C预变性 5min;94°C变性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 3min，5 个循环；
[0205] 所述的重叠PCR的补充扩增体系为25yI:
[020引 上游引物GlaS-F2y1 ;下游引物TreY-TreZ-R2y1!SXhqPCRMasterMix 12. 5yl;(1地20 8. 5yl;
[0207] 所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
[020引 95°C预变性 5min;95°C变性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 10min，30 个循环； 72°C延伸lOmin，-20°C保存；
[0209] (iv)将步骤（iii)制得的GlaS-TreY-TreZ片段与步骤（ii)制得的Gla3片段进 行重叠PCR，制得Gla5-TreY-TreZ-Gla3 片段；
[0210] 所述的重叠PCR的初次扩增体系为25y1 :
[0引"GlaS-TreY-TreZ片段 4yl;Gla3 片段 4yl!SXhqPCRMasterMix12. 5yl; (1地20 4. 5yI;
[021引所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
[021引 95°C预变性 5min;94°C变性 30sec，59°C退火 30sec，72°C延伸 4min，5 个循环；
[0214] 所述的重叠PCR的补充扩增体系为25y1 :
[021 引 上游引物GlaS-F2yl;下游引物Gla3-R2yl!SXhqPCRMasterMix12. 5yl;(1地20 8. 5yl;
[0216] 所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
[0217] 95°C预变性 5min;95°C变性 30sec，59°C退火 30sec，72°C延伸 12min，30 个循环； 72°C延伸lOmin，-20°C保存；
[0218] (v)pSimple-TreY-TreZ质粒载体构建：
[0219] 将步骤（iv)制得的GlaS-TreY-TreZ-GlaS片段与PMD18-TSimple连接，转化大 肠杆菌D册a，复苏液体培养后，获得重组质粒pSimple-TreY-TreZ;
[0220] 连接体系10y1 :
[022"PMD18-TVector1y1 ;Gla5-TreY-TreZ-Gla3 片段 1y1 ;d地20 3y1;Ligation Mix5Ji1 ;16°C反应 30min连接；
[022引 （vi)pMD-Gla3a质粒载体构建：
[022引在Gla3基因Gla3a上游引物5'端引入一个BglII位点，下游引物5'端引入甜al位点。PCR得到Gla3a片段，回收片段与PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌D册a，复苏液体 培养后获得pMD-Gla3a质粒；
[0224] 连接体系 10y1 :pMD18-TVector1y1 ;Gla3a片段 1y1 ;(1地2〇 3y1;Ligation Mix5yI;16°C反应 30min连接；
[0225] (Vii)pEASY-Gla5 质粒载体构建：
[0226] W黑曲霉基因组为模板，用Gla5特异性引物（Gla5-F和Gla5-R)进行PCR扩增， 在Gla5基因上游引物5'端引入一个甜al位点。PCR扩增得到片段。
[0227] 所述所述PCR体系为50y1 :
[022引 2XHiFi-PCRmaster25y1 ;上游引物GlaS-F2. 5y1 ;下游引物GlaS-R 2. 5y1 ;模板 2. 5y1 ;(1地20 17. 5y1 ;
[0229] 所述PCR程序如下：
[0230] 95°C变性 5min;95°C变性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 2. 5min，共 30 个循环； 72°C延伸lOmin，-20°C保存；
[0231] 将得到的目的片段与祀ASY-Blunt载体连接，转化大肠杆菌D册a获得质粒 pEASY-GlaS；
[0232] 实施例3
[0233] pAN-Gla3a质粒载体的构建：
[0234] 用甜al、BamHI双酶切载体PAN7-1，回收603化P的基因片段，甜al、BglII双酶切 载体pMD-Gla3a，回收1213bp的基因片段，将2片段通过T4连接酶连接度amHI与BglII为 同尾酶且连接之后酶切位点消失），转化大肠杆菌畑5a，复苏液体培养后获得pMD-Gla3a 质粒，构建过程如图1所示；
[023引 连接体系10y1 :T4连接酶1y1 ; 10XT4buffer1y1 ;双酶切质粒pMD-Gla3a后 片段5y1 ;双酶切质粒PAN7-1后片段3y1 ;16°C连接过夜。
[0236] 实施例4
[0237]pEASY-h地质粒载体构建：
[023引 用甜曰1、化01、DraIS酶切载体pAN-Gla3a，回收：M70bp片段。化01、SpeI双酶 切载体祀ASY-GlaS,回收3