专利名称：葡糖苷酸化的对乙酰氨基酚作为肝脏疾病的标志的制作方法
葡糖苷酸化的对乙酰氨基酚作为肝脏疾病的标志相关申请
本申请要求2008年10月1日提交的美国临时专利申请序列号61/194，835的优先权， 其通过引用整体并入本文。政府权益声明
本发明是政府支持进行的，其获美国国立卫生研究院R01DK068039的资助。政府在发明中享有一定的权利。
背景技术：
对乙酰氨基酚(APAP)是最常用的非阿片类镇痛药，与大多数其他类似产品相比是标准的退热及镇痛剂。APAP代谢(绝大部分发生在肝脏中)是良好确定的(图1)。至少给予剂量的1/2与葡糖醛酸(GLUC)结合，1/3与硫酸盐(SULF)结合，主要经由CYP2E1的CYP-450 依赖混合功能氧化酶途径代谢大约5-9%。这引起毒性反应性中间代谢物(NAPQI)的形成， 其进一步与谷胱甘肽结合，形成无毒的半胱氨酸和巯基尿酸结合物。对乙酰氨基酚的推荐剂量的不足5%未改变地由肾脏排出。对乙酰氨基酚经历从体内一级清除(first-order elimination)，且具有短的血浆半衰期(2. 0-2. 4小时)。APAP提供了在药物代谢物从肝脏排出中外排转运体发挥完整功能的很好的实例。 为了从肝脏排出，所有APAP代谢物都需要外排转运(efflux transport)，并且各个都可以在胆汁和尿中检测。体内处置研究与体外功能转运研究显示，ABC转运体ABCC2、ABCC3、 ABCC4和ABCG2各个具有转运多种非偶联或偶联的药物包括APAP代谢物的能力。ABCC2和 ABCG2定位于肝细胞小管(顶)膜，从其中它们将它们的转运底物排出至胆小管中。因此， 在健康肝脏中，APAP的硫酸盐、葡糖醛酸和谷胱甘肽结合物的胆汁排出主要是由ABCC2介导，然而，ABCG2看起来也参与了 APAP-SULF结合物的排出。ABCC3和ABCC4表达在肝细胞和胆管细胞的窦状小管(基底外侧)膜上，从其中ABCC3和ABCC4将它们的底物排出到血液中。APAP-GLUC代谢物由肝细胞通过窦状小管排出主要由ABCC3介导，但ABCC4看起来介导 APAP-SULF代谢物的排出。最近的研究显示ABCC3和ABCC4在APAP-SULF的排出中具有等同的作用。最近研究(Drug. Metabolism and Disposition, 35:1970-1978 (2007))已显示在由甲硫氨酸胆碱缺乏饮食(MCD)饲养大鼠8周引起的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠模型中，肝外排转运体ABCC3和ABCC4的蛋白表达升高。对这些MCD大鼠的大剂量APAP给予(1 mmol/kg )(相当于150磅的人IOg剂量，250磅的人17g剂量)相对于对照产生APAP-GLUC 由胆汁排出向血浆排出的转换。然而，考虑到人没有甲硫氨酸胆碱缺乏，以及给予大鼠模型的大剂量APAP，已推测MCD大鼠对于人NASH或人肝脏药物代谢研究不是一个好的模型。通常接受的是没有动物模型可以精确地概括人NASH。众多的生化差异使得任何直接对比都潜在地充满假象。例如，MCD模型缺乏胰岛素抵抗，其是NASH中常见的组成(Rinella ME和 Green RM, J Hepatol. 2004 Jan ； 40 (1) 47-51.)。而且，脂肪变性在人中发生在典型的西方高脂肪饮食中，导致通过肝脏的脂肪净通量增加，而MCD模型是通过脂代谢的生化损伤引起脂肪变性和脂肪性肝炎。因此，直接将MCD模型和人进行对比是不合适的。这尤其考虑到MCD饮食，因为这种非自然饮食对其变量的影响相对于肝脏损伤对其变量的影响是不能描绘的。
发明内容
第一方面，本发明提供了一种诊断人类肝脏疾病的方法，其包括
(a)对受试人施用对乙酰氨基酚(APAP)后，测定获自受试人的血浆样品和/或尿液样品中对乙酰氨基酚(APAP)-葡糖苷酸的量，其中受试人处于肝脏疾病的风险。(b)将血浆样品和尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量与对照比较；和 (c)如果血浆样品或尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相对于对照升高，
则鉴定受试人患有肝脏疾病。第二方面，本发明提供了鉴定受试人处于药物不良反应的风险的方法，其包括
(a)对受试人施用对乙酰氨基酚(APAP)后，测定获自受试人的血浆样品和/或尿液样品中对乙酰氨基酚(APAP)的量，其中受试人需要治疗性药物的治疗；
(b)将血浆样品和尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量与对照比较；和
(c)如果血浆样品或尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相对于对照升高，则鉴定受试人处于药物不良反应的风险。第三方面，本发明提供了确定受试人治疗性药物的合适剂量的方法，其包括
(a)对受试人施用对乙酰氨基酚(APAP)后，测定获自受试人的血浆样品和/或尿液样品中对乙酰氨基酚(APAP)的量，其中受试人需要治疗性药物的治疗；
(b)将血浆样品和尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量与对照比较；和
(c)如果血浆样品或尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相对于对照升高，则确定受试人应该接受非标准剂量的药物。第四方面，本发明提供了机器可读存储介质，其包含一组指令，用于使代谢物测量装置执行第一、第二、第三实施方式的方法的任何实施方式的测量、比较和鉴定步骤。在本文中提供了本发明这些方面各个的实施方式。
图1是显示了对乙酰氨基酚代谢的流程图。图2提供了显示患有NAFLD的人中肝脏ABCC3和ABCC4表达的放射自显影图。图3A - B (A)显示ABCC2蛋白定位在健康正常患者肝中的小管膜非常褶皱的边缘(A)，但在NASH肝中，ABCC2明显地嵌入(blurred into)远离小管的膜泡中(B)。图4显示了 4h血浆中APAP及其主要代谢物的浓度。图5是显示了正常健康志愿者、脂肪变性患者和脂肪性肝炎患者尿液中APAP及代谢物的浓度的图。图6 A-C是对于NASH (A)、肝部炎症(B)、肝纤维变性(C)的血浆APAP_Gluc分析的图。
具体实施方式
所有引用的参考都通过引用的方式整体并入于本文。在此申请中，除非另有说明，利用的技术可以在几本熟知的参考书的任何中找到，例如-Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook 等人，1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA) ,“Guide to Protein Purification，， in Methods in Enzymology (M. P. Deutshcer, ed. , (1990) Academic Press, Inc.) ,PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis^A 1990. Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128，ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc. , Clifton, N. J.) \)JsR the Ambion 1998 Catalog (Ambion, Austin, TX)。如本文所用，单数形式“一”和“其”(“a”、“an”和“the”)包含复数形式，除非上下文另有明确指出。如本文所用，“和”(“and”)与“或”(“or”)互换使用，除非另有明确说明。第一方面，本发明提供了诊断人类肝脏疾病的方法，其包括
(a)对受试人施用对乙酰氨基酚(APAP)后，测定获自受试人的血浆样品和/或尿液样品中对乙酰氨基酚(APAP)-葡糖苷酸的量，其中受试人处于肝脏疾病的风险。(b)将血浆样品和尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量与对照比较；和 (c)如果血浆样品或尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相对于对照升高，
则鉴定受试人患有肝脏疾病。在第一方面的一个优选的实施方式中，方法包括
(a)对处于肝脏疾病风险的受试人施用对乙酰氨基酚(APAP)；
(b)获得受试人的血浆样品和/或尿液样品；
(c)测量血浆样品和尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量；
(d)将血浆样品和尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量与对照比较；和
(e)如果血浆样品和尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相对于对照升高， 则鉴定受试人患有肝脏疾病。发明人已表明该发明的方法提供非侵入的血液检测或尿液检测来鉴定患者患有各种肝脏疾病。受试人可以是处于肝脏疾病风险的任何人，包括青少年和成年受试人。通过本技术领域技术人员熟知的标准技术，从受试人获得血浆样品和/或尿液样品。如本文所用，术语“肝脏疾病”包括显示本文描述的对乙酰氨基酚代谢改变的任何肝脏疾病，包括但不限于肝纤维变性、肝炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎、毒素诱导的脂肪性肝炎、原发性硬化性胆管炎、肝硬化和脓毒血症。如本文所用，“对乙酰氨基酚，，(APAP)是熟知的止痛和退热剂和其制剂，结构如图1所示。可以对受试人施用任何合适剂量的APAP。尽管可以对受试人施用多于一种剂量的APAP，但是指示的最高剂量IOOOmg是优选的，以最小化毒性风险，又可以便于代谢物形成的分析。在本发明的所有方面和实施方式的一个优选的实施方式中，给受试人施用250 mg到1000 mg之间的APAP总剂量。在一个优选的实施方式中，受试人在测试前至少M小时不摄入任何APAP。在本发明的所有方面和实施方式的一个优选的实施方式中，给受试人施用250 mg到1000 mg之间的APAP总剂量。可以施用任何合适剂型的APAP，包括但不限于液体口服剂量形式和固体口服剂量形式。如本文所用，“APAP-葡糖苷酸”是指APAP的一种特定的代谢物，其结构如图1所示。如本文所用，“对照”是标准化具有健康肝脏的受试人中测量的APAP-葡糖苷酸的量的任何方式。在一个优选的实施方式中，对照包括预先确定的正常个体或群体的 APAP-葡糖苷酸的水平(即已知的未患目的肝脏疾病)。如本文所用，APAP-葡糖苷酸相对于对照“升高”的量可以是指任何高于对照，以及优选地是统计学显著的升高(如P < 0.05)。在多种优选的实施方式中，血浆样品或尿液样品中的APAP-葡糖苷酸的量相对于对照的APAP-葡糖苷酸升高的水平是1. 2倍、1. 4倍、 1. 5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或者更高差异。施用APAP后在任何恰当的时间点获得的血浆样品和尿液样品来检测APAP-普糖苷酸可以用于发明的所有方面和实施方式的方法中。在本发明的所有方面和实施方式的一个优选的实施方式中，测量血浆样品中APAP-葡糖苷酸的量，该测量在APAP施用后在1分钟到180分钟之间进行；更优选地是在1分钟到120分钟之间；还更优选地是在1分钟到 60分钟之间。在不同的进一步优选实施方式中，测量在10分钟到180分钟之间；30分钟到180分钟之间；45分钟到180分钟之间；60分钟到180分钟之间；10分钟至Ij 120分钟之间；30分钟到120分钟之间；45分钟到120分钟之间；10分钟到60分钟之间；30分钟到60分钟之间和45分钟到60分钟之间进行。在本发明的所有方面和实施方式的另一个优选的实施方式中，测量了尿液样品中APAP-葡糖苷酸的量，并且其中测量在APAP施用后 120分钟到480分钟之间；更优选地120分钟到360分钟之间；还更优选地120分钟到300 分钟之间或120分钟到240分钟之间进行。在不同的进一步优选实施方式中，测量在APAP 施用后180分钟到480分钟之间；180分钟到360分钟之间；180分钟到300分钟之间； 180分钟到240分钟之间；240分钟到480分钟之间；240分钟到360分钟之间；240分钟到300分钟之间；300分钟到480分钟之间；300分钟到360分钟之间；360分钟到480 分钟之间进行。在多种进一步优选实施方式中，可进行1、2、3、4或更多次测量以例如评估在一个或更多时间点与对照比较APAP-葡糖苷酸的升高。这些方法可以进一步包括检测和 /或测量血浆和/或尿液中的其他分析物，包括但不限于APAP、APAP-硫酸盐、APAP-NAC和 APAP-GG/CYS。可以进行任何合适的处理步骤以制备血浆样品和/或尿液样品用于APAP-葡糖苷酸测量。在一个示例性实施方式中，用标准技术将蛋白从血浆样品和/或尿液样品中沉淀， 并离心；然后得到的上清用于本发明方法的测量步骤。测量血浆样品和尿液样品之一或二者中APAP-葡糖苷酸的量可以用任何合适的分析物测量技术进行，包括但不限于色谱(例如高压液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、GC质谱(GC-MQ、薄层色谱(TLC)等)、核磁共振(NMR)、光谱电化学技术、毛细管电泳和免疫学技术。在以上任何实施方式的进一步优选的实施方式中，测量、比较和鉴定步骤是自动的；在这个实施方式中，这些步骤可以使用自动仪器来进行，这种设备用于进行上述任何技术。这种设备包含机器可读存储介质，其包含使设备执行测量、比较和鉴定步骤的指令。获自人测试受试者的血浆样品和/或尿液样品在测量APAP-GLUC之前可以保存； 合适的保存条件是本领域技术人员已知的。例如，可以将样品可在合适的温度冷冻至期望的保存长度；在一个实施方式中，样品在-80°C稳定长达一年。在该第一方面的一个优选的实施方式中，受试人处于非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 的风险。非酒精性脂肪肝病(NAFLD)包括一系列病理损害，从肝脂肪变性到一种形式的脂肪肝——称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，NAFLD中最严重的形式。人活检中与NASH诊断独立相关的组织学特征包括肝脂肪变性、肝细胞气球样变性、小叶炎症、Mallory' s透明蛋白和窦周纤维变性。而且，NASH具有进展成需要肝移植的肝硬化的潜能。如本文公开的，本发明人已经发现在NASH患者中，ABCC2转运体不是正确地定位在NASH肝的小管膜上，而是定位在远离小管的膜泡中。这种ABCC2转运体的异常定位在 Lickteig等人(2007)描述的大鼠MCD模型中没有发现。发明人还发现，在NASH患者中， 肝脏ABCC3和ABCC4表达上调。尽管没有受任何作用机制束缚，但是发明人相信，ABCC2向膜泡的改变的肝运输改变了对APAP-GLUC的处置以有利于通过ABCC3和/或ABCC4的血浆维持(然后再排到尿中)，而不是通过ABCC2的胆汁清除。这个实施方式中的方法可以用于分级患有NAFLD的受试者，并区分患有NASH的受试者与患有肝脂肪变性的受试者。目前诊断NASH的方法依赖于肝活检。因此，用于诊断 NASH的非侵入方法是有临床价值的，并允许更快地开始NASH的治疗，所述治疗包括但不限于积极减轻体重方案和治疗性药物治疗。在一个优选的实施方式中，处于NASH风险的受试人患有非酒精性脂肪肝病、脂肪变性代谢综合征、肥胖、血脂异常、胰岛素抵抗、心血管病和糖尿病中的一种或多种。在本发明第一方面的另一个优选的实施方式中，受试人处于肝纤维变性的风险。 肝纤维变性是过度增生的损伤愈合，其中过多的结缔组织在肝中形成。细胞外基质过度产生或退化不足，或二者兼有。纤维变性自身不会引起症状，但是会导致门脉高压(瘢痕形成扭曲了经肝的血流)或肝硬化(不能适当地替换被破坏的肝细胞导致肝功能异常)。目前诊断肝纤维变性的方法依赖于肝活检。因此，非侵入的诊断肝纤维变性的方法是有临床价值的。在一个优选的实施方式中，处于肝纤维变性风险的受试人患有或以前患有过诱发肝纤维变性的一个或多个状况，这些状况选自α 1-抗胰蛋白酶缺乏、威尔森氏病(Wilson’ s disease)、果糖血症、半乳糖血症、III、IV、VI、IX和X型糖元贮积症、血色病、戈谢病、 Zellweger综合征、酪氨酸血症、细菌感染、病毒感染(例如乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒 (HCV))、寄生虫感染、布加氏综合征(Budd-Chiari syndrome )、酒精中毒、药物成瘾、心力衰竭、肝静脉闭塞病、胆道梗阻和门静脉栓塞。如下更详细公开的，发明人已经发现患有肝纤维变性的受试人比未患肝纤维变性的受试人在血浆样品和尿液样品中APAP-GLUC的量升高。本发明的这种方法允许更快地开始对肝纤维变性的治疗，包括但不限于去除肝脏损伤的基础，例如通过抗病毒治疗消灭HBV 或HCV ；酒精性肝病的戒酒；在血色病和Wilson’ s病患者中分别去除如铁或铜等重金属； 或在胆道梗阻中减少胆管压力。肝纤维变性一般在组织学上可分级为轻度(血管周围极小的瘢痕)，中度(瘢痕由肝血管扩展出来)或重度(瘢痕在血管间形成桥)。在一个优选的实施方式中，如果受试人血浆样品和尿液样品之一或二者中APAP-葡糖苷酸的量相对于对照升高，则该受试人被鉴定为患有重度肝纤维变性。在一个进一步优选的实施方式中，受试人患有NASH。在本发明第一方面的另一个优选的实施方式中，受试人处于肝炎的风险，肝炎是一种肝脏的炎症，其特征为弥漫性或斑片性的坏死。主要病因是特定的肝炎病毒、酒精和药物。因此，在一个优选的实施方式中，受试人患有或以前患有过选自下列的一种或多种疾病酒精中毒、药物成瘾、细菌感染、病毒感染(如A、B、C、D和/或E型肝炎)、真菌感染、原生动物感染、寄生虫感染、螺旋体感染、结节病、溃疡性结肠炎和克罗恩病。如下更详细公开的，发明人已经发现患有肝脏炎症(肝炎)的受试人具有高于未患肝纤维变性的受试人的血浆和尿液中的APAP-GLUC的量。肝脏炎症一般在组织学上被分级为轻度(少于2个炎症病灶)，中度(2-4个炎症病灶)，或重度(多于4个炎症病灶)。在一个优选的实施方式中，如果受试人血浆和尿液之一或二者中APAP-葡糖苷酸的量相对于对照升高，则该受试人被鉴定为患有中度或重度肝脏炎症。在一个最优选的实施方式中，如果受试人血浆和尿液之一或二者中APAP-葡糖苷酸的量相对于对照升高，则该受试人被鉴定为患有重度肝炎。在一个进一步优选的实施方式中，受试人患有NASH和/或肝纤维变性。第二方面，本发明提供了鉴定受试人处于药物不良反应的风险的方法，其包括
(a)对受试人施用对乙酰氨基酚(APAP)后，测定获自受试人的血浆样品和/或尿液样品中APAP-葡糖苷酸的量，其中受试人需要治疗性药物的治疗；
(b)将血浆样品和尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量与对照比较；和
(c)如果血浆样品或尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相对于对照升高，则鉴定受试人处于药物不良反应的风险。在第二方面的一个优选的实施方式中，方法包括
(a)对需要治疗性药物治疗的受试人施用对乙酰氨基酚(APAP)；
(b)获得受试人的血浆样品和/或尿液样品；
(c)测量血浆样品和尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量；
(d)将血浆样品和尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量与对照比较；和
(e)如果受试人血浆样品和尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相对于对照升高，则鉴定受试人处于不良药物反应的风险。第三方面，本发明提供了一种方法，该方法可以确定受试人治疗性药物的合适剂量，其包括
(a)对受试人施用对乙酰氨基酚(APAP)后，测定获自受试人的血浆样品和/或尿液样品中对乙酰氨基酚(APAP)-葡糖苷酸的量，其中受试人需要治疗性药物的治疗；
(b)将血浆样品和尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量与对照比较；和
(c)如果血浆样品或尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相对于对照升高，则确定受试人应该接受非标准剂量的药物。在第三方面的一个优选的实施方式中，方法包括
(a)对需要治疗性药物治疗的受试人施用对乙酰氨基酚(APAP)；
(b)获得受试人的血浆样品和/或尿液样品；
(c)测量血浆样品和尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量
(d)将血浆样品和尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量与对照比较；和(e) 如果受试人血浆样品和尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相对于对照升高，则鉴定受试人为应该接受非标准剂量的药物。本发明的第一、第二和第三方面所有共有的术语具有相同的定义；除非上下文明确指出，本发明的第一方面的所有实施方式被应用到本发明的第二和第三方面。如本文公开的，本发明人已经发现在NASH患者中，ABCC2转运体不是正确地定位在NASH肝的小管膜上，而是定位在远离小管的膜泡中。这种ABCC2转运体的异常定位在 Lickteig等人(2007)描述的大鼠MCD模型中没有发现。发明人还发现，在NASH患者中， 肝脏ABCC3和ABCC4表达上调。尽管没有受任何作用机制束缚，但是发明人相信，ABCC2向膜泡的改变的肝运输改变了对APAP-GLUC的处置以有利于通过ABCC3和/或ABCC4的血浆维持(然后再排到尿中)，而不是通过ABCC2的胆汁清除。因此APAP代谢物消除由胆汁向血浆/尿液的部分改变表明可影响药物消除路径的排出转运体表达和/或细胞定位的改变， 并因此提供方法以鉴定由于排出转运体表达和/或定位变化而处于不良药物反应风险的受试人。如本文所用，“处于药物不良反应的风险”是指受试人更可能经历一种或多种与接受的药物相关的不良反应。这种可能的不良反应包括对于任何给定药物的任意一种产品说明书中列举的任何这种不良反应以及特殊的不良反应。如本文所用，“药物的非标准剂量”是指考虑到升高的药物不良反应的风险，主治医师应该改变对受试人施用的药物剂量。在本发明的第二和第三方面的多个优选的实施方式中，需要治疗性药物治疗的受试人处于NASH、肝纤维变性和/或肝炎的风险或患有这些疾病。处于这些疾病中每一种的风险的受试人在本发明的第一方面都有详细公开。在另一个优选的实施方式中，受试人患有导致ABCC2、ABCC3和/或ABCC4转运体表达和/或定位改变的任何疾病。在一个优选的实施方式中，疾病导致ABCC2转运体的异常定位。在多个优选的实施方式中，治疗性药物是这样的药物，其代谢物通过ABCC2、ABCC3 和/或ABCC4从肝脏中转运出去。在多个非限制性实例中，这些治疗性药物包括阿霉素、顺钼、依托泊甙、氨甲蝶呤、吗啡、依折麦布(ezeitimibe)、葡糖醛酸化的共轭药物、谷胱甘肽共轭药物和硫酸共轭药物。APAP的任何合适剂量都可以给受试人施用。虽然可以给受试人施用多于一种剂量，但是在一个优选的实施方式中，施用单个剂量以便于代谢物形成的分析。在一个优选的实施方式中，受试人在测试前至少M小时不摄入任何APAP。在本发明的所有方面和实施方式中的一个进一步优选的实施方式中，给受试人施用250 mg到1000 mg之间的APAP总剂量。可以施用任何合适剂型的APAP，包括但不限于液体剂量形式和固体口服剂量形式。施用APAP后在任何恰当的时间点获得的血浆样品和尿液样品来检测APAP-普糖苷酸可以用于发明的所有方面和实施方式的方法中。在本发明的所有方面和实施方式的一个优选的实施方式中，测量血浆样品中APAP-葡糖苷酸的量，并且该测量在APAP施用后在1 分钟到240分钟之间进行；更优选地是在1分钟到180分钟之间；还更优选地是在APAP施用后在1分钟到120分钟或1分钟到60分钟之间。在本发明的所有方面和实施方式的另一个优选的实施方式中，测量尿液样品中APAP-葡糖苷酸的量，并且其中测量在APAP施用后120分钟到480分钟之间进行；更优选地在APAP施用后120分钟到360分钟之间；还更优选地在APAP施用后120分钟到300分钟之间或120分钟到240分钟之间。可以进行任何合适的处理步骤以制备血浆样品和/或尿液样品用于APAP-葡糖苷酸测量。在一个示例性实施方式中，用标准技术将蛋白从血浆样品和/或尿液样品中沉淀， 并离心；然后得到的上清用于本发明方法的测量步骤。测量血浆样品和尿液样品之一或二者中APAP-葡糖苷酸的量可以用任何合适的分析物测量技术进行，包括但不限于色谱(例如高压液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、GC质谱(GC-MQ、薄层色谱(TLC)等)、核磁共振(NMR)、光谱电化学技术、毛细管电泳和免疫学技术。如本文所用，“对照”是标准化具有健康肝脏的受试人中测量的APAP-葡糖苷酸的量的任何方式。在一个优选的实施方式中，对照包括预先确定的正常个体或群体的 APAP-葡糖苷酸的水平(即已知的未患目的肝脏疾病)。如本文所用，APAP-葡糖苷酸相对于对照“升高”的量可以是指任何高于对照，以及优选地是统计学显著的升高(如P < 0.05)。在多种优选的实施方式中，血浆样品或尿液样品中的APAP-葡糖苷酸的量相对于对照的APAP-葡糖苷酸升高的水平是1. 2倍、1. 4倍、 1. 5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或者更高差异。在以上任何实施方式的进一步优选的实施方式中，测量、比较和鉴定步骤是自动的；在这个实施方式中，这些步骤可以使用自动仪器来进行，这种设备用于进行上述任何技术。这种设备包含机器可读存储介质，其包含使设备执行测量、比较和鉴定步骤的指令。第四方面，本发明提供了一种机器可读存储介质，其包含一组指令，用于使代谢物测量装置执行发明的第一、第二和第三方面方法的任何实施方式的测量、比较和鉴定步骤。 如本文所用，术语“计算机可读介质”包括通过CPU可读的磁盘、光盘、有机存储器和任何其他的易失性(如随机存取存储器(“RAM”))或非易失性(如只读存储器(“ROM”))海量存储系统。计算机可读介质包括共同运转的或相互关联的计算机可读介质，这些计算机可读介质在数据处理系统上排他的存在或者可被本地或远程的多个相互关联的数据处理系统间分布。如本文所用，“代谢物测量装置”是指可以进行代谢物测量以进行本发明的装置，这个装置包含但不限于色谱装置(例如高压液相色谱(HPLC)装置、气相色谱(GC)装置、 GC质谱(GC-MQ装置、薄层色谱(TLC)装置等)、核磁共振(NMR)装置、光谱装置、电化学装置、免疫检测装置和毛细管电泳装置。
实施例实施例1 在诊断为NASH的人中肝脏外排转运体升高的表达
进行研究以确定患有NAFLD的患者是否显示了改变的对乙酰氨基酚代谢与处置。正常肝脏、脂肪变性、具有脂肪肝的NASH和末期NASH(隐源性肝硬化)患者的肝脏样本获自NIH 资助的肝组织获得和分布系统(LTPADS)。免疫印迹蛋白分析。全细胞裂解物(20μβ/孔)利用在7. 5%凝胶上的SDS-PAGE分离，并以30毫安恒流过夜转移至PVDF膜上。所有的膜用含吐温-20的PBST配制的5%的脱脂奶粉在室温封闭1小时。然后膜在一级抗体溶液(1:2000在PBST-牛奶中稀释)中在4°C 孵育过夜，一级抗体由ABCC3、ABCC4单克隆抗体(Abeam, Cambridge, ΜΑ)或GAPDH多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)组成。过夜孵育后，将膜在辣根过氧
11化酶偶联的二级抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)溶液中在室温孵育 1 /]、#。ECL Advance Western Blotting Detection Kit (GE Healthcare
Life Sciences, Piscataway, NJ))通过制造商的步骤进行检测。图2显示在患有NAFLD的人中肝脏ABCC3和ABCC4的表达。当与对照比较时，具有脂肪变性的肝脏中ABCC3和ABCC4的表达几乎没有变化；但是各期NASH患者肝脏中蛋白表达显著提高。虽然之前认为人体中这些转运体蛋白的表达具有大的个体间差异，但是看起来这种差异很大程度上可能是由于疾病状态引起的。实施例2诊断为NASH的人的肝脏中ABCC2的细胞定位改变。改变的细胞运输作为调节ABCC2功能的一种方式已经在多种状况下被良好证明， 如药物诱导的毒性和妊娠。ABCC2活性的要求是在小管膜上的正确定位。将ABCC2转运体移动远离小管膜进入膜泡可能是一种进化优势，这允许细胞快速调节转运活性，而不必等待相对较慢的蛋白降解/从头合成过程。免疫组织化学染色。简单的说，将福尔马林固定、石蜡包埋的人肝脏样品的组织切片在二甲苯中脱蜡，并在乙醇中再水化，然后在柠檬酸缓冲液(PH 6.0)中进行抗原修复。将内源性过氧化酶活性用在甲醇中的0. 3% (ν/ν) Η202封闭20分钟。所有切片置于Siandon kquenza 切片盒(Thermo-Scientific，ffaltham, ΜΑ)中用于保持试剂孵育。通过将所有的样品在 Background Sniper (Biocare Medical, Concord, CA)中孵育 10 分钟来封闭背景染色。然后将样品在小鼠MRP2单克隆抗体中在4°C孵育过夜。第二天，将样本各个在 Mouse Probe and HRP Polymer (Biocare Medical, Concord, CA) ) ψ IP W 15 ^vIt ^llJ 结合的抗体。通过在Betazoid DAB (Biocare Medical, Concord, CA)中孵育3分钟，然后在去离子水中淬灭来进行显色。所有的样品用新鲜过滤的苏木精溶液(Sigma-Aldrich， St. Louis, MO)复染。所有的切片用 Nikon Eclipse E4000 显微镜和 Sony Exwave DXC-390相机照相。如图3所示，ABCC2在正常健康人的肝脏中定位于小管膜的非常褶皱的边缘 (very crisp edges)，但是在NASH患者肝中，ABCC2明显地嵌入(blurred into)远离小管的膜泡中。转移ABCC2远离它的活性位点的机制允许肝细胞在细胞应变过程中有效地调节和保存重要的内源成分，同时维持蛋白表达。ABCC2向膜泡的改变的细胞转移改变了 APAP-GLUC的处置，以便于血浆维持，而不是胆汁清除。实施例3 =NASH儿童患者血浆和尿液中对乙酰氨基酚-葡糖苷酸的水平高于脂肪变性患者
在儿童患者中进行了研究，这些患者的疾病状态已经被活检证实。由于假定没有干扰因素(如饮酒、不当药物使用)和儿童肥胖的日益流行，24例儿童患者(12-18岁)对于初步研究是理想的。相反地，由于年龄原因，儿童患者仅仅发生真正肝损伤的数量是有限的，儿童患者不能发展成气球样变性，限于脂肪沉积、炎症和纤维变性。高效液相色谱分析。依据以前描述的方法(Howie等，1977a ;Chen等，2000; Slitt等2003d)，通过高效液相色谱分析定量血浆样品和尿液样品中的APAP及其代谢物。APAP 及其代谢物用具有 aPhenomenex Security Guard Column Guard 的 hrbmax SB-C18反相4. 6-mm χ 25_cm柱分离，用由12. 5%的HPLC级甲醇、1%乙酸和86. 5%水组成的流动相洗脱，流速为1.2 mL/分钟。代谢物的洗脱在254nm波长下监测。APAP及其代谢物的保持时间通过与标准品来确定。因为这种HPLC方法不能分开APAP的半胱氨酰甘氨酸共轭物和半胱氨酸的共轭物，所以它们作为APAP-CG/CYS—起定量。使用Beckman System Gold HPLC 系统(Beckman Coulter, Inc. , Fullerton, CA )分析样品，该系统配置了 128-nm溶剂模块和166-nm检测器。基于整合的峰面积(integrated peak areas)来定量。 APAP及其代谢物的浓度用APAP的标准曲线来计算，因为APAP和其共轭代谢物的摩尔消光系数是几乎相同的(Howie等，1977b)。为了沉淀血浆和尿液中的蛋白，样品用冰冷的甲醇分别进行1:2，1:2，1:3稀释，在4°C 4000 χ g离心30分钟。收集得到的上清，在HPLC分析前稀释于流动相1:3 (尿液)或1:2 (血浆)中。图4显示APAP施用后1小时，血浆中APAP及其主要代谢物的浓度。表1中显示的是平均数和中位数的数据。
权利要求
1.一种诊断人类肝脏疾病的方法，其包括(a)对受试人施用对乙酰氨基酚(APAP)后，测定获自所述受试人的血浆样品和/或尿液样品中对乙酰氨基酚(APAP)-葡糖苷酸的量，其中所述受试人处于肝脏疾病的风险；(b)将所述血浆样品和所述尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量与对照比较；和(c)如果所述血浆样品或所述尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相对于对照升高，则鉴定受试人患有肝脏疾病。
2.权利要求1的方法，其中所述处于肝脏疾病风险的受试人患有一种或多种代谢综合征、肥胖、血脂异常、胰岛素抵抗和糖尿病。
3.权利要求1的方法，其中所述受试人处于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的风险。
4.权利要求3的方法，其中所述处于NASH风险的受试人患有一种或多种非酒精性脂肪肝病、代谢综合征、肥胖、血脂异常、胰岛素抵抗和糖尿病。
5.权利要求1的方法，其中所述受试人处于肝纤维变性的风险。
6.权利要求5的方法，其中所述受试人患有或以前患有选自下列的一种或多种病症 α r抗胰蛋白酶缺乏症、威尔森氏病、果糖血症、半乳糖血症、III、IV、VI、IX和X型糖元贮积症、血色病、戈谢病、泽尔韦格氏综合征、酪氨酸血症、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染、 布加氏综合征、酒精中毒、药物成瘾、心力衰竭、肝静脉闭塞病和门静脉栓塞。
7.权利要求1的方法，其中所述受试人处于肝炎的风险。
8.权利要求7的方法，其中所述受试人患有或以前患有选自下列的一种或多种疾病 酒精中毒、药物成瘾、细菌感染、病毒感染、真菌感染、原生动物感染、蠕虫感染、螺旋体感染、结节病、溃疡性结肠炎和克罗恩病。
9.权利要求1-8任意一项的方法，其中所述APAP-葡糖苷酸的量在血浆样品中测量，并且其中测量在施用APAP后1分钟到180分钟之间进行。
10.权利要求1-8任意一项的方法，其中所述APAP-葡糖苷酸的量在尿液样品中测量， 并且其中测量在施用APAP后120分钟到480分钟之间进行。
11.权利要求1-10任意一项的方法，其中对所述受试人施用250mg到1000 mg之间的 APAP。
12.一种鉴定受试人处于药物不良反应的风险的方法，其包括(a)对受试人施用对乙酰氨基酚(APAP)后，测定获自所述受试人的血浆样品和/或尿液样品中对乙酰氨基酚(APAP)的量，其中所述受试人需要治疗性药物的治疗；(b)将所述血浆样品和所述尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量与对照比较；和(c)如果所述血浆样品或所述尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相对于对照升高，则鉴定所述受试人处于药物不良反应的风险。
13.一种确定受试人治疗性药物的合适剂量的方法，其包括(a)对受试人施用对乙酰氨基酚(APAP)后，测定获自所述受试人的血浆样品和/或尿液样品中对乙酰氨基酚(APAP)的量，其中所述受试人需要治疗性药物的治疗；(b)将所述血浆样品和所述尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量与对照比较；和(c)如果所述血浆样品和所述尿液样品之一或二者中的APAP-葡糖苷酸的量相对于对照升高，则确定受试人应该接受非标准剂量的药物。
14.权利要求12或13的方法，其中所述受试人需要选自下列的一种或多种治疗性药物的治疗阿霉素、顺氯氨钼、依托泊甙、氨甲蝶呤、葡糖苷酸化的共轭药物、谷胱甘肽共轭药物和硫酸共轭药物。
15.权利要求12-14任意一项的方法，其中所述APAP-葡糖苷酸的量在血浆样品中测量，并且其中测量在施用APAP后1分钟到180分钟之间进行。
16.权利要求12-15任意一项的方法，其中所述APAP-葡糖苷酸的量在尿液样品中测量，并且其中测量在施用APAP后120分钟到480分钟之间进行。
17.权利要求12-16任意一项的方法，其中对所述受试人施用250mg到1000 mg之间的 APAP。
18.权利要求1-17任意一项的方法，其中所述测量、比较和鉴定的步骤是自动的。
19.一种可读存储介质，其包含用于使代谢物测量装置执行权利要求1-18中的任意一项测量、比较和鉴定步骤的一组指令。
全文摘要
本发明提供了诊断人类肝脏疾病例如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、鉴定受试人处于不良药物反应风险和确定对受试人合适的治疗性药物剂量的方法。标记是来自人受试人血浆样品或尿液样品中的对乙酰氨基酚(APAP)-葡糖苷酸的增加的水平。
文档编号G01N33/94GK102227641SQ200980147904
公开日2011年10月26日 申请日期2009年9月30日 优先权日2008年10月1日
发明者N.彻林顿 申请人:亚利桑那大学评议会