一种用于合成甘油葡糖苷的工程菌和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物合成高附加值化学品领域，具体而言是一种用于合成甘油葡糖 苷的工程菌和应用。
【背景技术】
[0002] 甘油葡糖苷，一类甘油分子与葡萄糖分子以糖苷键结合的物质，根据葡萄糖分 子的构型、结合甘油分子的位置以及甘油分子的构型分为多种。其中，自然界存在最 多的，作为天然渗透压抵抗分子的是2-0-( a -D-gluco-pyranosyl)-sn-glycerol (以 下简称GG)，即集胞藻PCC6803在盐胁迫下合成的主要分子，也被称为"兼容性分子 (compatible solutes)"。现有研究表明，GG具有如下用途：（1)GG可以通过与细胞胞内 大分子的相互作用来维持大分子的稳定构象，是一种大分子的稳定剂，可用于蛋白等大分 子的长期保存，或大分子蛋白的冻干保护剂（Sawangwan, T.，Goedl, C.，Nidetzky, B.，20 10. Glucosylglycerol and glucosylglycerate as enzyme stabilizers. Biotechnol. J. 5, 187-191.)。（2) GG具有保湿功能，也可以激活表皮细胞抗氧化酶，如超氧化物歧化酶 (S0D)、谷胱甘肽过氧化物酶等的表达，可以作为一种化妆品添加剂使用，消除活性氧自由 基，抗衰老（US20110207681A1)。（3)日本著名的白鹿清酒公司，由于其发酵酒产品中含有 GG，所以对其生理药理作用进行了深入研究，并申请了相应专利，具体包括，GG可以降低血 糖水平，有助于辅助治疗肥胖或糖尿病（JP2004-331576);促进骨胶原和透明质酸的生成 (JP2004-331579);抑制脂肪细胞内中性脂的累积（JP2004-331580);作为洁面的一种成分， 洁面后可消除紧绷感（JP2004-331583);可作为食品，饮料添加剂（JP2007-262023);可作为 药物添加剂，治疗过敏性皮炎（JP2009-161564 )。
[0003] 目前合成GG的方法主要包括化学合成法、微生物合成法、酶催化合成法。化学合 成方面，由于GG存在多种光学异构体，获得所需2-0_( a -D-gluco_pyranosyl)-sn-glyce rol产率较低，且需要多步纯化；微生物合成方面，Martin Hagemann et al虽然曾经报道 了利用 Stenotrophomonas rhizophilastrain DSM14405 合成 GG 并分泌至胞外，但最高 产量仅约为29mg I^Otoder et al.，2005);酶催化合成方面，日本白鹿清酒公司曾经报道 了利用麦芽糖和甘油作为底物，利用a -葡糖苷酶合成GG，其清酒中GG的最高含量可达 0.5%(Takenaka and Uchiyama, 2000)。2008 年，Bernd Nidetzky 等报道了利用鹿糖和甘 油作为底物，通过鹿糖磷酸化酶（sucrose phosphorylase)催化合成GG。其中，90%以上 的蔗糖可以被转化为GG，后期通过吸附层析等纯化，GG的纯度可达98%，纯化回收率约为 70%(Goedl et al.，2008) (US2009031872A1)。
[0004] 蓝细菌作为新一代光合微生物系统正受到越来越多的关注（Angermayr，S.A.等 人，2009)。在2009年中，国内外几个研究小组相继在利用蓝细菌生产生物燃料及生物基 化学品方面取得突破：中国石油大学的傅鹏程教授将来源于运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis)的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因在集胞藻PCC6803中共表达，实现了太阳能 到生物乙醇的转化(产量为5. 2mm〇l/0D73Q/L/d) (Dexter J.和Fu，P.，2009);美国加州大 学伯克利分校Anastasios Melis教授的研究小组通过在集胞藻PCC6803中外源表达山 葛（Pueraria montana)的异戊二烯合成酶基因，实现了在蓝细菌中生产异戊二烯(产量为 50mg/g/d) (Lindberg，P?等人，2009);加州大学洛杉肌分校James C Liao教授也发表了 他们最新的研究成果：通过基因工程手段实现了在聚球藻PCC7942中高效生产异丁醛(最 高产量为 6, 230 u g/L/h)(Atsumi, S?等人，2009)，这项成果发表在 Nature Biotechnology 杂志上。2010年3月29日，PNAS杂志报道了美国亚历桑那州立大学的一项最新的研究成 果，即在集胞藻PCC6803中生产和分泌游离脂肪酸（Liu, X.等人，2010)。
[0005] 蓝细菌(也称为蓝藻）是一类能够进行植物型产氧光合作用的原核微生物，它作为 新一代工业微生物系统合成GG具有如下优势：（1)蓝细菌能够吸收太阳能、固定二氧化碳 作为碳源进行自养生长，培养成本低，且它们对环境适应能力强，生长迅速；（2)蓝细菌自 身在盐胁迫作用下可以大量合成GG，用于抵抗盐胁迫对细胞造成的损伤，同时GG的合成及 调控机制也得到了广泛的研究（Martin Hagemann，2011); (3)蓝细菌遗传操作方便，遗传背 景清晰，许多种类的基因组测序工作也已经陆续完成，这使得利用基因工程手段改造蓝细 菌非常方便。其中，集胞藻（Synechocystis sp. )PCC6803是单细胞蓝细菌的代表物种，其 全基因组测序于1996年完成，是最早完成全基因组测序的光合生物，也是目前研究最多的 蓝细菌之一，被认为是理想的模式物种之一（Angermayr，S. A.等人，2009)。所以，通过基因 工程改造蓝细菌集胞藻PCC6803,合成在化妆品、药物、保健品、食品等领域具有广泛用途的 GG，具有重要的学术研究价值与实际应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种用于合成甘油葡糖苷的工程菌和应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] -种用于合成甘油葡糖苷的工程菌，工程菌为GG转运系统基因和/或GG合成负 调控蛋白基因缺失的蓝细菌突变体。
[0009] 所述GG转运系统基因为GG转运系统中slr0529基因、slr0530基因、slr0531基 因中的一种或几种。
[0010] 所述GG转运系统基因为GG转运系统中slr0530基因和slr0531基因，即ggt⑶。 所述蓝细菌突变体中还包括抗性标记基因，抗性标记基因选自壮观霉素抗性基因Omega片 段（SEQ ID N0:9)、卡那霉素抗性基因片段（SEQ ID N0:10)或氯霉素抗性基因片段（SEQ ID N0:11)。
[0011] 所述蓝细菌为集胞藻（Synechocystis sp. )PCC6803、聚球藻（Synechococcus) PCC7002、聚球藻WH5701、聚球藻CB0101、聚球藻CB0205、聚球藻RCC307、聚球藻WH7803、聚 球藻RS9917、聚球藻CC9311、聚球藻、聚球藻WH8016、聚球藻RS9916、聚球藻BL107、聚球 藻 CC9902、聚球藻 WH8102、聚球藻 CC9605、聚球藻 WH8109、聚球藻 PCC7335、Acaryochloris MBIC11017、Acaryochloris CCMEE5410、蓝杆藻（Cyanothece)CCYOllO、蓝杆藻 ATCC51142、 微鞘藻（Microcoleus)PCC7420、鞘丝藻（Lyngbya)PCC8106、节旋藻（Athrospira)CS_328、 节旋藻PCC8005或节旋藻NIES-39。
[0012] 一种用于合成甘油葡糖苷的工程菌的构建方法：
[0013] 1)构建用于敲除蓝细菌中编码能够吸收胞外GG的转运系统基因的质粒；
[0014] 2)构建用于敲除蓝细菌中编码的能够抑制GG合成的负调控蛋白基因的质粒；
[0015] 3)将步骤1)所得质粒转化到蓝细菌中即得到工程菌；或是将步骤1)和步骤2)所 得质粒先后转化到蓝细菌中即得到工程菌。
[0016] 一种用于合成甘油葡糖苷的工程菌的应用，所述工程菌在合成甘油葡糖苷中的应 用。
[0017] 所述工程菌光照下能利用太阳能固定二氧化碳生长，而在盐胁迫作用下，能合 成、积累并分泌甘油葡糖苷。
[0018] 相关术语
[0019] 蓝细菌(也称为蓝藻）是一类光合自养的原核微生物，其能够利用太阳能，固定二 氧化碳。
[0020] GG 转运系统（glucosylglycerol transport system)是集胞藻 PCC6803 用 于将胞外GG转运至胞内的蛋白复合体，包含三个亚基，分别是slr0529基因（ggtB， substrate-binding protein)、slr0530 基因（ggtC, permease protein)、slr0531 基因 (ggtD，permease protein)。研究结果表明，这三个亚基只要一个被敲除，集胞藻PCC6803就 失去了将胞外 GG 回收至胞内的功能（Mikkat, S.，Hagemann, M.，2000. Molecular analysis of the ggtBCD gene cluster of Synechocystis sp. strain PCC6803encoding subunits of an ABC transporter for osmoprotective compounds. Arch Microbiol. 174,