专利名称：较重卤原子取代的斯夸苷基染料,其制备方法及其在光动力的治疗和工业应用中作为敏 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及如下面分子式1的较重卤原子取代斯夸苷(squaraine)基染料及其药学可接受的衍生物， 分子式1其中X是较重卤原子，它们能被用于光动力的治疗和工业应用。本发明还涉及一种较重卤原子取代斯夸苷基染料的制备方法及这种染料在光动力的治疗和工业应用中作为敏化剂的用途。
本发明还涉及如分子式1的斯夸苷染料，其中X是溴或碘，或其药学可接受的衍生物，它们可以在诊断和治疗人或动物的癌及其它疾病的光动力应用中被用作光敏剂。
本发明还涉及其中X是重卤原子的如分子式1的斯夸苷染料或其衍生物，它们可被用作水消毒的光动力工业应用中的光敏剂。
光动力治疗是用于癌症和多种疾病的诊断和治疗的最新方式。大量证据提示光动力治疗代表一种用于许多癌症的方便有效的方法。光动力治疗包括通过光和化学药品(光敏剂)的联合作用使活细胞失活。在静脉注射后，光敏剂被肿瘤细胞选择性地保留。肿瘤组织中比正常组织中有更多的敏化剂。当用特定波长的光或激光照射时，敏化剂产生高反应性物种，这些高反应性物种改变生物组织而引起癌细胞的选择性破坏。
唯一已经过广泛研究的敏化剂是光敏钠，一种血卟啉衍生物(HpD)，也称为第一代光敏剂。光敏钠和其商业变体Photosan、发光菌是首先被许可临床使用并首先获得管理批准的。可是，光敏钠的缺点是它是一种组份对所采用的合成方法高度敏感的混合物产品。已知会引起皮肤光敏性的不希望的副作用，因为它自身体缓释。在这些情况下，用光敏钠治疗的病人需要长时间呆在黑暗中直到它从身体内排泄完。光敏钠在光谱的红区仅有微弱的吸收(在630nm的摩尔吸收系数为3000 M-1cm-1)，导致难于将光传送到某些肿瘤位置以及大肿瘤光穿透的不完全。因此，利用光敏钠的光动力治疗仅显示在小于10mm深度的表层的癌。可以参考Dougherty，T.J.Photochem.Photobiol.1987，45，879；Kessel，D.；Dougherry，T.J.PhorphyrinPhotosensitization；Plenum Publishing Corp.；New York，1983；Brown，S.B.；Truscott，T.G.Chem.Ber，1993，29，955；Andreoni，A.；Cubeddu，R.Phorphyrins in Tumor Phototherapy；Plenum Publishing Corp.NewYork，1984；Brasseur，N.；Hasarat，A.；Langlois，R.；Wagner，J.R.；Roussean，J.；van Lier J.E.Photochem.Photobiol.1987，45，581；Spikes，J.D.，Photochem.Photobiol.1986，43，691；Firey，P.A.；Ford，W.E.；Sounik，J.R.；Kenney，M.E，；Rodgers，M.A.J.J.Am.Chem.Soc.1988，110，7626；Moan，J.Cancer Lett.1986，33，45；Tralau，C.J.；Young，A.R.；Walker，N.P.J.；Vernon，D.I.；MacRobert，A.J.；Brown，S.B.；Brown，S.G.Photochem.Photobiol.1989，49，305。
为了克服第一代敏化剂的缺点，合成了在长波长区表现出强吸收的第二代敏化剂。正在光动力治疗的不同临床阶段进行评价的第二代敏化剂包括二氢卟吩类、porphycenes、苯并卟啉类、酞菁类、红紫素类和氨基乙酰基丙酸介导的卟啉类。红紫素类具有良好的光学性质和生物分布型，但是需要加溶剂和乳化剂如脂质体或脂蛋白用于其光动力应用。二氢卟吩类在光谱的红区和红外区有强吸收并与光敏钠竞争，但皮肤光敏性是它们的主要问题。已经发现酞菁和金属酞箐类在600-700nm区有强吸收，但是磺化程度对光动力活性的细节是不清楚的。可以参见美国专利第603267、5965598、5889181、586035和5789586号；Kostenich，G.A.；Zuravkin，I.N.；Zhavrid，E.A.J.Photochem.Photobiol.B.Biol.1994，22，211；Leach，M，W.；Higgins，R.J.；Autry，S.A.；Boggan，J.E.；Lee，S.-J.H.；Smith，K.M.Photochem.Photobiol.，Bai，S.；Lin，C.；Guo，Z.Proc.SPIE 1993，1616，275；Vogel，E.；Kocher，M.Schmickler，H.；Lex，J.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1986，25，197；Leunig，M.；Richert，C.；Gamarra，F.；Lumper，W.；Vogel，E.；Jochani D.；Goetz，A.E.Br.J.Cancer 1993，68，225；Boyle，R.W.；Legnoff，C.C.；Vanheir，J.E.Br.J.Cancer 1993，67，1177；Wohrl，D.；Shopova，M.；Muller，S.；Muleiv，A.D.；Mantereva，V.N.；Krastev，K.K.J.Photochem.Photobiol.B.Biol.1993，21，155；Morgan，A.R.；Garbo，G.M.；Keck，R.W.；Ericksen，L.D.；Selman，S.H.Photochem.Photobiol.1990，51，589。
仍期望开发这样的光敏剂，它在长波长区有强吸收，对正常组织无毒，在生理pH时溶于缓冲液，能够在光动力治疗期间被漂白，并显示出更高的治疗效果。
斯夸苷形成一类染料，在红至接近红外区具有尖锐并且强的吸收带。这些染料的摩尔吸收系数通常在500,000M-1CM-1范围内。斯夸苷在静电复印光感受器、太阳能电池和光学记录装置中有工业应用。然而，由于这些染料非常低的系间窜越效率，它们作为光动力治疗应用中的光敏剂的潜力还没有研究。可以参考美国专利第6001523、5552253、5444463号；Law，K.-Y.Chem.Rev.1993，93，449；Piechowski，A.P；Bird，G.R；Morel，D.L；Stogryn，E.L.J.Phy.Chem.1984，88，934。
因此，研究斯夸苷基染料以观察与先前技术有关的问题是否可以被克服。本发明的一个目的是提供一种光敏剂，基于斯夸苷部分，它适用于光动力治疗应用。我们的初步研究表明当与母体未取代斯夸苷染料相比时，斯夸苷部分的卤化作用导致增大的水溶性和系间窜越效率。这些卤化染料在近红外区(＞600nm)表现出强吸收和在微观不均一性介质中显著的红移。三重激发态是包含在这些系统中的主要过渡态，它与分子氧有效地相互作用以定量的收率产生生物学高反应性的单线态氧，由此使它们成为光治疗应用中潜在的候选者。可以参考Ramaiah，D.；Joy，A.；Chandrasekhar，N；Eldho，N.V.；Das，S.；George，M.V.Photochem.Photobiol.1997，65，783。
可是，这些卤化斯夸苷染料的收率在规定的条件下较低，并且在膜模型和药物载体系统如聚合物中其单线态氧(胞毒剂)的产生效率是未知的。而且，在文献中对斯夸苷基染料的生物学性质或光动力治疗应用尚无报道。对于确定敏化剂在光动力治疗应用中的用途是重要的生物学性质包括敏化剂在生理pH和照射条件下的稳定性、细胞毒性、药理学方面、生殖毒性和它的体内光动力活性的效率等。
本发明试图克服上述限制。在本发明中通过修改加工条件，我们得到了收率增加的较重卤原子改性的斯夸苷基染料。我们首次研究了典型的斯夸苷基光敏剂的生物学性质。这些研究包括这些敏化剂在生理pH条件下的稳定性、细胞毒性和在黑暗中和照射条件下的诱变性。另外研究了这些敏化剂的光动力作用的体内和体外效率和机理。
本发明的主要目的是提供有效的斯夸苷基染料和/或其药学可接受的衍生物，它们能够在光动力治疗应用包括癌症的治疗中用作敏化剂。
本发明的另一个目的是提供斯夸苷基染料和/或其药学衍生物，由于它们在微观不均一性介质中的高荧光量子产率，它们能被用作诊断癌的荧光传感器。
本发明的又一目的是提供斯夸苷基染料和/或其衍生物，它们能够用于光动力工业应用如水的消毒等。
本发明的再一目的是通过在化学装置中连接或引入斯夸苷基染料，能够实现使这种药物传递或靶向于确定的活细胞的生物学专一性，由此有效的第三代光敏剂也能够开发出来。
在说明书附图中
图1表示在有光和无光情况下，如分子式1的斯夸苷染料的细胞杀伤效率的曲线图。图2表示在有光和无光情况下，通过双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的突变种诱导的曲线图。图3表示在有光和无光情况下，通过双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的突变种诱导的曲线图。图4表示在有光和无光情况下，通过双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的微核诱导的曲线图。图5表示在有光和无光情况下，通过双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的微核诱导的曲线图。
因此，本发明涉及一种如分子式1的较重卤原子取代斯夸苷染料和其药学可接受的衍生物，其中X是较重卤原子。 分子式1在本发明的一个实施方案中，X选自溴或碘。
在本发明的另一实施方案中，如分子式1的化合物是双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷。
在本发明的另一实施方案中，如分子式1的化合物是双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷。
本发明还涉及如分子式1的较重卤原子取代的斯夸苷染料或其药学可接受的衍生物的制备方法，其中X是较重卤原子， 分子式1包括双(2，4，6三羟基苯基)斯夸苷与卤素溶液或卤盐在有机酸中，在50-80℃的温度范围内，在搅拌下反应1-5小时，冷却上述反应混合物，过滤并洗涤所得化合物，接着重结晶得到所需化合物。
在本发明的一个实施方案中，卤盐是一氯化卤。
在本发明的另一实施方案中，有机酸是冰醋酸。
在本发明的又一实施方案中，在过滤和洗涤步骤之前将水加入反应混合物中。
在本发明的再一实施方案中，卤原子选自溴和碘。
本发明还涉及如分子式1的化合物在光动力治疗应用中作为光敏剂的用途。
在本发明的另一个实施方案中，如分子式1的化合物用作肿瘤的荧光检测剂并用在癌及其它有关疾病的光动力治疗中。
本发明还涉及如分子式1的化合物在水消毒中作为敏化剂的用途。
本发明也涉及如分子式1的化合物在通过将其引入化学装置使这种药物靶向于确定的活细胞来设计有效的第三代光敏剂中的用途。
在如分子式1的化合物的制备中，双(2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的芳环用较重卤原子如溴改性以得到双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和用碘改性以得到双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷。
观察到具有斯夸苷部分的结构式为双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的化合物及其药学衍生物在生理pH条件下具有良好的溶解性和表现出很好地进入光动力窗的强吸收(＞600nm)。这些染料在黑暗中是非常稳定且无毒的，并且当暴露于光时表现出良好的细胞杀伤效率。它们进行快速的光漂白并且它们的光降解产物在有光和无光的情况下是无毒的。它们不诱导显著的突变。由于上述斯夸苷基染料具有良好的光物理和生物学性质，这些化合物非常适合作为光敏剂用于光动力治疗和工业应用。
下面的实施例是说明性，因此，它们不应被认为是限制本发明范围的。实施例1双(2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷(Triebs，A；Jacob，K.Angew，Chem.Int.Ed.Engl.1965，4，694)通过在50-60℃搅拌溶液1-3h溶解在冰醋酸中(1∶4.7×103)中。溶液冷却后，溴的醋酸溶液(1∶1.7×102)在1-2h内被逐滴加入，反应混合物在50-60℃加热1-2h，然后在冰箱中保存10-12h。将形成的沉淀物过滤并用75-100ml水洗涤。然后，从水与异丙醇(3∶1)的混合物中重结晶得到75-85％的双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷。
双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的生化性质熔点314-315℃，IR(KBr)νmax3413，1622，726和519cm-1；分子量计算的642.6874；测定的642.6879(HRMS)；UV[20％v/v甲醇-水]λmax610nm(ε47000M-1cm-1)；[甲醇]λmax612nm(ε210000M-1cm-1)；性状深蓝色粉末。实施例2双(2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷(Triebs，A；Jacob，K.Angew，Chem.Int.Ed.Engl.1965，4，694)通过在60℃-70℃搅拌溶液1-2h溶解在冰醋酸(1∶4.7×103)中。冷却后，冰醋酸中的一氯化碘(1∶1.7×102)在1-2h内被逐滴加入。将反应混合物在50-60℃加热1-2h，把15ml的水加入其中，并在冰箱中保存10-12h。将形成的沉淀物过滤，用水(75-100ml)洗涤，并从甲醇与异丙醇(3∶1)的混合物中重结晶得到65-75％的双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷。
双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的生化性质熔点270-271℃；IR(KBr)νmax3383，1603，726和568cm-1；分子量计算的834.6320；测定的834.8360(HRMS)；UV[20％v/v甲醇-水]λmax617nm(ε63000M-1cm-1)，[甲醇]λmax620nm(ε249000M-1cm-1)；性状深蓝色粉末。实施例3由于三线激发态是双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷从532nm激光闪烁光分解研究得到的主要瞬时中间产物，所以，测定了由这些系统产生光敏单线态氧的效率，因为单线态氧是在光动力治疗中II型反应的主要胞毒剂。由于双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的单脱质子化形式有大的三线态收率并有长的寿命(Ramaaiah.D.Joy，A；Chandrasekhar，N；Eldho，N.V；Das，S；George，M.V.Photochem.Photobiol.1997，65，783)，而且这些是所期望在生理pH条件(约7.4)下的主要种类的形式。这些染料在光动力治疗中用作敏化剂的一级特征，我们研究了在药物载体、膜模拟物和微观不均一性介质存在下，它们的单线态氧产生效率。在聚乙烯吡咯烷酮(PVP)存在下，使用双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷所得的结果列于表1中。
表1列出了在存在和不存在聚乙烯吡咯烷酮的情况下双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的单线态氧产生效率。
表1化合物PVP，mM单线态氧量子产率双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷 0 0.13±0.00514 0.29±0.001双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷 0 0.47±0.01714 0.62±0.007该结果显示在由双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷两者敏化的情况中，在PVP存在下，单线态氧的量子产率均显著增加。在双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的情况中，单线态氧的产生效率在微观不均一性介质中比在甲醇中多近15％。另外，这些研究指出较重卤原子取代斯夸苷染料能作为光动力治疗应用中有效的光敏剂。实施例4通过使用质粒DNA(PM2 DNA)和研究在各种条件下的DNA裂解，对斯夸苷体的外光动力活性的机理进行了详细的评估。DNA裂解之后，调控超螺旋(形式I)转变到开环(形式II)和直线形式(形式III)。通过化合物/剂的一种单股断裂的诱导使形式I转变为形式II，以及通过如以前文献(Epe，B.；Hegler，J.J.Methods Enzymol.1994，234，122)所述的DNA弛豫分析对这些形式的定量，表明了它的DNA裂解效率。质粒DNA裂解是非常灵敏的技术，它可以被用于测试敏化剂的各种性质以及通过使用清除剂和活化剂得到的DNA损伤分布型，能用作对损伤有直接责任的物种的一种指纹图谱并且也提供体外光动力活性机理的信息。
在冰上的磷酸盐缓冲液(5mM KH2PO4，50mM NaCl，pH7.4)中的PM2 DNA(10,000bp，10μg/ml)被暴露于斯夸苷染料外加来自距离33cm的1000W卤灯(Philips，PF811)的光线下。改性DNA通过乙醇/乙酸钠沉淀和通过DNA弛豫分析定量单股断裂(SSB)。将超氧物歧化酶(SOD)(20μg/m)、过氧化氢酶(315U/ml)加入或用D2O取代缓冲液中的H2O(最终的同位素纯度大于96％)以便对包含的活性物质有更好的了解。对典型的斯夸苷基染料双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的这些研究结果列于表2中。
表2列出了在有和没有添加剂的情况下，通过双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷使质粒DNA裂解的效率。
表2所列的结果指出，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶对双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷诱导的DNA裂解效率都没有显著影响。因此，在磷酸盐缓冲液(pH7.4)中没有添加剂的情况下观察到的过氧化物和过氧化氢(单股断裂(SSB)的可能数量定为100％。
表2在下列条件下单股断裂的相对数量(％)化合物pH7.0 pH7.8D2O SOD 过氧化氢酶缓冲液 (20g/mL)(315U/mL)双(3，5-二溴- 127±12 105±4 526±28 109±5 115±52，4，6-三羟基苯基)斯夸苷双(3，5-二碘- 134±9109±22 614±97 100±2 92±62，4，6-三羟基苯基)斯夸苷这些物种后来的芬顿(Fenton)反应不包括在DNA裂解中。在D2O中双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷诱导的DNA裂解近5和6倍的增强有力地表明，在这些情况中体外的光动力活性是由单线态氧介导的。实施例5在有光和无光的情况中敏化剂的稳定性信息对于它的实际使用是重要的。因此，通过利用分光光度法测定吸光度变化研究了在有光和无光情况下，在乙醇和磷酸盐缓冲液中，在生理pH条件(pH7.4)下，在25℃时这些染料的稳定性。典型的斯夸苷基染料双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷在黑暗中相对时间的吸光度变化结果列于表3中。
表3列出了双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷在乙醇和缓冲液(pH7.4)中，在黑暗中的稳定性。
表3在黑暗 吸光度中的时 双(3，5-二溴-2，4，6-双(3，5-二溴-2，4，6- 双(3，5-二碘-2，4，6-间，min 三羟基苯基)斯夸苷 三羟基苯基)斯夸苷 三羟基苯基)斯夸苷(乙醇)(缓冲液) (缓冲液)0 1.90 1.84 1.7530 1.88 1.72 1.4760 1.88 1.65 1.3890 1.88 1.61 1.36在黑暗中的结果显示染料双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷在乙醇中非常稳定，但超过90min，在pH7.4缓冲溶液中受到轻微的漂白。双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷在pH7.4缓冲溶液中，在照射条件下所得的结果列于表4中。
表4列出了双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷在缓冲液(pH7.4)中，在照射条件下的稳定性。
表4在黑暗中的时吸光度间，min双(3，5-二溴-2，4，6-三羟双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基苯基)斯夸苷基)斯夸苷0 1.8 1.7251.35 0.87101.30 0.74151.25 0.65201.17 0.58301.10 0.47在照射条件下(1000W卤灯(Philips，PF811)，距离33cm)的结果显示，这些染料表现出显著的光漂白。与双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷(25％)比较，化合物双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷受到很迅速的光漂白(在照射5min内近50％)，在两种情况中光漂白均随照射时间的增长而增加。尽管光漂白可能被认为是在肿瘤光敏剂中不利的性质，但由于可以调节剂量到保持肿瘤中的光敏剂在有效水平，它具有潜在的益处。另外，因为它们的快速光漂白，光动力治疗后的病人不需要长时间呆在黑暗中，并且如果需要，治疗可以短时间间隔频繁地重复。实施例6为了测定有光与无光时斯夸苷基敏化剂的细胞杀伤效率(细胞毒性)，将AS52细胞暴露在各种浓度的敏化剂下，暴露于光是用1000W卤灯，距离33cm，在无Ca2+和Mg2+的PBS(140mM NaCl，3mMKCl，8mM Na2HPO4，pH7.4)中在冰上(106细胞/ml)进行的。照明10min相当于在400和800nm之间的225kJ/m2。细胞通过离心成团并在PBSG中重悬浮三次。细胞在新制介质中以3×104细胞/ml在37℃重悬浮，且细胞数被重复计数60小时。由生长曲线的指数部分(在24和60h之间)，在重悬浮时增殖的细胞数通过外推法计算。细胞存活率定义为增殖与重悬浮细胞之比。用典型的斯夸苷基染料双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷得到的结果示于图1中。
该结果显示，在照明条件下，细胞存活率的百分数随双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的浓度增加而降低，表明它们在这些条件下的高细胞杀伤效率。同时，双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷在黑暗中没有表现出显著的效果，由此表明了它们在无光情况下的无毒性。这些结果清楚地证明了较重卤原子取代斯夸苷染料的光动力治疗应用。实施例7斯夸苷基敏化剂的诱变特性是在AS52细胞中测定的，该AS52细胞携带有细菌的鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(gpt)基因作为赋与对6-硫代鸟嘌呤的敏感性的选择标记。AS52细胞在含有11μg/ml黄嘌呤219μg/ml黄嘌呤、22μg/ml腺嘌呤、1.2μg/ml氨蝶呤和8.8μg/ml霉酚酸的清洁介质中培养一星期，以消除自发gpt突变种。细胞(0.5×106)在回收介质(含1.2μg/ml胸腺嘧啶脱氧核苷、11.5μg/ml黄嘌呤、3μg/ml腺嘌呤)中培养48h，然后，如上所述在有光和无光的情况下，暴露于双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷中，之后培养一星期(表达时间)。在此时间内，保持细胞指数增长。2×105个细胞被稀释在10ml培养介质中和被平铺在皮氏培养皿(94mm)中。2小时后，将6-硫代鸟嘌呤加入到各平皿(终浓度2.5μg/ml)中以选择。将200个细胞加入到5ml培养介质平铺在皮氏培养皿(60mm)中以确定克隆效率。将平皿保温7至9天。用Nacl溶液(0.9％v/v)代替介质。细胞群用甲醇(-20℃)固定15min并用吉姆萨(Giemsa)(10％在H2O中)染色15min。暴露于斯夸苷外加光线后接下来的抗6-硫代鸟嘌呤细胞的定量和细胞毒性的确定(处理和未处理的细胞的平皿培养效率之比)，根据文献(Tindall，K.R；Stankowski Jr.L.F.；Machanoff，R.；Hsie，A.W.Mutat Res.1986，160，121-131)进行。
所得结果示于图2和图3中，它们表明在有光和无光情况下双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷不诱导立即的突变。虽然在有光的情况发现有严重的细胞毒性，但当与黑暗和控制值比较时，未发现自发突变频率的显著增加。实施例8为进一步了解遗传效果，由双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷诱导的微核也在AS52细胞中定量。AS52细胞被如上所述地暴露于斯夸苷中及在全部介质中重悬浮。在39℃培养24小时后，约1×105个细胞通过细胞旋转离心法和用甲醇在-21℃处理1小时被固定在显微镜的载玻片上。在PBS(无Ca2+和Mg2+)中用二苯并二酰亚胺(bisbenzimide)染色3min后，用荧光显微镜检测了2000个细胞的微核存在。所得结果示于图4和图5中，它们表明这些染料没有诱导大量的微核。
本发明的斯夸苷基染料具有用于光动力的治疗和工业应用中的光敏剂的令人满意的性质。这些系统的主要优点包括1.以双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷结构为代表的斯夸苷基敏化剂是纯的单一物质。
2.它们的合成工艺是经济的。
3.它们在黑暗中十分稳定并且在膜模型和载体系统存在时其稳定性增加。
4.它们在生理pH条件下的缓冲液中有非常好的溶解性，因此，药物制剂能够通过本身的传统工艺来制备并避免使用添加剂和载体。
5.它们具有良好的吸收性质(＞600nm)及很大的吸收系数，(约100,000M-1cm-1)6.它们具有好的长寿命的三线态收率并且在膜模型和载体系统中以定量收率产生单线态氧。
7.它们在黑暗中无毒而且当暴露于光时显示出良好的细胞杀伤作用，如所希望的理想的光敏剂一样。
8.它们受到快速的光漂白，因此，光动力治疗后的病人不需要长时间呆在黑暗中，并且如果需要，治疗可以短时间间隔频繁地重复。
9.在有光和无光情况下，它们的光降解副产物是无毒的。
10.这些染料的光动力活性在暴露于光下5min内是最大的，因此，用于治疗需要非常短的照射时间间隔。
11.它们是非诱变的。
12.它们可以被有效地用于靶向于确定的细胞器的第三代光敏剂的合成。
权利要求
1.一种如分子式1的较重卤原子取代斯夸苷染料及其药学可接受的衍生物， 分子式1其中X是较重卤原子。
2.如权利要求1所述的染料，其中X选自溴或碘，且分别以双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷为代表。
3.一种如分子式1的较重卤原子取代斯夸苷染料或其药学可接受的衍生物的制备方法，其中X是较重卤原子， 分子式1该方法包括双(2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷与卤素溶液或卤盐在有机酸中，在50-80℃的温度范围内，在搅拌下反应1-5小时，冷却以上反应混合物，过滤并洗涤所得化合物，接着通过重结晶得到所需化合物。
4.如权利要求3所述的方法，其中的卤盐是一氯化卤。
5.如权利要求3所述的方法，其中的有机酸是冰醋酸。
6.如权利要求3所述的方法，其中在过滤和洗涤步骤前将水加入反应混合物中。
7.如权利要求3所述的方法，其中的卤原子选自溴和碘。
8.如分子式1的化合物在光动力治疗应用中作为光敏剂的用途。
9.如分子式1的化合物在癌和其它相关疾病的光动力治疗中作为肿瘤荧光检测剂的用途。
10.如分子式1的化合物在水消毒中作为敏化剂的用途。
11.如分子式1的化合物在通过将其引入化学装置以使这样的药物靶向于确定的活细胞而设计有效的第三代光敏剂中的用途。
全文摘要
本发明涉及如下面分子式1的较重卤原子取代斯夸苷基染料及其药学可接受的衍生物,以及其制备方法,其中X是较重卤原子,它们可被用于光动力的治疗和工业应用中。
文档编号C09B13/00GK1361205SQ0013729
公开日2002年7月31日 申请日期2000年12月29日 优先权日2000年12月29日
发明者拉迈亚·达纳博伊纳, 阿伦·泰扎特威蒂尔·卡利亚特, 苏雷什·达斯, 贝恩德·埃佩 申请人:科学工业研究院