R4)的表达进行测试。通过rBht氨基端结构域和/或强9. 3kDa a MF prepro序列进行的适当改良的基因组合的染色体整合获得稳定的重组毕赤酵母GS115菌 株。将rBht和scFvl3R4基因组合插入到AOXl启动子的下游，其后是羧基端6XHIS标签， 以辅助检测和纯化图8A和图8D(参见材料和方法部分）。
[0156] 用相比于在a MF分泌信号（GS115: : a MF-rBht-HIS)之前的全长rBHT-HIS的表 达（0· 49 μ g. ml-1)蛋白分泌增加超过19倍（9. 80 μ g. πιΓ1)的的强a MF prepro分泌信号 (GS115: : a MF-rBht(23_594)-HIS)代替先导信号（氨基酸1至22)(图8B)。类似地，在不存 在aMF的条件下，先导信号能够指示用于分泌的异种蛋白（GsilS^rBht-HISMeJSyg. πιΓ1)。另外，在不存在aMF和先导信号（GS115::rBht(23_ 594)-HIS)的条件下检测蛋白分泌 (4. 65 μ g. πιΓ1)，这表明典型先导和非典型分泌信号含有革巴向于分泌的蛋白形成。
[0157] 如上文所述，为了验证氨基端结构域，靶向于分泌途径的蛋白，我们选择了抗 体scFvl3R4,其是不含信号序列的胞内蛋白。图（8C)中示出了抗体scFvl3R4嵌合体 的图示。当通过GS115::scFvl3R4-HIS(缺少先导分泌信号）表达scFvl3R4-HIS时， 能够通过SDS-PAGE银染色或Western印迹分析在培养物肉汤培养基中进行检测（数 据未示出）。显示了当将scFvl3R4融合于Bht典型先导分泌信号（25. 17 μ g. ml-1) 时或融合于 Bht 非典型信号（7· 03 μ g. ml-1)时 GS115: :rBht(1_11Q厂scFvl3R4-HIS 或 GS115: :rBht(23_11Q)-scFvl3R4-HIS 的分泌 scFvl3R4-HIS。同样，如与 BHT-HIS 所见，分泌由 a MF 驱动，（GS115: : a MF-scFvl3R4-HIS)提供了最高水平的分泌的蛋白（91. 02 μ g. πιΓ1)。
[0158] 通过毕赤酵母GSl 15表达的rBHT-HIS的酶活性和Western印迹分析。为了证实 与酶活性相关的蛋白表达，利用ONP-Glu作为底物测量了分泌的和膜结合的rBHT-HIS活性 (参见材料和方法部分）。以可检测量分泌rBHT-HIS的所有重组菌株和活性的值反映了分 泌蛋白的增加。GS115: : a MF-rBht (23_594)-HIS分泌的蛋白显示出3. 7mU. OD-1的酶活性，其比 当分泌由完整氨基端区域（氨基酸1-110)驱动时的酶活性）（GS115: :rBht-HIS(0. 63mU. OD4))高6倍。类似地，GS115:: aMF-rBht(23_594)-HIS分泌的蛋白的测量酶活性比获自含有 a MF和先导信号的重组体的酶活性高53倍（GS115: : a MF-rBht-HIS(0. 07mU. OD4))。重组 GS115: :rBht(23_594)-HIS(0. 26mU. OD-1)显示出减少量的活性分泌酶（表 8)。
[0159] 还对每种重组体的静止细胞表现出的膜结合酶的活性进行了测试。我们发 现，活性值与总分泌蛋白有关，相比于GSl 15: : a MF-rBht-HIS (I. 48mU. 0D-1)，针对菌 株GS115: : a MF-rBht (23_594) -HIS (21· 52mU. OD-1)其显示出15-倍增加的膜结合活性，以 及对于菌株GS115::rBht-HIS(1.94mU. OD4)显示出1.3倍倍增加的膜结合活性。重组 GS115: :rBht(23_594)-HIS(0. 15mU. OD4)显示出减少量的膜结合酶，这证明了这种重组通过推 定的非典型分泌途径重定向了蛋白。总体上，这些结果示出了 aMF和BHT先导分泌信号都 不能完全完成rBHT-HIS的分泌，其可能与预测在氨基酸177至199之间存在跨膜区有关。
[0160] 利用抗-HIS抗体进行的无细胞提取物的Western印迹分析证实了 GS115: : a MF-rBht (23_594) -HI S、GS115: : rBht-HI S 和 GS115: : rBht (23_594) -HI S 分泌的蛋白值 (图9A)。在每一种情况下，存在对应于分子量大约为IlOkDa的明显的rBHT-HIS条带。这 些结果与之前报道的SDS-PAGE和尺寸排阻色谱迀移模式相同（Dagher, Azcarate-Peril 和 Brun〇-B<ircena)。 获自 GSl 15 : : a MF_rBht(23_594)-HIS、GSl 15 : : rBht-HIS 和 GS115: : a MF-rBht-HIS的细胞提取物的Western印迹分析还显示出分子量约为llOkDa，而 GS115: : rBht(23_594)-HIS显示出在98和64kDa之间具有明显的条带，这可能指示胞内降解或 可替代的糖基化方式（图9B)。
[0161] rBHT水解活性。另外，我们分步测试了针对来自GS115:: aMF-rBht(23_594)_HIS and GS115:: aMF-rBht(23_594j^HIS-加标签的和非-HIS加标签的蛋白的分泌酶。该酶 带来相当的结果并且在宽的温度（10至50°C )和pH值（2. 8至6)范围内是活性的。在 pH 3. 6至5观察到最大活性（最大活性的91至100% )之后稳定下降至pH2. 6 (最大活 性的43% )和达到pH 6. 8 (最大活性的29% )。同样，在40至45°C的范围内发现最优温 度（最大活性的97至100% )，但在温度高于50°C和低于20°C时快速下降（低于最大活性 的的25% )(数据未示出）。该酶在4°C下在50mM磷酸钠缓冲液（pH 5)中保持稳定至少 6个月并且活性不会受到于_80°C下储存的影响。由Hill等式（酶在42°C pH 4下的Km 0.79禮和￥11^13.97111111〇1.111^711^1)获得65115::(1]^-池1^( 23_594厂!115分泌的酶的动力学 常数的值。这些发现与我们和其他人之前所报道的一致（Blakely和Mackenzi 1021-25; Cho，Shin，和Bucke2107_ll ;Gorin，Phaff,和Spencer 1341-44 ;Gorin，Spencer,和Phaff 2307-17 ;Ishikawa 等人 331-39 ;Sakai 等人 285-93 ;Shin, Park,和 Yang 787-92 ;Shin 和 Yang484_89 ;Dagher, Azcarate-PeriI,和 Bruno-Bdircena) 〇
[0162] rBHT稳定性。为了检验酶的长期稳定性，在含有2%葡萄糖缓冲液中诱导所 有新鲜诱导的重组菌株，并随时间测量膜结合的和分泌的rBHT的水解活性。通过典 型或非典型分泌途径获自所有重组体的分泌的rBHT-HIS在一周的测试期内仍然是稳 定的并且保留95 %的初始活性。当用GS115: : a MF-rBht-HIS、GS115: :rBht-HIS和 GS115: : a MF-rBht(23_594)-HIS表达含有膜相关的酶的静止细胞时，观察到相同的稳定性。然 而，当测试含有用GS115: :rBht(23_594)-HIS表达的膜相关酶时，活性在24小时内开始下降， 这指出了可替代的非典型分泌途径。
[0163] 由GS115: : a MF-rBht (23_594) -HI S产生的rBHT-HI S的纯化和表征。利用镍亲和 层析来纯化GSl 15: : a MF-rBht(23_594)-HIS表达的rBHT蛋白。在羧基端替代6XHIS标 签成功使得超过73%的原始酶活性的单步骤回收并且在SDS-PAGE之后观察到大约 IlOkDa的单个多肽条带（图9C)。从培养物上清的6. 54倍蛋白纯化回收了 7. 24mg的 酶，这使得在42 °C和pH 4的比活性为18. Αδπιυ.π^Η表9)。此外，遵循相同的方法，我 们纯化了不同重组体分泌的rBHT-HIS并且发现相当的比活性范围为18. 45至18. 65mU. mg' GS115: : a MF-rBht (23_594) -HI S分泌的多肽的氨基端序列的确定显示出，除了含有两 个另外的氨基端氨基酸（E-A-V-X-Y残基）的产物之外，在肉汤培养基中还存在完整的 rBHT(23_594)-HIS蛋白（V-X-Y-P-G残基）。分泌期间氨基酸A-E剪切的可变性受到附近氨基 酸序列和四级结构的影响（Cereghino和Cregg 45-66)。其余的非典型序列不会引入新的 剪切位点。
[0164] HI S标签对rBHT转移酶活性的影响。重组体GS115: : a MF-rBht (23_594) -HI S和 GSl 15: : a MF-rBht(23_594)被进一步用于比较性评价HIS标签的存在是否会影响由乳糖合成 G0S。由含有220gL-l初始乳糖、0. 5U rBHT g-1乳糖并在30°C孵育的反应混合物通过HPLC 来定量分析GOS累积。
[0165] 图IOA显示出当通过6XHIS加标签的或未加标签的分泌酶对话反映时随时间的 比较GOS累积和乳糖消耗。在两种情况下，在半乳糖基-乳糖作为主要产物的最初25小 时期间观察到最大生产速率。在125小时后证实了之前所述的酶促竞争性葡萄糖抑制，半 乳糖基-乳糖（758171)累积从利用的60%初始乳糖保持不变达到平均67%转化（Dagher、 Azcarate-Peril 和 Bruno-Bdircena) 〇
[0166] 当利用表达膜相关的HI S和非-HI S加标签的rBHT静止细胞时，也证实了最 时间的相当GOS累积和乳糖消耗。（图10B)示出了羧基端HIS的存在不会影响半乳糖 基-乳糖形成的初始反应速率（1.87和lJg.L'tr1)。如之前所报道了，毕赤酵母的静 止细胞消耗葡萄糖，而半乳糖被用于合成G0S(68 %产率（g/g))，其接近理论产率75 % (Dagher, Azcarate-Peri 1，和 Bruno-Bdircena) 〇
[0167] 6. 6. 4 讨论
[0168] 益生元是作为功能性食品上市销售并且积极地促进改善消费者健康的碳水化 合物衍生物，其意在具体刺激肠内有益细菌的生长。驱动益生元发展的基本力是以较低 的操作成本实现更高效生产的承诺。然而，通过化学方法生产或合成碳水化合物衍生 物是复杂的并且由于存在若干类似反应性的羟基而需要保护和脱保护步骤（Sears and Wong 2344-50)。因此，酶促方法的发展具有实际意义并且基因修饰已经被广泛用于改 进酶活性，从而获得对于酶促机制的更深入理解，并增加蛋白分泌。指定用于分泌的蛋白 通常位于20 - 30个氨基酸的氨基端先导信号之后并且最终用膜结合信号肽酶进行的处 理（Von Heijne 17-21)。毕赤酵母蛋白分泌受到初始核苷酸序列性质以及偶尔需要密 码子最优化的影响，以及还要考虑糖基化方式、最终3-维结构、培养条件和培养基组合物 (Damasceno, Huang, and Batt31_39)。另外，先导结构域中带电荷氨基酸的分步在簇集膜和 分泌的蛋白的定位方面起到重要作用（Boyd和Beckwith 1031-33)。
[0169] 如之前所报道的，毕赤酵母在rBHT表达方面具有优于大肠杆菌的优点，这是由 于其能够有效地结合翻译后修饰，使得能够异种生产少量的生物活性rBHT。BHT的计算 机分析表明，这种酶含有待研宄的跨膜结构域以增加毕赤酵母的酶分泌。BHT独特蛋白 区（1-110个氨基酸）含有预测起到典型先导信号（BHT(1_22))和非典型分泌信号结构域 (BHT(23_11CI))作用的两个结构域。典型先导信号还靶向于该蛋白以在细胞膜处实现其功能 (如通过RHYTHM方法和亲水性预测的，图1)。尤其是，在第17位存在碱性氨基酸（例如精 氨酸）能够影响分泌效率和蛋白在膜中的取向（图1)。
[0170] 本文中披露的数据显示，GS115: : a MF-rBht-HIS由于同时存在a MF和 先导信号（ΒΗΤ(1-22))而会干扰蛋白分泌。蛋白分泌的水平与之前所报道的 GSl 15: : a MF-HIS-TEV-rBht 的值相当（Dagher, Azcarate-Peril,和Bruno-Bdircena)。另一 方面，分泌蛋白的较高累积是通过分别缺少aMF或BHT (1-22)的重组体GSl 15: :rBht-HIS 和GSl 15: : a MF-rBht(23_594)-HIS获得的。因此，表明该先导信号结构域（BHT (1-22))涉 及与aMF相当的信号肽-介导的机制（典型分泌途径）。相比于含有两个先导序列的 GS115: : a MF-rBht-HIS，两种先导信号独立地能够增加膜相关的和分泌的rBHT的蛋白表 达。分泌的（增加50倍）和膜结合（增加14倍）生物活性rBHT蛋白的最佳值是通过重 组 GS115: : a MF-rBht(23_594)-HIS(表 3)获得的。GS115: : a MF-rBht(23_594)-HIS 表达的生物 活性蛋白的随后纯化获得非常纯的蛋白，该纯化以of 18. 45U. 1的比活性通过SDS-PAGE 进行（表4)。rBHT的分子量（IlOkDa)不会在细胞膜相关的rBHT和分泌的rBHT之间发生 偏离（deviate)，并且相比于来自我们之前研宄的rBHT (Dagher等人，2013)，显示出相似的 酶活性、热稳定性、可再用性和储存稳定性。
[0171] 我们期望除去两个先导结构域（BHT(1_22))且aMF会阻碍酶分泌。然而，除去aMF 和BHT(1_22)仍显示出少量的分泌蛋白。还证实了 110个氨基酸独特区含有双重功能，先导结 构域BHT(1_22)通过该功能起到有效分泌信号（典型分泌途径）的作用并且预测的BHT (23_110) 结构域可作为可替代的分泌信号（非典型分泌途径）操作。Western印迹分析显示，蛋白质 水解表明在细胞中蛋白敏感性增加。大多数测得的水解活性被检测为最大质量IlOkDa下 方的多个条带，有可能影响分泌酶的量（图9A-9C)。我们推测信号序列在分泌期间可能通 过在分泌途径中使蛋白质保持远离蛋白酶而起到保护蛋白质的作用。
[0172] 尽管GS115: : a MF-rBht (23_594)-HIS分泌了较大量的蛋白质，但大量的蛋白质仍稳 定结合于膜，这可能是由于蛋白羧基端结构域中的跨膜结构域（氨基酸177-199)的存在使 膜中的预测流动相有限。因此，为了证实这些结构域作为辅助信号的生理学功能，我们通过 用抗体scFv 13R4蛋白代替rBHT (23_594)结构域而产生了新的蛋白嵌合体。BHT (1_i 1Q)典型先导 序列之后是推定的非典型先导序列、BHT(23__推定的非典型先导序列、以及aMF结构域，其 位于具有scFv13R4的氨基端部分的框架中。这些新的重组体的分析能够证实通过引导抗 体分泌带来的先导辅助功能。我们的结果证实了信号序列的选择显著影响蛋白（包括重组 BHT和scFvl3R4)的生产和分泌水平。值得注意的是，相比于a MF(66个氨基酸），新的较 小先导信号（22个氨基酸）具有尺寸优势，并且在本文中已被证明是新的独特序列，能够直 接分泌异种蛋白。这种先导信号结构域加入了新的特征，其能够构建成新的胞内酶，需要利 用机械方式破坏或通过化学处理透化才能提取（Panesar等人530-43)。
[0173] BHT的持续分子开发将有助于解决食品工业中有关于具有新性质的酶的问题，例 如热活性、低温稳定性可特定低聚糖的合成。本发明的发现激发了进一步的结构分析的积 极性以阐明归因于糖基化转移活性和底物特异性的特征。催化位点的突变形成和基于3D 结构的合理突变形成将为用于作为益生菌候选物的新型GOS的生产的底物特异性的改变 铺平道路。
[0174] 表7.本研宄中使用的菌株和质粒
[0175]
[0177] aa MF，在pPIC9载体中发现的啤酒酵母α -交配因子分泌信号。
[0178] 表8.毕赤酵母的不同重组体分泌的和膜结合rBHT-HIS酶活性
[0179]
[0180] 表 9.毕赤酵母 GS115: : a MF-rBht(23_594)-HIS 分泌的 rBHT-HIS 的纯化
[0181]
[0182] a，在BMGY肉汤培养基中在28 °C生长的1升培养物
[0183] b,通过Bradford分析确定的蛋白浓度
[0184] c，比活性，表示为总活性⑶除以总蛋白（mg)
[0185] d，镍层析纯化之后的总单位
[0186] e，镍层析纯化之后的总蛋白（mg)
[0187] f，镍层析纯化之后的比活性，表示为总活性（U)除以总产量（mg)
[0188] g，比活性的增加
[0189] h,产量，表示为镍柱层析之后的总活性除以肉汤培养基中的总活性
[0190] 6. 7第6. 6节的参考资料
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