RNA进行扩增时的GAPDH mRNA扩增曲 线（实施例1)。
[0052] 图5表示对通过下述方法得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果，所述方法 为：作为引物及探针，使用（A)表8所示的序列组（sequence set)(序列组B)、及使用（B) 表9所示的序列组（比较组（comparative set))，分别实施一步式RT-PCR法（其中同时对 WTl mRNA 和 GAPDH mRNA 进行扩增）。
【具体实施方式】
[0053] (I)对人WTl mRNA的表汰量讲行宙量的方法
[0054] 本发明的方法是使用一步式RT-PCR法对人WTl mRNA的表达量进行定量的方法。
[0055] 如前所述，作为本发明的测定对象的WTl基因，是被鉴定为小儿肾母细胞瘤 致病基因的、含有3037bp的基因，其已在NCBI中作为"Homo sapiens Wilms tumor I (WTl) ,transcript variant D, mRNA" 被登记（ΝΜ_024426· 4)。其喊基序列不于序列表中 的序列号1。
[0056] 在本发明方法中作为测定对象的被测试样，只要含有上述人WTl mRNA，则没有特 别限定，例如，可以使用通过已知方法对可能含有WTl mRNA的试样（来自人的细胞、组织、 血液、痰液、粪便、尿等的生物试样等）进行处理而得到的总RNA试样或mRNA富集的试样 等。RNA试样可以以水溶液的形式使用，或者在吸附或固定化于适当的固相（solid phase) 上的状态下进行使用。作为总RNA量，每100 μ L反应液含0.0 lng~1 μ g是合适的。
[0057] 持家基因 （housekeeping gene)是指与细胞分化无关地在任何细胞中均始终表达 的、虽不发挥特殊功能但具有这些细胞存活所必需的作用的基因，例如，可举出编码RNA合 成酶、能量代谢酶（energy metabolizing enzymes)、核糖体蛋白质、细胞骨架蛋白质等的 基因。具体地，可举出编码GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、β-肌动蛋白、β2-微球蛋白、HPRTl(次黄嗓呤磷酸核糖转移酶1， hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1)等的基因。用于本发明中的持家基因，优选 为在利用RT-PCR的扩增中不与作为测定目标的人WTl基因竞争的基因，例如，优选为与人 WTl基因的碱基序列同源性低的序列。上述持家基因优选为GAPDH基因。
[0058] GAPDH 基因是作为 "Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)，mRNA"被登记在NCBI中的基因（NM_002046. 3)。其碱基序列示于 序列表中的序列号2。
[0059] 作为本发明中一步式RT-PCR法（逆转录反应及延伸反应）所使用的反应缓冲液， 为适于使具有逆转录活性的酶显示活性的水溶性缓冲液即可，例如，可举出PH7~10、优选 pH8~9的缓冲液，例如Tris缓冲液。此外，该缓冲液中还含有对具有逆转录活性的酶或 DNA聚合酶的活性而言为必需的各种离子。其中，Na离子、K离子可以以盐的形式、以5~ 50mM的浓度被添加。Mg离子可以以盐的形式、以1~IOmM的浓度被添加。另外，根据需要， 也可以配合表面活性剂、牛血清白蛋白（BSA)、明胶等对具有逆转录活性的酶或DNA聚合酶 的活性具有促进作用或稳定化作用的试剂。此外，为抑制试样中的RNA及RNA竞争物的分 解，可以添加核糖核酸酶抑制剂。
[0060] 作为具有逆转录活性的酶，可举出源自禽类成髓细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus)的逆转录酶（AMV)、源自劳斯肉瘤相关病毒（Rous-associated virus)的逆转录酶（RAV2)、源自莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus) 的逆转录酶（MMLV)、源自嗜热栖热菌（Thermus thermophilus)的DNA聚合酶（Tth)、源自热 坚芽孢杆菌（Bacillus caldotenax)的DNA聚合酶（Bca)及前述各酶的衍生物，其中，Tth 最适合于本发明。作为Tth，可具体举出作为源自嗜热菌种Z05 (Thermus species Z05)的 热稳定性酶（thermostable enzymes)的DNA聚合酶。需要说明的是，这些酶可以从其本来 的来源（original sources)纯化获得，也可以是以基因工程方式生产的重组蛋白质。
[0061] 反应液中添加有在cDNA合成及PCR中成为底物的4种三磷酸脱氧核苷酸（dATP、 dCTP、dGTP、dTTP ;本说明书中也将此4种统称为"dNTP"）。另外，dNTP的全部或一部分在 从引物合成的DNA链能延伸的范围内可被替换为经修饰及/或经标记的dNTP。
[0062] 在本发明中作为用于从靶RNA合成cDNA(逆转录反应及延伸反应）的引物，是具 有至少与靶RNA的碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸，并且必须能在所采用的反应条件 下退火到靶RNA上。作为寡核苷酸的长度，可举出6~100个核苷酸，优选为10~30个核 苷酸。另外，也可以使用经修饰及/或经标记的引物。该引物可通过例如已知的方法化学 合成。另外，PCR中使用的引物必须至少能使以来自靶RNA的cDNA为模板的DNA扩增得以 进行。为此，该引物是具有至少与模板cDNA的碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸，并且 必须能在所采用的反应条件下退火到该cDNA上。优选地，所述寡核苷酸既在上述从靶RNA 合成cDNA (逆转录反应及延伸反应）的过程中作为引物起作用，还在以cDNA为模板的DNA 扩增中作为引物起作用。
[0063] 作为适用于将本发明的目的基因即人WTl mRNA逆转录为cDNA、并进行延伸、扩增 的引物组，可举出包括下述表1中所示的（Al)正向引物及（A2)反向引物的引物组A，以及 包括表2中所示的（BI)正向引物及（B2)反向引物的引物组B。另外，表1及表2中还一 并示出了用于检测利用前述引物组扩增得到的人WTl基因扩增产物的序列特异性结合探 针（(A3)探针、（B3)探针）。需要说明的是，为使扩增产物的检测容易进行，上述探针优选 为经标记的。
[0064] 另外，作为适用于将GATOH mRNA(其可合适地用作本发明方法中的持家基因）逆 转录为cDNA、并进行延伸、扩增的引物组，可举出包括下述表1中所示的（al)正向引物及 (a2)反向引物的引物组A，以及包括表2中所示的（bl)正向引物及（b2)反向引物的引物 组B。另外，表1及表2中还一并示出了用于检测利用前述引物组扩增得到的人GAPDH基因 扩增产物的序列特异性结合探针（(a3)探针、(b3)探针）。需要说明的是，为使扩增产物的 检测容易进行，上述探针优选为经标记的。
[0065] 探针的标记方法有RI法和非RI法，优选使用非RI法。非RI法可举出荧光标记 法、生物素标记法、化学发光法等，优选使用荧光标记法。作为荧光物质，只要能够与核酸的 碱基部分结合，则没有特别限定，可以使用花菁染料（Cy DyeTM系列的Cy3、Cy5等）、罗丹 明 6G 试剂、N-乙酰氧基-N-2-乙酰氨基荷（N-acetoxy-N-2-acetylaminofluorene)及其 碘衍生物等。
[0066] [表 1]
[0067] 序列组A
[0068]
[0069] 表示人WTl基因（NM_024426. 4 :序列号1)的区域。
[0070] 表示人GAPDH基因（NM_002046. 3 :序列号2)的区域。
[0071] [表 2]
[0072] 序列组B
[0073]
[0074] 表示人WTl基因（NM_024426. 4 :序列号1)的区域。
[0075] 、表示人GAPDH基因（NM_002046. 3 :序列号2)的区域。
[0076] 本方法中使用的RNA标准品可通过已知的方法制作。例如，可参照"Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，第 87 卷，第 2725 ~2729 页（1990) '"Clinical Chemistry (Clin. Chem.)， 第41卷，第819~825页（1995) "、"Blood，第82卷，第1929~1936页（1993) "等中的记 载进行制作。
[0077] 具体而言如下所述。向作为扩增对象的双链DNA序列加上作为RNA合成酶（例如 T7RNA聚合酶等）的反应起点的启动子序列，制成作为RNA合成模板的DNA序列。向反应容 器内加入RNA聚合酶、含有RNA启动子序列的双链DNA、核苷三磷酸，于37 °C反应30分钟~ 2小时，由此合成与RNA启动子下游的模板DNA互补的单链RNA。
[0078] 作为本发明中使用的一步式RT-PCR法的反应操作及反应条件，没有限制，可列举 如下。
[0079] 向反应容器内加入含有例如cNTP、Mg盐、核糖核酸酶抑制剂、具有逆转录活性的 酶、引物等的反应液，在反应开始前于4°C以下冷藏。向该反应容器中添加可能含有欲测定 的人WTl mRNA的被测试样及持家基因（例如GAPDH mRNA)，以温度为50~70°C (优选为 55~65°C )、时间为2~30分钟左右（优选为2~10分钟左右）的条件多次反应，从而合 成cDNA (逆转录反应）。接着，于90~99°C加热10秒~2分钟左右，使RNA-cDNA复合体 变性（热变性）。进而，实施2~50个的下述温度反应循环，由此扩增来自靶RNA的DNA片 段，每个温度反应循环由90~99 °C下的热变性、45~65 °C下的退火反应、以及60~80 °C 下的DNA延伸反应构成。另外，为提高灵敏度及/或特异性而实施嵌套式PCROiested PCR) 时，可以将用于第1阶段、第2阶段的PCR的引物从开始时就一起添加进反应容器，连续地 实施两个阶段的PCR。在该情况下，用于第1阶段PCR的引物量必须要少于用于第2阶段 PCR的引物量，前者优选为后者的1/100以下。
[0080] 根据上文说明的本发明方法，不仅可以通过在同一容器内进行的一步式RT-PCR 法来简便地测定人WTl mRNA的表达量，并且还能够以比两步式RT-PCR法（其中分开实施 目的基因的RT-PCR和持家基因的RT-PCR)更高的灵敏度来检测人WTl mRNA的表达量（如 实施例2所示）。换言之，根据本发明的方法，即使是对人WTlmRNA表达量为低浓度的试样， 也能够进彳丁尚精度检测。
[0081] 该方法可以通过使用下文说明的实时PCR试剂盒来简便实施。
[0082] (II)用于对人WTl mRNA表汰量讲行宙量的实时PCR用试剂盒
[0083] 本发明的RT-PCR用试剂盒的特征在于，包含用于对人WTlmRNA进行RT-PCR法的 引物组、和用于对持家基因（优选为GAPDH mRNA)进行RT-PCR法的引物组两者。该试剂盒 还可以含有用于对通过RT-PCR法扩增得到的人WTl mRNA的扩增产物及持家基因