的扩增产 物进行检测的探针。
[0084] 作为试剂盒的一个例子，可举出下述试剂盒，所述试剂盒包含：包含表1所示的 " (Al)正向引物（序列号3)"及"(A2)反向引物（序列号4)"的引物组A(其为用于对人 WTl mRNA进行RT-PCR法的引物组），及表1所示的"(A3)探针（序列号5)"（其为用于对 使用前述引物组扩增得到的人WTl基因扩增产物进行检测的序列特异性结合探针）；并且， 所述试剂盒包含：包含表1所示的"（al)正向引物（序列号6)"及"（a2)反向引物（序列 号7)"的引物组A(其为用于对人GAPDH mRNA(其可合适地用作持家基因）进行RT-PCR法 的引物组），及表1所示的"（a3)探针（序列号8) "（其为用于对使用前述引物组扩增得到 的人GAPDH基因扩增产物进行检测的序列特异性结合探针）。
[0085] 需要说明的是，为使扩增产物的检测容易进行，探针优选为经标记的。
[0086] 探针的标记方法有RI法和非RI法，优选使用非RI法。非RI法可举出荧光标记 法、生物素标记法、化学发光法等，但优选使用荧光标记法。作为荧光物质，只要能够与核酸 的碱基部分结合，则没有特别限定，可以使用花菁染料（Cy DyeTM系列的Cy3、Cy5等）、罗 丹明6G试剂、N-乙酰氧基-N-2-乙酰氨基芴及其碘衍生物等。
[0087] 作为试剂盒的另一个例子，可举出下述试剂盒，所述试剂盒包含：包含表2所示的 "（BI)正向引物（序列号9)"及"（B2)反向引物（序列号10)"的引物组B(其为用于对人 WTl mRNA进行RT-PCR法的引物组），及表2所示的"（B3)探针（序列号11)"（其为用于对 使用前述引物组扩增得到的人WTl基因扩增产物进行检测的序列特异性结合探针）；并且， 所述试剂盒包含：包含表2所示的"(bl)正向引物（序列号6)"及"（b2)反向引物（序列 号12) "的引物组B (其为用于对人GAPDH mRNA(其可合适地用作持家基因）进行RT-PCR 法的引物组），及表2所示的"（b3)探针（序列号8) "（其为用于对使用前述引物组扩增得 到的人GAPDH基因扩增产物进行检测的序列特异性结合探针）。
[0088] 本发明的RT-PCR用试剂盒，除含有上述成分以外，还可以含有逆转录反应与PCR 这两种反应所必需的各种成分（dNTP、Mg盐、用于调节pH的缓冲成分等）、和具有逆转录活 性的酶。此外，也可以添加用于使酶稳定的成分、核糖核酸酶抑制剂等。
[0089] 取必要量的上述反应液至适当的反应容器中，添加待测定的试样，由此即可开始 反应。因此，可以简便地实施对人WTl mRNA表达量的定量。特别地，在对多份被测试样进 行人WTl mRNA表达量的定量时是有用的。另外，通过预先准备好已分注有单次所需量的该 反应液的反应容器，可以进一步改善操作效率。按照上述方法，本发明的RT-PCR用试剂盒 可以简便、迅速地对人WTl mRNA的表达量进行定量，且不存在交叉污染问题。作为该试剂 盒，可举出含有用于上述方法的各种试剂的试剂盒、含有上述本发明所使用的反应液的试 剂盒、含有分注有单次分量的该反应液的反应容器的试剂盒等。该试剂盒作为各种检查用 的试剂盒、尤其是临床诊断用的试剂盒是特别有用的，可以广泛应用于白血病的检查、实体 癌微小转移的检查、微小残留病灶的检查、感染症的检查等。
[0090] 实施例
[0091] 以下给出实施例，更详细地说明本发明。但是，本发明并不限于这些实施例。
[0092] 「实施例1l
[0093] 一步式多重RT-PCR的测宙
[0094] (1)引物和探针的设计
[0095] 以人WTl mRNA作为测定对象的目的基因，选择GAPDH mRNA作为对测定对象的表 达量进行校正的内源性对照基因（校正基因），设计并合成能对各基因进行特异性扩增和 检测的引物组及探针。
[0096] 为了同时对目的基因（人WTI mRNA)和校正基因 （GAPDH mRNA)进行检测，如下制 备了荧光标记探针。即，用FAM(6-羧基荧光素）对用于检测目的基因的探针的5'末端进 行标记，用HEX(6-六氯荧光素）对用于检测校正基因的探针的5'末端进行标记。另外，使 用ATT0-540Q(ATT0-TEC GmbH公司）作为淬灭染料（quenching dye)，对各探针的3'末端 进行标记。
[0097] 本实施例中使用的引物及探针的序列示于表3。
[0098] [表 3]
[0099]
[0100] (2)标准品（m mRNA、GAPDH mRNA)的制各
[0101] 如下所述制备标准品。从表达WTI mRNA及GAPDH mRNA的白血病细胞株K562中提 取RNA，以该RNA为模板，使用与WTlmRNA的碱基序列互补的引物及与GAPDH mRNA的碱基序 列互补的引物实施RT-PCR，由此得到WTl mRNA及GAPDH mRNA的一部分碱基序列。将得到 的WTl mRNA序列及GAPDH mRNA序列克隆进pT7bIue质粒载体，并对大肠杆菌DH5a株进行 转化。然后，对该经转化的大肠杆菌进行培养，提取质粒DNA。使用限制性内切酶EcoRI对 质粒DNA中位于插入了 WTl mRNA序列及GAPDH mRNA序列的部分之后的序列进行切断，得 到直链状DNA。使用T7RNA聚合酶（其识别质粒DNA所含有的T7启动子序列，以DNA为模 板合成RNA)合成WTl mRNA及GAPDH mRNA的RNA序列。使用TE缓冲液（其中含有50ng/ μ L的大肠杆菌转运RNA)对合成的RNA进行稀释以防止其对反应容器的非特异性吸附，由 此制备各基因（WT1及GAPDH)的RNA标准品。
[0102] 将如上所述制备的WTl RNA标准品的浓度调整为2. δΧΙΟ1』. 5Χ102、2. 5Χ103、 2. 5 X 104、2. 5 X IO5个拷贝/测试。将GAPDH RNA标准品的浓度调整为I. 0 X 10 4、I. 0 X 105、 1.0 X 106、1.0 X 107、1.0 X IO8个拷贝 / 测试。
[0103] (3) RT-PCR 反应
[0104] 使用一步式RT-PCR法进行RT-PCR，所述一步式RT-PCR法中，逆转录反应与PCR反 应在1个管内连续进行。
[0105] (3-1)逆转录酶
[0106] 使用了 ZOroNA聚合酶（来自嗜热菌种Z05的热稳定酶，Roche Diagnostics公司）
[0107] (3-2)反应条件
[0108] (a)逆转录反应和PCR反应
[0109] 实施共计15分钟（55°C下5分钟，60 °C下5分钟，65°C下5分钟）的逆转录反应 后，重复进行45个循环的PCR反应，每个循环由92°C下15秒的热变性、60°C下40秒的退 火、及DNA延伸反应构成。
[0110] (b)试剂浓度
[0111] 使反应液的体积为20 μ L，使其中的正向引物及反向引物的最终浓度分别为 0. 2 μ Μ。探针的最终浓度为0. 1 μ Μ。
[0112] (3-3)反应?测I宙装詈
[0113] 使用 Applied Biosystems 7500 快速实时 PCR 系统（Life Technologies)实施 RT-PCR。
[0114] ⑷结果
[0115] (4-1)荧光扩增曲线的确认
[0116] 确认了 ：（a)单独扩增WTl mRNA时的WTl RNA标准品的荧光扩增曲线和扩增循环 数；(b)单独扩增GAPDH mRNA时的GAPDH RNA标准品的荧光扩增曲线和扩增循环数；及（c) 同时扩增WTl mRNA和GAI3DH mRNA时的WTl RNA标准品和GAPDH RNA标准品的荧光扩增曲 线和扩增循环数。
[0117] 图1表示（a)单独扩增WTl mRNA时的、各种浓度的WTl RNA标准品的WTl mRNA 扩增曲线，图2表示（b)单独扩增GAPDH mRNA时的、各种浓度的GAPDH RNA标准品的GAPDH mRNA扩增曲线，图3表示（c)同时扩增WTl mRNA和GAPDH mRNA时的、各种浓度的WTl RNA 标准品的WTl mRNA扩增曲线，图4表示（d)同时扩增WTl mRNA和GAPDH mRNA时的、各种 浓度的GAPDH RNA标准品的GAPDH mRNA扩增曲线。单独扩增WTImRNA时及同时扩增WT1 mRNA和GAPDH mRNA时的、各种浓度的WTl RNA标准品的WTl mRNA扩增循环数示于表4。单 独扩增GAPDH mRNA时及同时扩增WTl mRNA和GAPDH mRNA时的、各种浓度的GAPDH RNA标 准品的GAPDH mRNA扩增循环数示于表5。
[0118] [表 4]
[0119] WTl mRNA的扩增循环数
[0120]
[0121] [表 5]
[0122] GAPDH mRNA的扩增循环数
[0123]
[0124] 单独扩增WTI mRNA时的WTI mRNA扩增曲线示于图1。如图1所示，单独扩增WTI mRNA时，在2. 5X IO5~2. 5X 10 1个拷贝/测试的情况下均可检测到WTl mRNA。如图3所 示，同时扩增WTlmRNA和GAPDH mRNA时，在2. 5 X IO5~2. 5 X 10 1个拷贝/测试的情况下均 可检测到WTl mRNA。
[0125] 另外，如表4所示，单独扩增WTl mRNA时的扩增循环数（扩增循环数为18. 63~ 32. 09)与同时扩增WTl mRNA和GAPDH mRNA时的扩增循环数（扩增循环数为18. 67~ 31. 94)之差小至-0. 15~0. 06,因此单独扩增与同时扩增时的扩增循环数之间没有显著性 差异。由此可以认为，即使在同时扩增校正基因和作为目的基因的WTlmRNA时，也可以与单 独扩增目的基因（WT1 mRNA)的情况同样地，以同等程度的扩增循环数检测到WTl mRNA。
[0126] 单独扩增GAPDH mRNA时的GAPDH mRNA扩增曲线示于图2。如图2所示，单独扩增 GAPDH mRNA时，在1.0 X IO8~1.0 X 10 4个拷贝/测试的情况下均可检测到GAPDH mRNA。
[0127] 如表5所示，单独扩增GAPDH mRNA时的扩增循环数（10. 18~23. 68)与同时扩增 WTl mRNA和GAPDH mRNA时的扩增循环数（10. 30~23. 85)之差为0. 10~0. 20,单独与同 时扩增时的扩增循环数的差异不大。由此可以认为，即使在同时扩增作为校正基因的GAPDH mRNA和作为目的基因的WTl mRNA时，也可以与单独扩增校正基因 （GAPDH mRNA)的情况同 样地，以同等程度的扩增循环数检测到GAPDH mRNA。
[0128] 「实施例21
[0129] 伸用提取自K562的RNA的稀释试骀
[0130] 在本实施例中，对一步式多重RT-PCR法（其对WTl mRNA和GAPDH mRNA同时进行 扩增）和两步式RT-PCR法（其中，在不同的容器中分别进行逆转录反应和PCR，分开对WTl mRNA和GAPDH mRNA进行扩增）的测定灵敏度进行了比较。需要说明的是，使用WTl mR