专利名称：利用基因组定量pcr的肝癌预测方法及预测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用基因组定量PCR的肝癌预测方法及预测试剂盒。
背景技术：
肝癌(Hepatocellular carcinoma ;HCC)是世界上最常见的肿瘤之一，它是一种癌症相关的死亡率占据第三位的高恶性疾病。经对肝癌发病前及恶变前的情况进行研究发现，虽然公知有P53抗癌基因的变异、Wnt信号、EGFR变异等，但是，肝癌发病率仍然在增加，在早期阶段完全切除损伤部位对于治疗是唯一的希望，因此，重要的是研发出一种基于肝癌发病生物学观点的有效诊断及治疗方法。
现在，可以利用微阵列技术与比较基因组杂交(comparative genomichybridization ；CGH)技术融合的阵列-CGH方法以较高的分辨率查找由癌症引发的染色体拷贝数变异(copy number alteration, CNA)。但是,要将基于阵列-CGH的技术应用于临床还存在几点困难第一，微阵列分析过程非常精密，需要特殊的装备，在对患者进行诊疗的一线医疗机构的检查室实施存在一定的困难；第二，现在研发了大量的CM，但这些标记个别应用于临床，因此很难确保充分的预测力。因此，在本发明中代替微阵列-CGH，利用客观的生物统计法选定能够非常准确预测肝癌预后的核心标记组合，并以此为基础，研发出普遍用于当前医疗机构检查的基于PCR的检查法。
发明内容
技术课题本发明的一个目的在于，提供一种利用基因组定量PCR的肝癌预测方法。本发明的另一个目的在于，提供一种能够利用基因组定量PCR判定肝癌预后的肝癌预测试剂盒。技术方案为了实现上述目的，本发明提供了一种利用基因组定量PCR方法的肝癌预后预测方法。具体地说，本发明的预后预测方法，其特征在于，包括以下几个步骤(I)通过关联规则挖掘法从肝癌发掘的多个染色体拷贝数变异(copy number alteration ；CNA)中寻找出能够有效预测肝癌预后的标记组合的步骤；(2)针对选择的染色体拷贝数变异标记通过基因组定量PCR(Genomic quatitative PCR)法检查变异并预测肝癌预后的步骤。在本发明中，将染色体拷贝数变异(CNA)进行单位化处理并设定变异单位后，以此为基础，通过关联规则挖掘法导出肝癌预后关联变异标记。具体地说，在本发明中，为了针对肝癌中发掘的大量染色体变异查找到与肝癌预后最紧密关联的组合，采用了最近在生物信息学中广泛应用的机器学习(Machine Learning)方法之一即关联规则挖掘(Association Rule Mining)算法。关联规则挖掘作为从数据库中查找出项目之间的有用的关联性模式，它始于原来的购物篮资料调查。想要将这一概念用于生物信息学中，在关联规则挖掘中导入了作为新的标准的信息增益(information gain)的概念。这样,相比于频率高的项目，反而利用了在信息方面获得最大增益的项目制定出规则。信息模型(information model)可以这样定义，由固有事件构成的set，当E存在时，其set内包含一个事件ei的信息量如下E= {el, e2, . . . }I(ei) =~logIE I Prob (ei)
在这里，|E|与Prob(ei)分别表示事件的数和发生一个事件ei的概率。如果存在由m个事件构成的一个模式P，其模式可以通过下面的概率表示。P= (pi, p2, . . . , pm)Prob (P) =Prob (pi) xProb (p2) x. . . xProb (pm)另外，该模式中包含的信息量如下I (P) =-log IE I Prob (P) =I (p I) +I (p2) +. . . I (pm)任意数据库中带有一个模式的信息增益的定义如下G(P)=I(P)xSupport(P)-1)在这里，所谓的“Support (P) ”是指特定模式显现的频率。在本发明中，通过关联规则挖掘分析肝癌中发掘的32种肝癌CNA与预后的相关关系，发现了关联于肝癌死亡及生存的6个标记组合这一有用规则(参考表2)。上述导出的肝癌预后关联变异标记通过多重基因组定量PCR (Multiplex Genomic quantitative PCR)方法进行测定，，确认其对肝癌预测有效。本发明的第I形式提供了一种具有以下特征的肝癌预后预测方法，包括以下几个步骤用于分析从由表I定义的L2与L4 ；G14与L3 ;及G4与G6的染色体部分的对构成的群中选择的任意一个以上染色体部分的对的准备各自分析引物对的步骤；用于分析肝癌中未出现CNA的基因组区段的准备对照群引物对的步骤；准备分析对象样品并利用上述分析引物对及对照群引物对执行多重定量PCR的步骤；以及测定由表I定义的扩增与丢失并判断死亡频率高的步骤。优选地，分析由表I定义的G14与L3的染色体部分的对。上述肝癌中未出现CNA的基因组区段也可以选择虽未查明与肝癌的关联但已知的任意基因部分。虽然并非仅限定于此，但是可以利用GAPDH密码与基因区段。本发明的第2形式提供了一种具有以下特征的肝癌预后预测方法，包括以下几个步骤用于分析从由表I定义的L7与L18 ；G6与L14 ;及613与LlO的染色体部分的对构成的群中选择的任意一个以上染色体部分的对地准备各自分析引物对的步骤；用于分析肝癌中未出现CNA的基因组区段的准备对照群引物对的步骤；准备分析对象样品并利用上述分析引物对及对照群引物对执行多重定量PCR的步骤；以及测定由表I定义的扩增与丢失并判断生存频率高的步骤。上述肝癌中未出现CNA的基因组区段也可以选择，虽未查明与肝癌的关联但现已知的任意基因部分。虽然并非仅限定于此，但是可以利用GAPDH密码与基因区段。本发明的第3形式提供了一种肝癌死亡率预后预测试剂盒，包括以下几个部分用于分析从由表I定义的L7与L18 ；G6与L14 ;及G13与LlO的染色体部分的对构成的群中选择的任意一个以上染色体部分的对的各自分析引物对；用于分析肝癌中未出现CNA的基因组区段的对照群引物对；
以及，DNA聚合酶。利用上述试剂盒执行多重定量PCR确认基因的扩增与丢失，从而能够预测肝癌的死亡率预后。基因的确认与确认丢失的方法采用公知的方法。上述肝癌中未出现CNA的基因组区段也可以选择虽未查明与肝癌的关联但是现已知的任意基因部分。虽然并非仅限定于此，但是可以利用GAPDH密码与基因区段。本发明的第4形式提供了一种肝癌生存率预后预测试剂盒，包括以下几个部分用于分析从由表I定义的L2与L4 ；G14与L3 ;及G4与G6的染色体部分的对构成的群中选择的任意一个以上染色体部分的对的各自分析引物对；用于分析肝癌中未出现CNA的基因组区段的对照群引物对；以及DNA聚合酶。基因的确认与确认丢失的方法采用公知的方法。利用上述试剂盒执行多重定量PCR，确认基因的扩增与丢失，从而可以预测肝癌生存率预后。基因的确认 与确认丢失的方法采用公知的方法。上述肝癌中未出现CNA的基因组区段也可以选择虽未查明与肝癌的关联但是现已知的任意基因部分。虽然并非仅限定于此，但是可以利用GAPDH密码与基因区段。技术效果本发明采用在临床病理检查室可以实施的方法即qPCR法，利用试剂盒可以确保检查的方便性及分析的客观性。肝癌诊断后，医生可以对患者的预后进行预测，并选择恰当的治疗方法。本发明的试剂盒效果经独立的反复成套验证，确认其对肝癌的预后预测非常有效。
图I是利用表I中定义的G14与L3对生存率进行分析的示意图，(A)是在仅有G14的情况下对预后产生的影响，G14为草绿色。(B)是在仅有L3的情况下对预后产生的影响，L3为草绿色。(C)是当G14与L3同时存在的情况下对预后产生的影响，G14/L3为草绿色。图2是以31名新型肝癌患者为对象以图I所示方法相同的方法实施生存率分析的示意图。可以看出，当G14/L3两种标记的CNA变异同时出现时，相对于非同时出现的情况相比，肝癌导致的不良生存率明显升高(P=0. 021)，G14/L3为蓝色。
具体实施例方式下面，根据实施例更加详细说明本发明。但是，以下实施例仅示例说明本发明，本发明的内容并不限定于下述实施例。<实施例1>针对肝癌中表现的染色体拷贝数变异的关联规则挖掘(I)针对肝癌CNA的关联规则挖掘表I中所示32种CNA中的一部分虽与肝癌预后存在一定的关联，但是，还不能将个别预后关联性充分地应用于临床。为了克服这一问题，本发明人利用了CPAR(Classification based on Predictive Association Rules)(http://www. csc. liv.ac. uk/^frans/KDD/Software/FOIL_PRM_CPAR/foiIPrmCpar. html)关联规则挖掘算法，挖掘出了 32种肝癌CNA中最能准确反映肝癌预后的CNA组合。其结果，在与总共23种不良预后及优良预后关联的规则中，重要性属上位的三种规则分别如图2所示。与肝癌相关的死亡及与生存相关的规则可以通过下面的示例解释。
G14={1}，L3={l}—> 死亡(0. 89)上述规则是由G14与L3标记构成的规则，G14是表现染色体复制数扩增(Gain)的CNA标记的编号，L3是表现染色体复制数丢失(Loss)的CNA标记的编号。所谓的“G14={1} ”是指，通过G14标记观察到复制数扩增，所谓的“G14={0}”是指，通过G14标记观察不到复制数扩增。同样地，所谓的“L3={1} ”是指，通过L3标记观察到复制数丢失，所谓的“L3={0} ”是指，通过L3标记观察不到复制数丢失。上述规则中，括号内的数字是拉普拉斯误差估计值(Laplace Error Estimate),它代表各个规则的准确率。因此,就上述规则而言,如果通过G14标记观察到复制数扩增的同时通过L3标记观察到复制数丢失，则因肝癌导致的死亡事例中，其死亡概率达到89%。下面，看一下上述规则的适用范围(Coverage)，在调查的76份样品中，在因肝癌导致的38件死亡事例中有8件符合上述标记组合，在38件生存事例中，符合上述标记组合的情况一件也没有观察到(表2)。表I
权利要求
1.一种肝癌预后预测方法，其特征在于，包括以下几个步骤 用于分析从由表I定义的L2与L4 ；G14与L3 ;及G4与G6的染色体部分的对构成的群中选择的任意一个以上染色体部分的对的准备各自分析引物对的步骤； 用于分析肝癌中未出现CNA的基因组区段的准备对照群引物对的步骤； 准备分析对象样品并利用上述分析引物对及对照群引物对执行多重定量PCR的步骤； 以及测定由表I定义的扩增与丢失并判断死亡频率高的步骤。
2.根据权利要求I所述的肝癌预后预测方法，其特征在于，包括以下几个步骤 用于分析由表I定义的G14与L3的染色体部分的对的准备各自分析引物对的步骤； 用于分析肝癌中未出现CNA的基因组区段的准备对照群引物对的步骤； 准备分析对象样品并利用上述分析引物对及对照群引物对执行多重定量PCR的步骤； 以及测定由表I定义的扩增与丢失并判断死亡频率高的步骤。
3.根据权利要求I或者权利要求2中的任意一项所述的肝癌预后预测方法，其特征在于 上述肝癌中未出现CNA的基因组区段为GAPDH密码和基因区段。
4.一种肝癌预后预测方法，其特征在于，包括以下几个步骤 用于分析从由表I定义的L7与L18 ；G6与L14 ;及G13与LlO的染色体部分的对构成的群中选择的任意一个以上染色体部分的对的准备各自分析引物对的步骤； 用于分析肝癌中未出现CNA的基因组区段的准备对照群引物对的步骤； 准备分析对象样品并利用上述分析引物对及对照群引物对执行多重定量PCR的步骤； 以及测定由表I定义的扩增与丢失并判断生存频率高的步骤。
5.根据权利要求4所述的肝癌预后预测方法，其特征在于 上述肝癌中未出现CNA的基因组区段为GAPDH密码和基因区段。
6.一种肝癌死亡率预后预测试剂盒，其特征在于，包括以下几个部分 用于分析从由表I定义的L7与L18 ；G6与L14 ;及G13与LlO的染色体部分的对构成的群中选择的任意一个以上染色体部分的对的各自分析引物对； 用于分析肝癌中未出现CNA的基因组区段的对照群引物对； 以及DNA聚合酶。
7.根据权利要求6所述的肝癌死亡率预后预测试剂盒，其特征在于 上述肝癌中未出现CNA的基因组区段为GAPDH密码和基因区段。
8.一种肝癌生存率预后预测试剂盒，其特征在于，包括以下几个部分 用于分析从由表I定义的L2与L4 ；G14与L3 ;及G4与G6的染色体部分的对构成的群中选择的任意一个以上染色体部分的对的各自分析引物对； 用于分析肝癌中未出现CNA的基因组区段的对照群引物对； 以及DNA聚合酶。
9.根据权利要求6所述的肝癌生存率预后预测试剂盒，其特征在于 上述肝癌中未出现CNA的基因组区段为GAPDH密码和基因区段。
全文摘要
本发明涉及一种利用基因组定量PCR法的肝癌预测方法及预测试剂盒。具体地说，涉及一种肝癌诊断方法、诊断试剂盒及能够用于肝癌诊断的新型癌症关联基因，其特征在于，包括以下几个步骤(1)利用关联规则挖掘法从肝癌发掘的多个染色体拷贝数变异(copynumberalteration；CNA)中寻找出能够有效预测肝癌预后的标记组合的步骤；(2)针对选择的染色体拷贝数变异标记利用基因组定量PCR(GenomicquatitativePCR)法检查变异并预测肝癌预后的步骤。本发明的预测方法，将CNA进行单位化处理并设定变异单位后，以此为基础，对通过关联规则挖掘法导出的肝癌预后关联变异标记利用多重基因组定量PCR方法进行测定，从而就可以对肝癌预后进行预测。
文档编号C12Q1/68GK102782154SQ201080064296
公开日2012年11月14日 申请日期2010年9月27日 优先权日2010年2月19日
发明者郑演浚 申请人:加图立大学校产学协力团