专利名称：基于多个基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于多个基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂盒。
背景技术：
多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是威胁生命的浆细胞性恶性肿瘤，在血液恶性肿瘤中发病率位于第二位。尽管干细胞移植以及新型药物治疗可以使病情得到有效控制，但很少有患者能够取得完全缓解甚至治愈，复发和死亡的结局仍不可避免。分子生物学的发展使越来越多的肿瘤相关基因为人们所认知，这些重要的分子标志已在血液系统恶性肿瘤的诊断和治疗中发挥了极大的作用，在MM中虽然已发现涉及免疫球蛋白基因重排、C-MYC、RAS癌基因突变及人类端粒酶逆转录酶mRNA过度表达等，但缺乏公认的肿瘤相关的特异性诊断、微小残留病检测和预后评估的分子靶标。癌睾丸抗原(Cancer testis antigen，CT抗原)基因是与恶性肿瘤相关的基因家族，编码免疫原性蛋白质，在过去15年间已鉴定了 40多个家族，表达特点是限制性表达于正常组织睾丸、卵巢和胚胎滋养层细胞，其他正常组织几乎不表达，而在多种肿瘤组织中有不同频率的表达，且可诱导抗体介导和T细胞介导的免疫反应。基于其在肿瘤患者及正常组织中的表达特点和免疫原性，CT抗原已被认为是有应用前景的人类恶性肿瘤免疫治疗的靶标，并有可能成为重要的诊断和预后标志。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于多个基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试齐U盒。本发明提供了一种辅助诊断多发性骨髓瘤患者的试剂盒，包括引物探针组合物甲、引物探针组合物乙和引物探针组合物丙；所述引物探针组合物甲由特异性引物对甲和探针甲组成；所述引物探针组合物乙由特异性引物对乙和探针乙组成；所述引物探针组合物丙由特异性引物对丙和探针丙组成；所述特异性引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示； 所述特异性引物对乙为序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对； 所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示；所述特异性引物对丙为序列表的序列7 所示DNA和序列表的序列8所示DNA组成的引物对；所述探针丙的核苷酸序列如序列表的序列9所示。所述试剂盒具体可由所述引物探针组合物甲、所述引物探针组合物乙和所述引物探针组合物丙组成。所述试剂盒还可包括引物探针组合物丁 ；所述引物探针组合物丁由特异性引物对丁和探针丁组成；所述特异性引物对丁为序列表的序列10所示DNA和序列表的序列11所示DNA组成的引物对；所述探针丁的核苷酸序列如序列表的序列12所示。
所述试剂盒具体可由所述引物探针组合物甲、所述引物探针组合物乙、所述引物探针组合物丙和所述弓I物探针组合物丁组成。所述试剂盒还可包括阳性质粒甲、阳性质粒乙和阳性质粒丙；所述阳性质粒甲为含有MAGE-C1/CT7基因(NCBI基因库序列号匪_00546幻或其片段的重组质粒；所述阳性质粒乙为含有MAGE-A3基因(NCBI基因库序列号匪_00536幻或其片段的重组质粒；所述阳性质粒丙为含有MAGE-C2/CT10基因(NCBI基因库序列号匪_016对钔或其片段的重组质粒。所述试剂盒还可可包括阳性质粒丁 ；所述阳性质粒丁为含有SSX-2基因(NCBI基因库序列号NM_175698/003147)或其片段的重组质粒。所述阳性质粒甲可为含有序列表的序列13所示的MAGE-C1/CT7基因片段的重组质粒。所述阳性质粒乙可为含有序列表的序列14所示的MAGE-A3基因片段的重组质粒。所述阳性质粒丙可为含有序列表的序列15所示的MAGE-C2/CT10基因片段的重组质粒。所述阳性质粒丁可为含有序列表的序列16所示的SSX-2基因片段的重组质粒。所述阳性质粒甲具体可为将pMDIS-T载体与序列表的序列13所示的MAGE-C1/CT7 基因片段连接得到的重组质粒。所述阳性质粒乙具体可为将PMD18-T载体与序列表的序列 14所示的MAGE-A3基因片段连接得到的重组质粒。所述阳性质粒丙具体可为将pMD18_T载体与序列表的序列15所示的MAGE-C2/CT10基因片段连接得到的重组质粒。所述阳性质粒丁具体可为将PMD18-T载体与序列表的序列16所示的SSX-2基因片段连接得到的重组质粒。所述试剂盒还可包括针对内参基因的内参引物对和内参探针；所述内参基因为 ABL基因(NCBI基因库序列号NM_005157)。所述内参引物对具体可为序列表的序列17所示DNA和序列表的序列18所示DNA 组成的引物对；所述内参探针的核苷酸序列具体可如序列表的序列19所示。所述试剂盒还可包括内参质粒；所述内参质粒为含有ABL基因或其片段的重组质粒。所述内参质粒可为含有序列表的序列20所示的ABL基因片段的重组质粒。所述内参质粒具体可为将PMD18-T载体与序列表的序列20所示的ABL基因片段连接得到的重组质粒。所述引物探针组合物甲、所述引物探针组合物乙和所述引物探针组合物丙可用于制备辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒。所述引物探针组合物甲、所述引物探针组合物乙、所述引物探针组合物丙和所述引物探针组合物丁可用于制备辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒。对42例匪患者跟踪样本的检测发现，在表达某一 CT抗原基因且治疗无效患者中其MAGE-C1/CT7、MAGE-A3、MAGE-C2/CT10基因皆100%持续表达，在治疗有效患者中仍有 50%持续表达至少这三种基因之一，而SSX-2基因的表达则不稳定。MAGE-C 1/CT7.MAGE-A3 和MAGE-C2/CT10基因的阳性率、表达水平以及共表达的阳性基因数均与MM患者骨髓浆细胞数显著相关，基因的表达变化与患者临床病程一致，其中MAGE-C1/CT7基因的变化有统计学意义。MAGE-C1/CT7、MAGE-A3及MAGE-C2/CT10基因表达水平和共表达的阳性基因数与多项有预后意义的临床指标显著相关，且基因的高水平表达与患者生存时间缩短，总体生存率下降有关。SSX-2基因虽然与多项临床指标没有直接关联，但可以作为以上三种基因的补充，增加检测MM病人的灵敏性。 MAGE-C 1/CT7、MAGE-A3、MAGE-C2/CT 10 和 SSX-2 基因的表达水平是潜在的 MM 辅助诊断、预后评估及疗效监测的有意义的临床指标。本发明对于深入了解MM的发病机制，认识其发生发展规律，提高我国MM诊治水平具有重要的价值，也为寻求新的MM靶向治疗策略奠定基础。本发明的试剂盒，不仅可以应用于定性辅助诊断多发性骨髓瘤，还可以通过内参基因，测定患者各个基因的表达水平。本发明为多发性骨髓瘤的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。本发明将在医学检测领域发挥重要作用。
图1为内参对照质粒RQ-PCR荧光标准曲线。图2为阳性对照质粒甲的RQ-PCR荧光标准曲线。图3为阳性对照质粒乙的RQ-PCR荧光标准曲线。图4为阳性对照质粒丙的RQ-PCR荧光标准曲线。图5为高表达MAGE-C1/CT7基因的多发性骨髓瘤患者(志愿者)的cDNA的RQ-PCR 荧光标准曲线。图6为各个基因表达量与浆细胞数和⑶38+/⑶138+浆细胞数的相关性结果。图7为各个基因的表达量与患者生存时间的相关性结果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。TRIzol kits 购自hvitrogen公司。RNAsin 购自华美生物技术公司。dNTP 购自Pharmecia公司。Mo-MLV逆转录酶、5 X标准缓冲液购自Promega公司。DNA连接酶 购自TakaRa公司。Universal PCR Master mix 购自天根生物技术有限公司。Phusion High-fidelity PCR Kit 购自 New England Biolabs 公司。Dami细胞购自上海坤肯生物化工有限公司，中国细胞库典藏细胞中心细胞目录QK10058。K562细胞购自上海坤肯生物化工有限公司，中国细胞库典藏细胞中心细胞目录QK1(^69。MEG-Ol细胞购自上海坤肯生物化工有限公司，中国细胞库典藏细胞中心细胞目录QK10748。RPMI82^细胞购自美国ATCC (美国标准生物品收藏中心)，产品目录号为CCL-155。U266细胞购自美国ATCC，产品目录号为TIB-196。KM3细胞购自上海拜力生物科技有限公司。KG-I细胞购自中国科学院昆明细胞库，产品目录号为KCB 200552YJ。 HL60细胞购自中国科学院细胞库，产品目录号为TCHu 23。Nalm-6细胞购自北京大学疾病基因研究中心。CEM细胞购自美国ATCC，产品目录号为CCL-119。多发性骨髓瘤诊断及分期标准参照文献Greipp PR, San Miguel J, Durie BG, et al. International Staging System for Multiple Myeloma. Journal of Clinical Oncology，2005，15 :3412-3420.。疗效的评价标准参照文献Durie BG, Harousseau JL, Miguel JS, et al. International uniform response criteria for multiple myeloma.Leukemia. 2006,20 :1467-1473.。统计分析应用SPSS软件v. 13. 0。计量资料采用方差分析，计数资料采用卡方检验。临床资料与CT抗原基因表达间的相关性用直线相关分析。ρ < 0. 05被认为是有统计学意义。通过单因素和多因素分析评价因素与生存的相关性，采用 Log-rank检验鉴定生存相关因素，ρ < 0. 05的变量纳入Cox回归分析，ρ < 0. 2定义为与生存预后相关的因素。 实施例3至9中的PCR参数均如下PCR反应体系(10 μ 1)上游引物0. 9 μ Μ，下游引物0. 9 μ Μ，探针0. 25 μ Μ, 2 X TaqMan通用PCR公共体系5 μ 1 (ABI公司，美国)，质粒1 ；其余为去离子水。PCR 反应条件50°C 2min, 1 个循环；95°C IOmin, 1 个循环；95°C 15s,60°C lmin, 50 个循环。实施例1、特异性引物对和探针的设计MAGE-C1/CT7基因(NCBI基因库序列号NM 005462)位于人染色体Xq26，针对 MAGE-C1/CT7基因设计特异性引物对甲(由上游引物MAG-FPl和下游引物MAG-RPl组成，扩增产物为79bp)和探针甲(探针MAG-T-probel)上游引物MAG-FP1(序列表的序列 1) :5，-TTGTCTTCTGGGAACCTTGACTC-3，；下游引物MAG-RPl (序列表的序列幻5，-TGAGGGACACATACATCCTAAAAGC-3，；探针MAG-T-probel (5，— 3，)FAM-ACTGCCTGGGCCTCCTCTGCTGT-BHQ(核苷酸序列为序列表的序列 3)。MAGE-A3基因(NCBI基因库序列号匪005362)位于人染色体Xq28，针对MAGE-A3 基因的特异性引物对乙(由上游引物MAG-FP2和下游引物MAG-RP2组成，扩增产物为 172bp)和探针乙(探针 MAG-T-pr。be2)上游引物MAG-FP2(序列表的序列 4) 5，-GGTGAGGAGGCAAGGTTCTGA-3，；下游引物MAG-RP2(序列表的序列幻5，-GTGCTGACTCCTCTGCTCAAGAG-3，；探针MAG-T_probe2(5，一 3，)FAM-AGATCTGCCAGTGGGTCTCCATTGCC-BHQ(核苷酸序列为序列表的序列 6)。MAGE-C2/CT10基因(NCBI基因库序列号匪016M9)位于人染色体Xq27，针对 MAGE-C2/CT10基因设计特异性引物对丙(由上游引物MAG-FP3和下游引物MAG-RP3组成， 扩增产物为137bp)和探针丙(MAG-T-probe3)上游引物MAG-FP3(序列表的序列 7) 5，-GTGTGAGGCACACAGCCTAAAG-3，；下游引物MAG-RP3(序列表的序列 8) 5，-GGAGGCATGACGACTTCTTCA-3，；探针MAG-T_probe3(5，— 3，)FAM-AGGAGTCAAGGCCTGTTGGATCTCATCA-BHQ(核苷酸序列为序列表的序列 9)。SSX-2基因(NCBI基因库序列号NM_175698/003147)位于人染色体Xpll. 22，针对SSX-2基因设计特异性引物对丁(由上游引物SSX-FP和下游引物SSX-RP组成，扩增产物为IlObp)和探针丁(探针SSX-T-probe)上游引物SSX-FP (序列表的序列 10) :5，-TAACCGTGGGAATCAGGTTGA-3，下游引物SSX-RP (序列表的序列 11) :5，-CCTCCGAATCATTTCCTTCCT-3，探针SSX-T-probe (5，— 3，)FAM-CCGAAGATCATGCCCAAGAAGCCAG-BHQ(核苷酸序列为序列表的序列 12)。
针对ABLl基因(内参基因；NCBI基因库序列号匪005157)设计内参引物对 (由上游引物ABLl-F和下游引物ABLl-R组成，扩增产物为124bp)和内参探针(探针 ABLl-T-probe)上游引物ABLI-F (序列表的序列 17) 5，-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3， 下游引物ABL1-R(序列表的序列 18) :5，-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3，；探针ABLl-T_probe(5，— 3，)FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA(核苷酸序列为序列表的序列 19)。分别合成特异性引物对甲和探针甲，特异性引物对乙和探针乙，特异性引物对丙和探针丙，特异性引物对丁和探针丁，内参引物对和内参探针。(可参考文献合成 Gabert J, Beillard E, van der Velden VH, et al.Standardization and quality control studies of， real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia—a Europe Against Cancer program. Leukemia. 2003,17 :2318-57.)。实施例2、相关质粒的制备一、阳性对照质粒甲(含有MAGE-C1/CT7基因片段的质粒)的制备以MAGE-C1/CT7基因表达阳性的多发性骨髓瘤患者(志愿者)的骨髓单个核细胞的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列13(632bp)所示， 扩增产物经纯化后，克隆入PMD18-T质粒(PMD18-T载体系统，上海皓嘉公司，产品目录号 D101A)，将重组质粒转化大肠杆菌DH5ci (天根生化公司，产品目录号⑶101-02)感受态， 筛选阳性克隆提取质粒并纯化后进行测序，结果表明得到了阳性对照质粒甲(骨架质粒为 PMD18-T质粒，在ECOR V位点插入序列13所示cDNA)。PCR扩增所用的引物对如下CT7FP :5，-ACATCCTCACCCTCAGGAGGG-3，；CT7RP :5，-GACGAGGATCGTCTCAGGTCAGC-3，。二、阳性对照质粒乙(含有MAGE-A3基因片段的质粒)的制备以MAGE-A3基因表达阳性的多发性骨髓瘤患者(志愿者)的骨髓单个核细胞的 cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列14所示(42!3bp)，扩增产物经纯化后，克隆入PMD18-T质粒，将重组质粒转化大肠杆菌DH5 α感受态，筛选阳性克隆提取质粒并纯化后进行测序，结果表明得到了阳性对照质粒乙(骨架质粒为PMD18-T质粒，在ECOR V位点插入序列14所示cDNA)。PCR扩增所用的引物对如下上游引物5，-GAAGCCGGCCCAGGCTCG-3，；下游引物5，-GGAGTCCTCATAGGATTGGCT-3，。三、阳性对照质粒丙(含有MAGE-C2/CT10基因片段的质粒)的制备以MAGE-C2/CT10基因表达阳性的多发性骨髓瘤患者(志愿者)的骨髓单个核细胞的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列15所示(884bp)， 扩增产物经纯化后，克隆入PMD18-T质粒，将重组质粒转化大肠杆菌DH5 α感受态，筛选阳性克隆提取质粒并纯化后进行测序，结果表明得到了阳性对照质粒丙(骨架质粒为PMD18-T质粒，在ECOR V位点插入序列15所示cDNA)。PCR扩增所用的引物对如下上游引物5，-CGGATCGGAGGCATTTGTGAG-3，；下游引物5，-ATGAACTCACGGGCTCTCTTGAG-3，。四、阳性对照质粒丁(含有SSX-2基因片段的质粒)的制备以SSX-2基因表达阳性的多发性骨髓瘤患者(志愿者)的骨髓单个核细胞的cDNA 为模板，进行PCR扩增，扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列16所示G35bp)，扩增产物经纯化后，克隆入PMD18-T质粒，将重组质粒转化大肠杆菌DH5 α感受态，筛选阳性克隆提取质粒并纯化后进行测序，结果表明得到了阳性对照质粒丁(骨架质粒为PMD18-T质粒，在 ECOR V位点插入序列16所示cDNA)。PCR扩增所用的引物对如下上游引物5，-GTGCTCAAATACCAGAGAAGATC-3，；下游引物5，-TTTTGGGTCCAGATCTCTCGTG-3，。五、内参对照质粒(含有ABL基因片段的质粒)的制备以正常人(志愿者)的骨髓单个核细胞的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列8所示(124bp)，扩增产物经纯化后，克隆入pMDIS-T质粒，将重组质粒转化大肠杆菌DH5 α感受态，筛选阳性克隆提取质粒并纯化后进行测序，结果表明得到了内参对照质粒(骨架质粒为PMD18-T质粒，在ECOR V位点插入序列20所示cDNA)。PCR扩增所用的弓丨物对如下上游引物5，-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3，；下游引物5，-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3，。六、阴性对照质粒pMD18-T 质粒。实施例3、检测阳性对照质粒的灵敏度检测将实施例2得到的阳性对照质粒甲用灭菌双蒸注射用水进行梯度稀释得到各个稀释液(稀释液的浓度范围为每微升含有10°至IO5个拷贝的MAGE-C1/CT7基因片段)； 将实施例2得到的阳性对照质粒乙用灭菌双蒸注射用水进行梯度稀释得到各个稀释液(稀释液的浓度范围为每微升含有10°至IO7个拷贝的MAGE-A3基因片段)；将实施例2得到的阳性对照质粒丙用灭菌双蒸注射用水进行梯度稀释得到各个稀释液(稀释液的浓度范围为每微升含有10°至IO7个拷贝的MAGE-C2/CT10基因片段)；将实施例2得到的内参对照质粒用灭菌双蒸注射用水进行梯度稀释得到各个稀释液(稀释液的浓度范围为每微升含有10°至IO6个拷贝的ABL基因片段)；通过测定吸光度值计算MAGE-C1/CT7基因片段、 MAGE-A3基因片段、MAGE-C2/CT10基因片段、SSX-2基因片段或ABL基因片段的拷贝数)。将各个阳性对照质粒甲稀释液采用实施例1得到的特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪上进行RQ-PCR。将各个阳性对照质粒以稀释液采用实施例1得到的特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪上进行RQ-PCR。将各个阳性对照质粒丙稀释液采用实施例1得到的特异性引物对丙和探针丙在荧光实时定量PCR仪上进行RQ-PCR。 将各个阳性对照质粒丁稀释液采用实施例1得到的特异性引物对丁和探针丁在荧光实时定量PCR仪上进行RQ-PCR。将各个内参对照质粒采用实施例1得到的内参引物对和内参探针在荧光实时定量PCR仪上进行RQ-PCR。均采用美国ABI公司7500-FAST型荧光实时定量 PCR 仪。将ABLl基因片段、MAGE-A3基因片段、MAGE-C2/CT10基因片段和SSX-2基因片段扩增曲线的阈值定为0. 082，MAGE-C1/CT7扩增曲线的阈值定为0. 2。内参对照质粒RQ-PCR荧光标准曲线见图1 (阈值为0. 082)，函数为Io^1ABLl = (Ct-38. 46)/-3. 22，相关系数均达到0.99以上，检测内参基因的灵敏度达10个拷贝。阳性对照质粒甲的RQ-PCR荧光标准曲线见图2(阈值为0. 2)，函数为log1QMAGECl/CT7 = (Ct-31. 232)/-3. 281，相关系数均达到0. 99以上，检测MAGE-C1/CT7基因片段的灵敏度可达1个拷贝。阳性对照质粒乙的RQ-PCR荧光标准曲线见图3 (阈值为0. 082)，函数为 log10MAGE-A3 = (Ct-41. 83)/-3. 57，相关系数均达到0. 99以上，检测MAGE-A3基因片段的灵敏度可达10个拷贝。阳性对照质粒丙的RQ-PCR荧光标准曲线见图4 (阈值为0. 082)，函数为 log10MAGE-C2/CT10 = (Ct-40. 41)/-3. 43，相关系数均达到 0. 99 以上，检测 MAGE-C2/ CTlO基因片段的灵敏度可达10个拷贝。将一例多发性骨髓瘤患者(志愿者)的cDNA，用灭菌双蒸注射用水1 :10梯度稀释，采用实施例1得到的特异性引物对丁和探针丁在荧光实时定量PCR仪上进行 RQ-PCR(美国ABI公司7500-FAST型)。扩增曲线显示Ct值和SSX-2启始模板量的对数存在线性相关(相关系数大于0. 99，检测灵敏度达10_4，阈值为0. 082 ；见图5)，其扩增效率与 ABL基因相近，为减少实验误差，均用ABL标准曲线计算基因拷贝数，检测SSX-2基因片段的灵敏度可达10个拷贝。将7位MAGEC1/CT7基因阳性的多发性骨髓瘤患者cDNA，用灭菌双蒸注射用水1 10稀释，制备成6个系列的稀释样品(10-1，ΙΟ"2, ΙΟ"3, ΙΟ"4, ΙΟ"5,10_6稀释样本)，采用实施例 1得到的特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪上进行RQ-PCR。结果见表1。结果表明，应用本发明提供的特异性引物对甲和探针甲通过RQ-PCR检测7例MAGEC1/CT7基因阳性的多发性骨髓瘤患者，灵敏度可达10_4或10_5稀释度。表1多发性骨髓瘤患者cDNA标本10倍系列稀释的扩增曲线特征
权利要求
1.一种辅助诊断多发性骨髓瘤患者的试剂盒，包括引物探针组合物甲、引物探针组合物乙和引物探针组合物丙；所述引物探针组合物甲由特异性引物对甲和探针甲组成；所述引物探针组合物乙由特异性引物对乙和探针乙组成；所述引物探针组合物丙由特异性引物对丙和探针丙组成；所述特异性引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特异性引物对乙为序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对；所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示；所述特异性引物对丙为序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA组成的引物对；所述探针丙的核苷酸序列如序列表的序列9所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括引物探针组合物丁；所述引物探针组合物丁由特异性引物对丁和探针丁组成；所述特异性引物对丁为序列表的序列10所示DNA和序列表的序列11所示DNA组成的引物对；所述探针丁的核苷酸序列如序列表的序列12所示。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括阳性质粒甲、阳性质粒乙、阳性质粒丙和阳性质粒丁 ；所述阳性质粒甲为含有MAGE-C1/CT7基因或其片段的重组质粒；所述阳性质粒乙为含有MAGE-A3基因或其片段的重组质粒；所述阳性质粒丙为含有 MAGE-C2/CT10基因或其片段的重组质粒；所述阳性质粒丁为含有SSX-2基因或其片段的重组质粒。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述阳性质粒甲为含有序列表的序列13 所示的MAGE-C1/CT7基因片段的重组质粒；所述阳性质粒乙为含有序列表的序列14所示的 MAGE-A3基因片段的重组质粒；所述阳性质粒丙为含有序列表的序列15所示的MAGE-C2/ CTlO基因片段的重组质粒；所述阳性质粒丁为含有序列表的序列16所示的SSX-2基因片段的重组质粒。
5.如权利要求1至4中任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括针对内参基因的内参引物对和内参探针；所述内参基因为ABL基因。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述内参引物对为序列表的序列17所示 DNA和序列表的序列18所示DNA组成的引物对；所述内参探针的核苷酸序列如序列表的序列19所示。
7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括内参质粒；所述内参质粒为含有ABL基因或其片段的重组质粒。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述内参质粒为含有序列表的序列20所示的ABL基因片段的重组质粒。
9.引物探针组合物甲、引物探针组合物乙和引物探针组合物丙在制备辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒中的应用；所述引物探针组合物甲由特异性引物对甲和探针甲组成；所述引物探针组合物乙由特异性引物对乙和探针乙组成；所述引物探针组合物丙由特异性引物对丙和探针丙组成；所述特异性引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特异性引物对乙为序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对；所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示；所述特异性引物对丙为序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA组成的引物对；所述探针丙的核苷酸序列如序列表的序列9所示。
10.引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙和引物探针组合物丁在制备辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒中的应用；所述引物探针组合物甲由特异性引物对甲和探针甲组成；所述引物探针组合物乙由特异性引物对乙和探针乙组成；所述引物探针组合物丙由特异性引物对丙和探针丙组成；所述引物探针组合物丁由特异性引物对丁和探针丁组成；所述特异性引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特异性引物对乙为序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对；所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示；所述特异性引物对丙为序列表的序列7所示DNA和序列表的序列 8所示DNA组成的引物对；所述探针丙的核苷酸序列如序列表的序列9所示；所述特异性引物对丁为序列表的序列10所示DNA和序列表的序列11所示DNA组成的引物对；所述探针丁的核苷酸序列如序列表的序列12所示。
全文摘要
本发明公开了基于多个基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂盒。本发明提供了包括引物探针组合物甲(序列1和2所示核苷酸序列组成的引物对甲和序列3所示探针甲)、引物探针组合物乙(序列4和5所示核苷酸序列组成的引物对乙和序列6所示探针乙)、引物探针组合物丙(序列7和8所示核苷酸序列组成的引物对丙和序列9所示探针丙)和引物探针组合物丁(序列10和11所示核苷酸序列组成的引物对丁和序列12所示探针丁)的试剂盒。本发明为多发性骨髓瘤的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。本发明将在医学检测领域发挥重要作用。
文档编号C12Q1/68GK102242209SQ201110187368
公开日2011年11月16日 申请日期2011年7月5日 优先权日2011年7月5日
发明者刘开彦, 张瑶, 江滨, 阮国瑞, 陈珊珊, 黄晓军 申请人:北京大学人民医院