专利名称：一种定量检测mpl基因w515位点突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的荧光定量PCR技术，具体涉及一种定量检测MPL基因W515位点突变的试剂盒。
背景技术：
骨髓增殖性疾病(myeloproliferative diseases, MPD)是骨髓组织持续异常增殖之后，造成红细胞和血小板过多，以及骨髓纤维化问题的疾病。根据2008年WHO (WorldHealthOrganization,世界卫生组织)的修订，将骨髓增殖性疾病改为骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative, MPN)。MPN 中包括真性红细胞增多症(Polycythemia Vera, PV),原发性血小板增多症(Essential Thrombocytosis, ET)和原发性骨髓纤维化(primarymyelofibrosis, PMF)，它们均是血细胞过度增殖的疾病，如若不及时治疗，最终会发展成为急性粒细胞性白血病。因此,早期快速诊断对病人疾病的发生发展起关键性作用。2008年WHO修订MPN诊断标准的依据是多数患者都具有JAK2基因突变，主要是JAK2基因V617F和JAK2基因外显子12突变。研究表明JAK2基因V617F是诊断为PV的敏感指标，也见于50%的ET和PMF中。但是不能排除JAK2基因V617F阴性却患有MPN的可能性。随后在JAK2V617F阴性的MPN患者中发现促血小板生成素受体MPL基因突变，包括MPL基因W515L位点突变和W515K位点突变。该基因是骨髓增殖性白血病病毒同源性致癌基因，属于促红细胞生成素超级家族，可促使促血小板生成素配体(Thromboietin，ΤΡ0)全身造血和巨核细胞生长与分化，此基因位于染色体lq34并包含12个外显子。2006年，人体MPL基因W515L位点突变是在JAK2基因V617F阴性的PMF中被发现，突变位于第10外显子中，在1544号核苷酸处G转变成T，致使横跨膜区域515密码子有色氨酸转变成亮氨酸。此后，又发现在1543与1544处核苷酸由TG转变为AA即MPL基因W515K位点突变。尽管之后又在第10外显子中发现其它突变，但是只有MPL基因W515位点的突变会诱导模仿JAK2基因V617F的功能，发展成MPN。MPL基因W515L位点和MPL基因W515K位点的功能获得性突变率在PMF和ET中分别为10%和3%，而在PV中从未出现。因此，MPL基因W515L突变和W515K位点突变主要用于诊断PMF和ET。在JAK2基因V617F阴性的患者中，检测MPL基因W515L突变和W515K位点突变有助于MPN的诊断。使用等位基因特异性荧光定量PCR(Polymerase ChainReaction,聚合酶链式反应)检测技术，其敏感性显著高于直接测序。实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到真正意义的定量的飞跃，为人类疾病基因的定量检测提供了一个行之有效的检测工具，与普通PCR相比具有特异性增强、灵敏度提高和检测快速、降低了污染等特点，但目前尚未有实时荧光定量PCR方法检测MPL基因W515位点突变试剂盒的相关报道。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种检测MPL基因W515L位点突变和MPL基因W515K位点突变的试剂盒。所述技术方案如下CN 102925559 A
书
明
说
2/9页本发明实施例提供了一种检测MPL基因W515位点突变的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括MPL基因W515L位点突变特异性引物和MPL基因W515K位点突变特异性引物中的至少一种和内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中MPL基因W515L位点突变特异性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；·
MPL基因W515L位点突变特异性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示；MPL基因W515L位点突变特异性Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 3所示；MPL基因W515K位点突变特异性上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；MPL基因W515K位点突变特异性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所示；MPL基因W515K位点突变特异性Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID N0:6所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 7所不；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示；ABL基因Taqman灭光探针如序列表中SEQ ID NO:9所不；进一步地，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO: 11所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ IDNO: 12所示；内部阳性控制序列的Taqman突光探针如序列表中SEQ IDNO: 13所示。进一步地，所述MPL基因W515L位点突变特异性Taqman荧光探针、MPL基因W515K位点突变特异性Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA ;所述内部阳性控制序列Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。具体地，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示。具体地，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有MPL基因W515L位点突变和MPL基因W515K位点突变的基因组DNA样品。具体地，所述荧光定量PCR的混合液(以反应体系终浓度表示)为1X的PCR预混合液(原液为 2 XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、。· 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、O. 2U/ μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶以及无RNase去离子水。本发明试剂盒的优点和效果如下(I)敏感性高可重复敏感度为O. 01%，即10000个细胞中有一个含MPL基因W515L位点突变和MPL基因W515K位点突变就可以被检测出。(2)特异性强使用特异性探针对定量分子进行识别，准确性高。同时，靶序列由弓I物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。(3)简便安全操作简单、安全、自动化程度高而且防止污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易被污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，无需要担心放射性污染。(4)全程监控本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。(5)快速速度快、高通量，可在3-4小时完成。本发明的试剂盒能快速、准确、定量检测MPL基因W515L位点突变和MPL基因
4W515K位点突变水平，有效杜绝了假阳性和假阴性的发生，用于骨髓增殖性肿瘤的诊断及治疗过程中微小残留病的监测，为骨髓增殖性肿瘤的诊断、制定治疗方案及疗效评价和预后提供了重要的检测手段。
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使·用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图I是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增MPL基因W515L位点突变阳性的骨髓增殖性肿瘤患者的荧光曲线图，及ABL标准品扩增的荧光曲线图和内部阳性控制序列标准品扩增的荧光曲线图；图2是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增MPL基因W515K位点突变阳性的骨髓增殖性肿瘤患者的荧光曲线图，及ABL标准品扩增的荧光曲线图和内部阳性控制序列标准品扩增的荧光曲线图。图中1-MPL基因W515L位点突变扩增曲线、2-ABL标准品扩增曲线、3-内部阳性控制品扩增曲线、4-MPL基因W515K位点突变扩增曲线。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。实施例I.试剂盒的制备I、特异性的引物和荧光探针的设计根据基因序列(ABL基因序列和MPL基因序列来源于美国国家生物技术信息中心核酸数据库，其中ABL基因ID分别为25，参考序列号为NM_005157.4;MPL基因ID分别为4352，参考序列号为NG_007525. I)分别设计对上述各基因序列特异的引物和荧光探针。2、按照下列试剂盒的组成配制试剂盒的各组分本发明试剂盒组成如下①基因组DNA提取试剂采用组织基因组DNA提取试剂盒(Qiagen公司，货号69504)快速提取O. 5ml骨髓增殖性肿瘤患者骨髓组织基因组DNA。②引物、探针和标准品包括MPL基因W515L位点突变特异性引物、MPL基因W515K位点突变特异性引物、内部阳性控制序列序列、内部阳性控制序列弓I物和内参基因ABL引物，以及与引物对应的Taqman荧光探针，具体如下 MPL 基因 W515L 位点突变特异性上游引物5 ’ -GAAGTCTGACCCTTTTTGTCTCCTA-3，(序列表中序列I);MPL基因W515L位点突变特异性下游引物5’ -CTGGTCCACCGCCAGTCT-3’(序列表中序列2)；MPL 基因 W515L 位点突变特异性 Taqman 荧光探针FAM5，-CTGCTGAGGTTGC-3，TAMRA(序列表中序列3)；
5
MPL 基因 W515K 位点突变特异性上游引物5 ’ -TTTTTGTCTCCTAGCCTGGATCTC-3，(序列表中序列4)；MPL 基因 W515K 位点突变特异性下游引物5 ’ -GTCACAGAGCGAACCAAGAATG-3 ’(序列表中序列5)；MPL基因W515K位点突变特异性Taqman荧光探针FAM5’ -CTGCTGAGGAAGCA-3’ TAMRA (序列表中序列 6)；内部阳性控制序列序列为5’-GAAGTCTGACCCTTTTTGTCTCCATGCCTGGATCTCCTTGGTGACCGCTCTGCATCTAGTGCTGGGCCTCAGCGCCGTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGGTGGCAGTTTCCTGCACACTACAGGTACCGCCCCCGCCAGGCAGGACAGTGGCGGTGGACCAG-3’(序列表中序列 10)；内部阳性控制序列上游引物序列为5’-GAAGTCTGACCCTTTTTGTCTCCAT-3’(序列表中序列11);内部阳性控制序列下游引物序列为5’ -CTGGTCCACCGCCACTGT-3’(序列表中序列12)；内部阳性控制序列Taqman荧光探针TET5’ -CTGCTGAGGTGGCA-3’ TAMRA (序列表中序列13)；ABL 基因序列为5’ -CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’(序列表中序列14)；ABL基因上游引物序列为5，-CCGGGTCTTAGGCTAATCACA-3，(序列表中序列7)；ABL基因下游引物序列为5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列8)；ABL 基因 Taqman 荧光探针FAM5’ -TGGTGTGAAGCCC-3 ’ TAMRA (序列表中序列 9)；其中，内部阳性控制序列为人工合成序列，包含MPL基因W515K/L突变位点的的基因序列和一部分人工合成序列；内部阳性控制序列和ABL基因序列分别用作标准品。上述引物序列、控制序列、基因序列和Taqman荧光探针序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。③阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有MPL基因W515L位点突变和MPL基因W515K位点突变的基因组DNA样品为阳性对照，采用上述实施例I中提供的本发明试剂盒组成①基因组DNA提取试剂，快速提取已经确诊的含有MPL基因W515L位点突变的骨髓增殖性肿瘤患者的O. 5ml骨髓组织DNA，作为阳性对照。④MPL基因W515L位点突变荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测MPL基因W515L位点突变特异性的引物、探针组成1X的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号:210212, 2XPCRPremix)、2. 5-4. OmM 的Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs和O. 3-0. 6mM 的 dUTP、O. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 MPL 基因 W515L 位点突变特异性上、下游引物(序列表中序列1、2) O. 3pmol/uL的MPL基因W515L位点突变特异性探针(序列表中序列3)、0. 25pmol/yL的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列11)、
O.25pmol/yL的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列12)、0. 3pmol/yL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列13)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被测样品DNA和内部阳性控制序列DNA)，其余为无RNase去离子水，反应总体积通常为20 μ L0⑤MPL基因W515K位点突变荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测MPL基因W515L位点突变特异性的引物、探针组成1Χ的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号:210212,2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6m·M 的dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 MPL 基因 W515K 位点突变特异性上、下游引物(序列表中序列4、5) O. 3pmol/uL的MPL基因W515K位点突变特异性探针(序列表中序列6)、0. 25pmol/yL的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列11)、0· 25pmol/yL的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列12)、0· 3pmol/yL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列13)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被测样品DNA和内部阳性控制序列DNA)，其余为无RNase去离子水,反应总体积通常为20 μ L。⑥ABL内参基因荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测ABL内参基因的引物、探针组成=IX的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212, 2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/y L的ABL内参基因上游引物(序列表中序列7)、
0.25pmol/ μ L的ABL内参基因下游引物(序列表中序列8)、0· 3pmol/ μ L的ABL基因Taqman荧光探针(序列表中序列9)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。检测时，加入ABL基因标准品模板2 μ L,反应总体积通常为20 μ L。⑦内部阳性控制序列荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测内部阳性控制序列的引物、探针组成ix的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号=210212,2 XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/yL的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列11)、0· 25pmol/yL的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列12)、0· 3pmol/yL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列13)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。检测时，通常取1-2 μ L的模板(内部阳性控制序列DNA)，其余为无RNase去离子水，反应总体积通常为20 μ L03、PCR扩增程序的设定在Iightcycler仪器上先经过50°C 10s, 95°C IOmin,然后再经过95°C 15s，60°C lmin，共40个循环。实施例2.用实施例I制备的试剂盒检测MPL基因W515位点突变的以检测30例骨髓增殖性肿瘤患者骨髓组织标本结果为例。用本发明的试剂盒检测MPL基因W515L位点突变和MPL基因W515K位点突变的检测流程为首先根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。其次获取临床骨髓增殖性肿瘤患者骨髓组织样本，快速提取组织DNA;先配制ABL内参基因和内部阳性控制序列的荧光定量PCR反应液，将内部阳性控制序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为
1.OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线和ABL标准品标准曲线，然后再配制MPL基因W515L位点突变和MPL基因W515K位点突变的荧光定量PCR反应液，进行荧光定量PCR检测样品，在荧光定量PCR仪数据分析系统中读出CT值结果。PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，提示检测失败，则需要重新进行检测，如果其Ct值位于33 35之间，需要重复检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，分别计算MPL W515L基因突变(如图I所示)、MPL W515K基因突变(如图2所示)及ABL基因的Ct值，两者之差即为ACt值。最后，荧光定量PCR结果采用软件 分析，并标化计算样本数据。具体步骤如下①骨髓增殖性肿瘤患者骨髓组织基因组DNA的抽提按DNA抽提纯化的方法抽提骨髓增殖性肿瘤患者骨髓组织基因组DNA。②将上述提取的骨髓增殖性肿瘤患者骨髓组织基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算DNA的纯度与浓度，用无菌去离子水调节抽提的DNA至相同浓度，置冰箱_20°C保存。③将内部阳性控制序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为I. OxlO3、
I.OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用实施例I提供的内部阳性控制序列和ABL内参基因的荧光定量PCR反应液,分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线(如图I所示)和ABL标准品标准曲线(如图2所示)。④MPL基因W515L位点突变荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含I XPCR预混合液(Qiagen 公司，产品货号210212, 2XPCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、O. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG酶，MPL基因W515L位点突变特异性上、下游引物终浓度均为O. 2 μ mol/L, MPL基因W515L位点突变特异性Taqman荧光探针终浓度0. 3 μ mol/L,被提取的骨髓增殖性肿瘤患者骨髓组织基因组DNA2. O μ L，同时加入内部阳性控制序列上、下游引物的终浓度均为0. 2 μ mol/L，内部阳性控制序列Taqman荧光探针浓度0. 3 μ mol/L,终浓度为0. 2 μ mol/L的内部阳性控制序列，加入超纯水至总体积20 μ L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件950C IOmin预变性，然后95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑤MPL基因W515K位点突变荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含I XPCR预混合液(Qiagen 公司，产品货号210212, 2XPCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、
0.2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG酶，MPL基因W515K位点突变特异性上、下游引物终浓度均为0. 2 μ mol/L, MPL基因W515K位点突变特异性Taqman荧光探针终浓度0. 3 μ mol/L，被提取的骨髓增殖性肿瘤患者骨髓组织基因组DNA2. 0μ L，同时加入内部阳性控制序列上、下游引物的终浓度均为0. 2 μ mol/L，内部阳性控制序列Taqman荧光探针浓度0. 3 μ mol/L,终浓度为0. 2 μ mol/L的内部阳性控制序列，加入超纯水至总体积20 μ L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件950C IOmin预变性，然后95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑥ABL内参基因荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，产品货号:210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，ABL 基因引CN 102925559 A
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物终浓度O. 2 μ mol/L,探针终浓度O. 2 μ mol/L, ABL基因DNA1. OyL,加入无RNase去离子水补至总体积20 μ L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin预变性，然后95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑦阳性对照、阴性对照荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，产品货号:210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，MPL 基因W515K位点突变特异性和MPL基因W515L位点突变特异性的引物终浓度均为O. 2 μ mol/L，MPL基因W515K位点突变特异性和MPL基因W515L位点突变特异性的Taqman荧光探针终浓度均为O. 3 μ mol/L,阳性对照的DNA1. OyL或者阴性对照去离子水I. O μ L，加入无RNase去离子水补至总体积20 μ L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件为950C IOmin预变性，然后95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑧数据收集处理和分析PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，则需要重新进行检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，得出MPL基因W515L位点突变(如图I所示)和MPL基因W515K位点突变(如图2所示)相对于ABL内参基因的相对表达量后再进行统计分析，以比值大于或等于O. 0001为阳性表达，小于O. 0001为阴性表达(具体参见表I):表I为荧光定量PCR分析基因MPL基因W515位点突变在骨髓增殖性肿瘤中的表达
权利要求
1.一种检测MPL基因W515位点突变的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、荧光定量 PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于，所述检测用引物、荧光探针包括MPL基因 W515L位点突变特异性引物和MPL基因W515K位点突变特异性引物中的至少一种和内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中MPL基因W515L位点突变特异性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；MPL基因W515L位点突变特异性下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；MPL基因W515L位点突变特异性Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 3所示；MPL基因W515K位点突变特异性上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；MPL基因W515K位点突变特异性下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所示；MPL基因W515K位点突变特异性Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 7所不；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所不；ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:9所示。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、 内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中内部阳性控制序列如序列表中SEQ IDN0:10所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO: 11所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID NO: 12所示；内部阳性控制序列的Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 13所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述MPL基因W515L位点突变特异性 Taqman荧光探针、MPL基因W515K位点突变特异性的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman 荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA ;所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
4.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 14 所示。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有MPL基因W515L位点突变和MPL基因W515K位点突变的基因组DNA样品。
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR的混合液为1X的 PCR 预混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs,O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和无RNase去离子水。
全文摘要
本发明涉及一种检测MPL基因W515位点突变含量的试剂盒，属于生物技术领域。所述试剂盒包含MPL基因W515L位点突变特异性体系和MPL基因W515K位点突变特异性体系中至少一种体系及内参基因ABL体系，所述体系均包括上游引物、下游引物和Taqman荧光探针。研究表明MPL基因W515L位点突变和MPL基因W515K位点功能获得性突变率在PMF和ET中分别为10%和3%，而在PV中从未出现。因此，MPL基因W515L位点突变和MPL基因W515K位点突变主要用于诊断PMF和ET。采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR检测MPL基因W515L位点突变和MPL基因W515K位点突变，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高。本发明试剂盒为预测骨髓增殖性疾病的诊断提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
文档编号C12Q1/68GK102925559SQ20121037490
公开日2013年2月13日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者童永清, 李艳 申请人:童永清, 李艳