专利名称：一种产果糖基转移酶的菌株及其制备方法
技术领域：
本发明属于发酵工程和微生物育种的技术领域，特别涉及一种产果糖基转移酶的菌株及其制备方法。
背景技术：
低聚果糖是果糖基经β (2 — I)糖苷键连接而成的，聚合度为2 9的功能性低聚糖，属于食品原料。低聚果糖按结构分为蔗-果型低聚果糖和果-果型低聚果糖，其中蔗-果型低聚果糖主要由在蔗糖的果糖(F)残基上通过β (2 — I)糖苷键连接I 4个果糖基(F)所形成的蔗果三糖(GF2 )、蔗果四糖(GF3 )、蔗果五糖(GF4 )和蔗果六糖(GF5 )的混合物。果糖基转移酶能催化蔗糖生成蔗果低聚糖。其酶促反应机理最早由K. H. Jung等 报道，当以蔗糖为底物时，最初只有蔗果三糖(GF2)和葡萄糖(G)生成2GF — GF2+G，但随着反应进行下去，蔗果三糖(GF2)和蔗果四糖(GF3)也可以作为反应底物，其反应分别是2GF2 — GF3+G ；2GF3 — GF4+G (GF4 代表蔗果五糖)。K. H. Jung等用一个反应方程式来描述FTase的酶促反应GFn+GFn — GFn+1+GFn-l。以蔗糖为原料生产低聚果糖，果糖基转移酶是必需的催化剂。果糖基转移酶存在于植物以及微生物中。据文献报道，植物中的果糖基转移酶催化活性很弱，产率低，且受到季节限制，而来自微生物的果糖基转移酶比植物的催化活性高，且耐高温，可催化较高浓度的蔗糖进行转糖基反应，使用方便。目前，在亚洲国家，工业上主要是采用微生物果糖基转移酶作用于蔗糖，进行分子内转移果糖基反应来生产低聚果糖。具有果糖基合成酶活性的微生物包括丝状真菌、酵母菌和细菌。与植物来源的果糖基转移酶不同，多数微生物来源的果糖基转移酶往往同时具有转果糖基活性(Ut)和水解活性(Uh)，这些酶即可以转化蔗糖为低聚果糖，又可以催化水解蔗糖和低聚糖进行可逆反应，使低聚果糖降解。生产上常采用Ut/Uh值作为筛选高产果糖基转移酶微生物的依据。研究表明，不同微生物来源的果糖基转移酶的相对分子质量、米氏常数、最适作用温度、最适pH及基质特异性方面存在一定差异，如来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)的果糖基转移酶的分子质量为52kDa,最适温度为55 ,最适pH6. 5,而来源于微杆菌(Microbacterium sp.)的果糖基转移酶的分子质量46kDa,最适温度48°C,最适pH6. O。而同一微生物所产果糖基转移酶在不同PH下，Ut/Uh值不同，如来源于黑曲霉的果糖基转移酶在pH4. O 5. O和pH8. O时低聚果糖产量最高，而在pH5. O 8. O范围内的水解酶活力最高。由此可见，自然进化的微生物酶并不能保证在每一种条件下都能进行有效地催化，常常受到包括对非天然底物的催化缓慢、酶的稳定性低、在反应相中活力低、复合酶中反应体系不可选(如果糖基转移酶)等因素的限制，难以满足实际生产的需要。为了修改酶的特性而更适用于实际生产，各研究者采取不同的技术方法、从不同角度对现有酶进行改造，以期获得比天然酶更高的活力或不同的催化活性，提高酶的应用价值。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种产果糖基转移酶的菌株。本发明的另一目的在于提供所述的产果糖基转移酶的菌株的制备方法。本发明的目的通过下述技术方案实现一种产果糖基转移酶的菌株，名称为米曲霉scut209 (Aspergillus oryzae scut209),保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年4月10日，保藏编号为CCTCC N0:M2012106 ；所述的产果糖基转移酶菌株的菌落形态为疏松放线状，中部突起，颜色初呈乳白色，后渐变为带黄褐色至淡绿褐色；所述的产果糖基转移酶的菌株产果糖基转移酶产酶的能力达到34987U/g细胞， 比出发菌株提高了 78. 5%，具备较高工业应用价值；所述的产果糖基转移酶的菌株的制备方法，包含以下步骤(I)将出发菌株的孢子置于距离30w紫外灯25cm处，照射lOmin，红光下涂布于含质量百分比1.0%LiCl的PDA平板，30°C下培养2天，通过果糖基转移酶酶活力筛选比出发菌株活力高的菌株；(2)收集步骤(I)筛选得到的果糖基转移酶酶活力最高的6株菌株任意的孢子，分别制备得到原生质体；然后将6株菌株的原生质体分为两组，每组含3株菌株；将两组原生质体分别于8(TC下热灭活IOmin和30W紫外灯下25cm处灭活IOmin ;然后按照体积比I: I的比例混合；于30°C,在原生质体融合溶液的介导下原生质体融合5min后,用渗透压稳定剂稀释，将稀释液涂布于再生培养基，30°C下避光培养2d;将再生培养基平板上的再生单菌落分别接种于斜面培养基，30°C下培养，得到再生菌株孢子；(3)将步骤(3)得到的再生菌株孢子接种于发酵培养基中，28 30°C、150 200r/min培养2天，通过检测果糖基转移酶酶活力进行筛选，得到Fl代；(4)将Fl的果糖基转移酶酶活力最高的6株菌株任意的孢子，重复步骤(2 ) (4)，重复3次，得到产果糖基转移酶的菌株；步骤(I)中所述的出发菌株为产果糖基转移酶的米曲霉，优选为米曲霉(Aspeigillus oryzae) BLB-21,菌种保藏号 CMGCC No. 2951 ；步骤(I)中所述的出发菌株的孢子的浓度优选为IO5 IO7个/mL;步骤(2)中所述的原生质体的制备步骤优选为收集生长旺盛，孢子呈灰黑色的孢子，将其浓度调整为IO5 IO7个/mL ;采用25mmol/L β -巯基乙醇+5mmol/LEDTA-2Na的溶液体系处理20min，离心；用无菌水洗涤离心收集的孢子，在O. 6mol/L、pH7. O的山梨醇溶液+质量体积比2. 5%溶菌酶+质量体积比2. 0%蜗牛酶+质量体积比I. 5%纤维素酶组成的复合酶体系中，于35 37°C下进行酶解4 6h，制得原生质体；步骤(2)中所述的原生质体融合溶液的组成为质量百分比30%的聚乙二醇6000、O. 01mol/LCaCl2 和 O. 02mol/L MgCl2 ；步骤(2)中所述的渗透压稳定剂优选为O. 6mol/L、pH7. O的山梨醇溶液；步骤(2)中所述的再生培养基的组成优选为质量百分比3. 0%的白砂糖、质量百分比3. 6%的营养肉汤和质量百分比2. 0%的琼脂；步骤(3)中所述的发酵培养基的组成优选为质量百分比5. 0%的白砂糖、质量百分比的豆柏粉、质量百分比O. 3%的玉米粉和水。本发明的原理本发明通过基因组改组技术(Genome Shuffling)来改变菌株中果糖基转移酶的性质，以提高Ut/Uh比值，增加单位酶活力的低聚果糖产量。基因组改组技术是一门新兴的分子选育技术，它运用循环的基因组改组，在不需要弄清楚基因组序列数据或网络信息的情况下，即可以在全基因组的不同位置上同时发生改组，产出优势后代。基因组改组是整个基因组的定向进化，通过改组使分散的优点集中，是一个利用传统的育种方式结合了多个亲本的优点杂交过程。采用基因组改组技术进行菌种选育，筛选出最佳生产菌种，通过液态发酵培养后提取出果糖基转移酶，进而研究其最适反应温度、最适pH、最适底物浓度等，以求果糖基转移酶的最大产量化。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明所提供的产果糖基转移酶 的菌株产果糖基转移酶产酶的能力达到34987U/g细胞，比出发菌株提高了 78. 5%，具备有工业应用的价值。
图I是初始菌株的果糖基转移酶生产能力的HPLC测定图谱。图2是紫外与氯化锂复合诱变菌株的果糖基转移酶酶活力检测结果图。图3是原生质体融合第4代菌株的果糖基转移酶酶活力检测结果图。图4 是米曲霉(Aspergillus oryzae) scut209 的菌落形态图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中所用的果糖基转移酶活力测定方法为果糖基转移酶或产酶菌体作用于蔗糖，首先生成蔗果三糖(Ι-kestose);蔗果三糖含量测定方法采用HPLC法，试验方法按GB/T23528-20096. 5 执行。酶活力单位定义在酶供应者标识的最佳酶化反应的条件下，将蔗糖转化为低聚果糖，每分钟产生Iymol蔗果三糖所需酶量为一个酶活力单位(U)；
IOx 1000x67'；
_活力(U/g) = 0.504 xt xW =330.69* GF2/W.............................(I)式中10----10%(w/w)鹿糖溶液中的鹿糖总量，g ;GF2——蔗果三糖的百分含量，% ;O. 504----1 μ mo I 鹿果三糖=0. 504mg ；t----反应时间，60min;W----菌丝质量，g。高效液相色谱(HPLC)检测参数为=Cosmosil色谱糖柱；流动相乙腈-水(75%，v/y);流速:1. OmL/min ;示差折光检测器(RI) :Waters2410 ;监测器灵敏度:4 ;柱温:30°C；进样体积IO μ L0实施例I(I)出发菌株孢子悬液的制备实施方案以米曲霉(Aspeigillusoryzae)BLB_21(菌种保藏号CMGCC No. 2951;已在申请号为200910018452. I、名称为“一种米曲霉菌种及其制备高纯度低聚半乳糖的方法”中公开)为初始菌株。在本发明实验条件下，初始菌株经过三次斜面培养基(白砂糖5. 0%w/w,豆柏粉2. 0%w/w,玉米粉O. 3%w/w,琼脂2. 0%w/w ；以下所用的斜面培养基同此处)活化培养后，接种于IOOml发酵培养基(白砂糖5. 0%w/w,豆柏粉2. 0%w/w,玉米粉O. 3%w/w以及水，下同)中，30°C下摇瓶培养2天后过滤取出，进行菌丝体的果糖基转移酶酶活力测定，其测定结果如表I和图I所示。表I初始菌株果糖基转移酶生产能力HPLC测定的数据分析
权利要求
1.一种产果糖基转移酶的菌株,其特征在于名称为米曲霉scut209 (Aspergillusoryzae scut209)，保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年4月10日，保藏编号为CCTCC N0:M2012106o
2.权利要求I所述的产果糖基转移酶的菌株的制备方法，其特征在于包含以下步骤 (1)将出发菌株的孢子置于距离30w紫外灯25cm处，照射lOmin，红光下涂布于含质量百分比1.0%LiCl的PDA平板，30°C下培养2天，通过果糖基转移酶酶活力筛选比出发菌株活力高的菌株； (2)收集步骤(I)筛选得到的果糖基转移酶酶活力最高的6株菌株任意的孢子，分别制备得到原生质体；然后将6株菌株的原生质体分为两组，每组含3株菌株；将两组原生质体分别于8(TC下热灭活IOmin和30W紫外灯下25cm处灭活IOmin ;然后按照体积比I: I的比例混合；于30°C,在原生质体融合溶液的介导下原生质体融合5min后,用渗透压稳定剂稀释，将稀释液涂布于再生培养基，30°C下避光培养2d;将再生培养基平板上的再生单菌落分别接种于斜面培养基，30°C下培养，得到再生菌株孢子； (3)将步骤(3)得到的再生菌株孢子接种于发酵培养基中，28 30°C、150 200r/min培养2 天，通过检测果糖基转移酶酶活力进行筛选，得到Fl代； (4)将Fl的果糖基转移酶酶活力最高的6株菌株任意的孢子，重复步骤(2) (4)，重复3次，得到产果糖基转移酶的菌株。
3.根据权利要求2所述的产果糖基转移酶的菌株的制备方法，其特征在于步骤(I)中所述的出发菌株的孢子的浓度为IO5 IO7个/mL。
4.根据权利要求2所述的产果糖基转移酶的菌株的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的原生质体的制备步骤为收集生长旺盛，孢子呈灰黑色的孢子，将其浓度调整为IO5 IO7个/mL ;采用25_ο1/1β -巯基乙醇+5mmol/LEDTA-2Na的溶液体系处理20min，离心；用无菌水洗涤离心收集的孢子，在O. 6mol/L、pH7. O的山梨醇溶液+质量体积比2. 5%溶菌酶+质量体积比2. 0%蜗牛酶+质量体积比I. 5%纤维素酶组成的复合酶体系中，于35 37°C下进行酶解4 6h，制得原生质体。
5.根据权利要求2所述的产果糖基转移酶的菌株的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的原生质体融合溶液的组成为质量百分比30%的聚乙二醇6000、0. 01mol/LCaCl2和O.02mol/L MgCl2。
6.根据权利要求2所述的产果糖基转移酶的菌株的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的渗透压稳定剂为O. 6mol/L、pH7. O的山梨醇溶液。
7.根据权利要求2所述的产果糖基转移酶的菌株的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的再生培养基的组成为质量百分比3. 0%的白砂糖、质量百分比3. 6%的营养肉汤和质量百分比2. 0%琼脂。
8.根据权利要求2所述的产果糖基转移酶的菌株的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的发酵培养基的组成为质量百分比5. 0%的白砂糖、质量百分比的豆柏粉、质量百分比O. 3%的玉米粉和水。
全文摘要
本发明公开了一种产果糖基转移酶的菌株及其制备方法。本发明首先通过氯化锂和紫外诱变筛选菌株，再通过基因组改组技术来改变菌株中果糖基转移酶的性质，最终得到本发明提供的产果糖基转移酶的菌株。该菌株名称为米曲霉scut209，保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年4月10日，保藏编号为CCTCC NOM 2012106。其产果糖基转移酶产酶的能力高，达到34987U/g细胞，具备了较高的工业应用价值。
文档编号C12N1/14GK102899256SQ20121037466
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者张毅, 曾宪经, 林晓珊, 何小妮, 陈子健 申请人:量子高科(中国)生物股份有限公司, 华南理工大学