专利名称：一种检测PML-RARa融合基因mRNA表达量的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的荧光定量PCR技术，具体涉及一种检测PML-RARa融合基因mRNA表达量的试剂盒。
背景技术：
急性早幼粒细胞性白血病(Acute Promyelocytic Leukemia, APL)是急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)中的一种亚型，约占成人AML患者的10% 15%，病人常较年轻，年龄多在3(Γ38岁之间，10岁以下者比较罕见。据统计，国内APL发病率高于西方国家的10%左右，占AML的18. 7%，部分地区比如东北油田的发病率则高达20°/Γ30%。因此， APL存在年龄、种族与地域的差异。
近十余年来，由于全反式维甲酸和三氧化二砷的应用，采用双诱导治疗能够使得 APL的初期诱导缓解率达到90%以上。药物诱导治疗之后，给予短程化疗和结合以维甲酸和三氧化二砷的药物进行维持治疗，可以使病人在2年左右的时间结束治疗并且临床治愈率闻达90%ο
目前，APL的病因尚不明确，但是随着分子生物学、细胞遗传学等学科的快速发展， 人们对于APL分子生物学发病机制有了比较深入的了解。超过90%的APL发病的关键机制为t (15 ；17) (q22 ;q21)，导致15号染色体上PML基因和17号染色体上的RARa基因形成 PML-RARa融合基因。易位使15q22上的PML基因与17q21上的维甲酸受体α基因发生交互性重排，分别在15号染色体上形成PML-RARa融合基因和RARa-PML融合基因。研究表明， 患者的白血病细胞均有PML-RARa融合基因的表达，仅有70% 80%的患者同时表达PML-RARa 融合基因，说明PML-RARa融合基因是致病的关键。根据PML断裂点的位置不同，PML-RARa 融合基因有三种亚型bcrl、bcr2和bcr3，分别称为长型(L型)、变异型(V型)和短型(S型)， 发生的概率则依次为55%、5%和40%。PML-RARa融合蛋白作为一种变异的维甲酸受体，相较于野生型RARa蛋白具有不同的DNA特性,是维甲酸(retinoic acid,RA)信号的抑制物,通过不同的途径称为内在而有效的RARa靶基因转录因子抑制物。
因此，当患者检测出PML-RARa融合基因突变时，可作为急性早幼粒细胞性白血病的诊断依据，也可作为对全反式维甲酸和砷剂治疗疗效预测的分子标志。
目前可用于PML-RARa融合基因的方法有探针杂交法、基因芯片法、质谱法、基因测序法及免疫荧光法等。探针杂交法假阳性率较高；基因芯片法成本高、制备方法繁琐；质谱法难以在普通医疗机构开展；基因测序法虽敏感性和特异性高，但价格比较昂贵，而且操作较繁琐，耗时较长。免疫荧光法检测PML-RARa融合基因定量表达可高通量完成临床样品检测，且特异性和敏感性都很高，其敏感性和特异性均高于直接免疫荧光检测等方法。实时荧光定量PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)与免疫荧光法相比具有特异性增强、灵敏度提高和检测快速、降低了污染等特点，且目前尚未有实时荧光定量PCR方法检测PML-RARa融合基因。CN 102925558 A书明说2/11 页发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种采用荧光定量PCR技术检测 PML-RARa融合基因mRNA表达量的试剂盒。所述技术方案如下
一种检测PML-RARa融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、 cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括PML-RARaL融合基因引物、PML-RARaV融合基因弓丨物和PML-RARa S融合基因引物中的至少一种和内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中
PML-RARa L融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；
PML-RARa L融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
PML-RARa L融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；
PML-RARa V融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；
PML-RARa V融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；
PML-RARa V融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；
PML-RARa S融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；
PML-RARa S融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示；
PML-RARa S融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:9所示；
ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:10所不；
ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示；
ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 12所示；
所述cDNA第一链合成试剂含有MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、 Oligo (dT) 15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和无 RNase 去离子水。
进一步地，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和 Taqman荧光探针，其中内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO: 14所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中 SEQ ID NO: 15所示；内部阳性控制序列Taqman突光探针如序列表中SEQ ID NO: 16所示。
进一步地，所述PML-RARa L融合基因Taqman荧光探针、PML-RARa V融合基因 Taqman荧光探针、PML-RARa S融合基因Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的 5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA ;所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
具体地，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 17所示。
具体地，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有PML-RARa L融合基因、 PML-RARa V融合基因和PML-RARa S融合基因的总RNA样品。
具体地，所述第一链cDNA合成试剂为25mmol/L MgCl2 4 μ L，10 X逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP2 μ L, RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L，Oligo (dT) 15 O. 5ug, AMV 逆转录酶 I. 5U 和无RNase去离子水,总体积11 μ L。
具体地，所述荧光定量PCR的混合液(以反应体系终浓度表示)为I X的PCR预混合液(原液为 2 XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、。· 2-0. 4mM 的 dNTPs,O. 3-0. 6mM 的 dUTP、O.2U/ μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶以及无RNase去离子水。4
本发明试剂盒的优点和效果如下
(I)敏感性高可重复敏感度为O. 01%，即10000个细胞中有一个含PML-RARa融合基因就可以被检测出。
(2)特异性强使用特异性探针对定量分子进行识别，准确性高。同时，靶序列由弓I物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。
(3)简便安全操作简单、安全、自动化程度高而且防止污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易被污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，无需要担心放射性污染。
(4)全程监控本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。
(5)快速速度快、高通量，可在3-4小时完成。
本发明的试剂盒能快速、准确、定量检测PML-RARa融合基因mRNA水平，有效杜绝了假阳性和假阴性的发生，用于急性早幼粒细胞性白血病的诊断及治疗过程中微小残留病的监测，为急性早幼粒细胞性白血病的诊断、制定治疗方案及疗效评价和预后提供了重要的检测手段。
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。·
图IA是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增 I. OxlO6-L OxlO3拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图IB是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增 I. OxlO6-L OxlO3拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图得到的标准曲线图2A是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增 I. OxlO6-L OxlO3拷贝的ABL标准品的荧光曲线图2B是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增I.OxlO6-L OxlO3拷贝的ABL标准品荧光曲线图得到的标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例I.试剂盒的制备
I、特异性的引物和荧光探针的设计
根据基因序列(ABL基因序列、PML基因序列和RARa基因序列来源于美国国家生物技术信息中心核酸数据库，其中ABL基因ID分别为25，参考序列号为NM_005157. 4 ；PML 基因ID分别为5371，参考序列号为NG_029036. I ;RARa基因ID分别为5914，参考序列号为 NG_027701. I)分别设计对上述各基因序列特异的引物和荧光探针。
2、按照下列试剂盒的组成配制试剂盒的各组分
本发明试剂盒组成如下
①RNA 提取试剂=Trizol 试剂(Invitrogen 公司，产品货号15596-026/100ml), 每Iml骨髓组织加入ImlTrizol快速提取急性早幼粒细胞性白血病患者骨髓组织RNA。
②cDNA 第一链合成试剂盒(RTPCR) (Fermentas 公司，产品货号K1622):25mmol/ L MgCl2 4 μ L，IOX 逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP2 μ L, RNA 酶抑制剂(RNasin，一种酸性糖蛋白)O. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g, AMV逆转录酶I. 5U和无RNase去离子水。
③引物、探针和标准品包括PML-RARa融合基因引物、内部阳性控制序列、内部阳性控制序列引物、内参基因ABL引物以及与引物对应的Taqman荧光探针，具体如下
PML-RARa L融合基因上游引物序列5’-TCTTCCTGCCCAACAGCAA-3’(序列表中序列I);
PML-RARa L 融合基因下游引物序列5’-GCTGGGCACTATCTCTTCAGAAC-3’(序列表中序列2)；
PML-RARa L 融合基因 Taqman 荧光探针FAM5’-CAGCCATGAGACCCA_3’TAMRA (序列表中序列3)；
PML-RARa V 融合基因上游引物序列5’-GGACCTCAGCTCTTGCATCAC-3’(序列表中序列4)；
PML-RARaV 融合基因下游引物序列5’-GCTGGGCACTATCTCTTCAGAAC-3’(序列表中序列5)；
PML-RARa V 融合基因 Taqman 荧光探针FAM5’-AAGCCATTGAGACCCAG_3’TAMRA (序列表中序列6)；
PML-RARa S 融合基因上游引物序列5’-GAAGGTCATCAAGATGGAGTCTGA_3’(序列表中序列7)；
PML-RARa S融合基因下游引物序列5’-TGCTGCTCTGGGTCTCAATG_3’(序列表中序列8)；
PML-RARa S 融合基因 Taqman 荧光探针FAM5’ -AAGGAGGCAAGGTTGG-3’ TAMRA (序列表中序列9)；
内部阳性控制序列为5’ -UCUUCCUGCCGAACAGCUACCACGUGGCCAGUGGCGCCGGGGAGGCA GCGAUUCAGACCCAGAGCAGCACUUGUGAAGAGAUAGUGCCCAGC-3’(序列表中序列 13)；
内部阳性控制序列上游引物序列为5’-TCTTCCTGCCGAACAGCTA-3’(序列表中序列 14)；
内部阳性控制序列下游引物序列为5’-GCTGGGCACTATCTCTTCACAAG-3’(序列表中序列15)；
内部阳性控制序列Taqman 荧光探针TET5’ -CAGCGATTCAGACCCA-3’ TAMRA (序列表中序列16)。
ABL 基因序列为5’ -CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCT GGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCAT AACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCC AAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCC6CGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGG C-3’(序列表中序列17)；
ABL基因上游引物序列为5’-CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3’(序列表中序列10);
ABL基因下游引物序列为5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列11)；
ABL 基因 Taqman 荧光探针FAM5’ -TGGTGTGAAGCCC-3’ TAMRA (序列表中序列 12);
其中，内部阳性控制序列为人工合成序列，包含一部分已知的PML-RARa融合基因序列和一部分人工合成序列；内部阳性控制序列和ABL基因序列分别用作标准品。
上述引物序列、控制序列、基因序列和Taqman荧光探针序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
④阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有PML-RARa融合基因总RNA样品为阳性对照，采用上述实施例I中提供的本发明试剂盒组成①RNA提取试剂 Trizol试剂(Invitrogen公司，产品货号15596-026/100ml),按每Iml骨髓组织加入Iml Trizol试剂的比例，快速提取已经确诊的含有PML-RARa融合基因的急性早幼粒细胞性白血病患者的骨髓组织RNA，作为阳性对照。
⑤PML-RARa L融合基因荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测MPL 基因W515L位点突变特异性的引物、探针组成1X的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、 O. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 PML-RARa L 融合基因上游引物(序列表中序列1)、0. 25pmol/yL的PML-RARa L融合基因下游引物(序列表中序列2)、0· 3pmol/ μ L的PML-RARa L融合基因Taqman突光探针(序列表中序列3)、0· 25pmol/ μ L的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列14)、0. 25pmol/yL的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列15)、0. 3pmol/yL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列16)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被测样品RNA反转录合成的cDNA和内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA)，其余为无 RNase去离子水,反应总体积通常为20 μ L。
⑥PML-RARa V融合基因荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测MPL 基因W515L位点突变特异性的引物、探针组成1Χ的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、O.2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 PML-RARa V 融合基因上游引物(序列表中序列4)、0. 25pmol/yL的PML-RARaV融合基因下游引物(序列表中序列 5)、0· 3pmol/ μ L的PML-RARa V融合基因Taqman突光探针(序列表中序列6)、0· 25pmol/ μ L的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列14)、0. 25pmol/yL的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列15)、0. 3pmol/yL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列16)、0. 3pmol/yL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列13)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被测样品RNA反转录合成的cDNA和内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA),其余为无RNase去离子水， 反应总体积通常为20 μ L0
⑦PML-RARa S融合基因荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测MPL 基因W515L位点突变特异性的引物、探针组成1Χ的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货CN 102925558 A书明说6/11 页号210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、 O. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 PML-RARa S 融合基因上游引物(序列表中序列7)、0. 25pmol/yL的PML-RARa S融合基因下游引物(序列表中序列 8)、0· 3pmol/ μ L的PML-RARa S融合基因Taqman突光探针(序列表中序列9)、0· 25pmol/ μ L的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列14)、0. 25pmol/yL的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列15)、0. 3pmol/yL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列16)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被测样品RNA反转录合成的cDNA和内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA)，其余为无 RNase去离子水,反应总体积通常为20 μ L。
⑧ABL内参基因荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测ABL内参基因的引物、探针组成=IX的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/y L的ABL内参基因上游引物(序列表中序列 10 )、0· 25pmol/ μ L的ABL内参基因下游引物(序列表中序列11 )、0· 3pmol/ μ L的ABL基因 Taqman荧光探针(序列表中序列12)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。检测时，加入ABL基因标准品模板2 μ L,反应总体积通常为20 μ L。·
⑨内部阳性控制序列荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测内部阳性控制序列的引物、探针组成I X的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/yL的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列11)、0. 25pmol/yL的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列12)、0. 3pmol/ μ L的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列13)(以上所有的浓度都是指PCR 反应体系的终浓度)。检测时，通常取1-2 μ L的模板(内部阳性控制序列RNA反转录合成的 cDNA),其余为无RNase去离子水,反应总体积通常为20 μ L。
3、PCR扩增程序的设定在Iightcycler仪器上先经过50°C 10s, 95°C IOmin,然后再经过95°C 15s，60°C lmin，共40个循环。
实施例2.用实施例I制备的试剂盒检测PML-RARa融合基因mRNA的表达量
以检测30例急性早幼粒细胞性白血病骨髓组织标本结果为例，其中，患者检测出 PML-RARa融合基因形式包括PML-RARa L融合基因、PML-RARa V融合基因和PML-RARa S融合基因。用本发明的试剂盒检测PML-RARa融合基因mRNA表达量的检测流程为首先根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。其次获取临床急性早幼粒细胞性白血病患者骨髓组织样本，快速提取组织RNA，进行逆转录PCR合成cDNA第一链；先配制ABL内参基因和内部阳性控制序列的荧光定量PCR反应液，将内部阳性控制序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线(如图IA和图IB所不)和ABL标准品标准曲线(如图2A和图2B所不)，然后再配制PML-RARa融合基因PCR反应液进行荧光定量PCR检测样品，在荧光定量PCR仪数据分析系统中读出CT值结果。PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其 Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，提示检测失败，则需要重新进行检测，如果其Ct值位于33 35之间，需要重复检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，8将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，分别计算PML-RARa融合基因及ABL基因的Ct值， 两者之差即为ACt值。最后，荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。
具体步骤如下
①急性早幼粒细胞性白血病患者骨髓组织总RNA的抽提按RNA抽提纯化的方法抽提急性早幼粒细胞性白血病患者骨髓组织总RNA。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算RNA的纯度与浓度，用0.1% DEPC处理的水调节抽提的RNA至相同浓度。
②反转录合成cDNA :取2 μ L上述RNA提取液，在70°C保温lOmin，随后加入实施例I提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl2 4 μ L，IOX 逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs2 μ L，RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g 和 AMV逆转录酶I. 5U,补加无RNase去离子水至总体积20 μ L,于42°C保温15min,进行逆转录反应，合成cDNA第一链。反应结束后，加热至99°C，5min以灭活逆转录酶，加20 μ L无菌水混匀置冰箱_20°C保存。
取I μ L浓度为2 μ g/ml内部阳性控制序列RNA (序列表中序列13)，在70°C保温 IOmin随后加入实施例I提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/ L MgCl24y L，IOX 逆转录酶缓冲液 2μ L，10mmol/L dNTPs2 μ L，RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L， Oligo (dT) 15 O. 5 μ g和AMV逆转录酶I. 5U，补加无RNase去离子水至总体积20 μ L，于42°C 保温15min,进行逆转录反应,合成cDNA。反应结束后,加热至99°C, 5min以灭活逆转录酶， 加20 μ L无菌水混匀置冰箱_20°C保存。
取I μ L浓度为2 μ g/ml的阳性对照RNA，在70°C保温lOmin，随后加入实施例I 提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl2 4yL,10X逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs2 μ L, RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L，Oligo (dT) 15 O. 5 μ g 和 AMV 逆转录酶I. 5U,补加无RNase去离子水至总体积20 μ L,于42°C保温15min,进行逆转录反应，合成cDNA。反应结束后，加热至99°C，5min以灭活逆转录酶，加20 μ L无菌水混匀置冰箱-20°C保存。
③将内部阳性控制基因序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为1.OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用实施例I提供的内部阳性控制序列和ABL内参基因的荧光定量PCR反应液，分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线(如图IA和图IB所示)和ABL标准品标准曲线(如图2A和图2B所示)。
④PML-RARa融合基因荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :1 XPCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，PML-RARa L融合基因、PML-RARa V融合基因及PML-RARa S融合基因上、下游引物终浓度各0. 2 μ mol/ L，加入相应的PML-RARa L融合基因、PML-RARa V融合基因及PML-RARa S融合基因各 Taqman荧光探针终浓度0. 3ymol/L，cDNAl. O μ L，同时加入内部阳性控制序列上、下游引物终浓度各0. 2 μ mo I/L和内部阳性控制序列Taqman荧光探针终浓度0. 3 μ mol/L,终浓度为0. 2 μ mol/L的内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA (②中反转录合成的cDNA)，加入超纯水至总体积20 μ L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin 预变性，然后95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。
⑤ABL内参基因荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含2XPCR混合液 (Qiagen公司，产品货号210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，ABL 基因引物终浓度0.2 4 11101/1，探针终浓度0.2 4 11101/1，481^基因cDNAl. O μ L，加入无RNase去离子水补至总体积20 μ L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin预变性，然后95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。
⑥阳性对照、阴性对照荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，产品货号210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，PML-RARa 融合基因引物终浓度O. 2 μ mol/L,探针终浓度O. 3 μ mol/L,阳性对照RNA反转录合成的 cDNAl. 0μ L或者阴性对照去离子水I. 0μ L，加入无RNase去离子水补至总体积20 μ L。 在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin预变性，然后95°C 15s, 60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。
⑦数据收集处理和分析PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果， 如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，则需要重新进行检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，得出 PML-RARa融合基因(PML-RARa L融合基因、PML-RARa V融合基因或PML-RARa S融合基因) 相对于ABL内参基因的相对表达量后再进行统计分析，以比值大于或等于O. 0001为阳性表达，小于O. 0001为阴性表达(具体参见表I)
表I为荧光定量PCR分析PML-RARa融合基因在急性早幼粒细胞性白血病中的表达
权利要求
1.一种检测PML-RARa融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、 cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于，所述检测用引物、荧光探针包括PML-RARaL融合基因引物、PML-RARa V融合基因引物和PML-RARa S 融合基因引物中的至少一种和内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中PML-RARa L融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；PML-RARa L融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；PML-RARa L融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；PML-RARa V融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；PML-RARa V融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所示；PML-RARa V融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；PML-RARa S融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示；PML-RARa S融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示；PML-RARa S融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:9所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 10所不；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所不；ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 12所示；所述cDNA第一链合成试剂含有MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、 Oligo (dT) 15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和无 RNase 去离子水。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、 内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO: 14所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID NO: 15所示；内部阳性控制序列Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 16所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PML-RARaL融合基因Taqman荧光探针、PML-RARa V融合基因Taqman荧光探针、PML-RARa S融合基因Taqman荧光探针和 ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团 TAMRA ;所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
4.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 17 所示。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有PML-RARa L融合基因、PML-RARa V融合基因和PML-RARa S融合基因的总RNA样品。
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述cDNA第一链合成试剂为25mmol/ L MgCl2 4μ L，IOX 逆转录酶缓冲液 2μ L，10mmol/L dNTP2 μ L，RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L， Oligo (dT) 15 O. 5 μ g, AMV逆转录酶I. 5U和无RNase去离子水，总体积IluL0
7.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR的混合液为1X的 PCR 预混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、。· 2-0. 4mM 的 dNTPs,O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和无RNase去离子水。
全文摘要
本发明涉及一种检测PML-RARa融合基因mRNA表达量的试剂盒，属于生物技术领域，所述试剂盒包括PML-RARa L融合基因体系、PML-RARa V融合基因体系和PML-RARa S融合基因体系中的至少一种体系以及内参基因ABL体系，所述体系均包括上游引物、下游引物和Taqman荧光探针。PML-RARa融合蛋白作为一种变异的维甲酸受体，相较于野生型RARa蛋白具有不同的DNA特性，是RA信号的抑制物，通过不同的途径成为内在而有效的RARa靶基因转录因子抑制物。因此，采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR检测PML-RARa融合基因mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高，为预测急性早幼粒细胞性白血病的预后以及化疗方案的确定提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
文档编号C12Q1/68GK102925558SQ20121037470
公开日2013年2月13日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者童永清, 李艳 申请人:童永清, 李艳