专利名称：scFvC6.5－sTrail融合基因和蛋白及制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及靶向抗肿瘤药物和基因重组技术，具体地说是scFvC6.5-sTrail融合基因和蛋白及制备，尤其是细胞因子免疫毒素scFvC6.5-sTrail及其制备和应用。
背景技术：
免疫毒素是由靶向肿瘤细胞的抗体分子与细胞毒效应分子相连所产生的组合分子，主要用于靶向治疗肿瘤或自身免疫性疾病。免疫毒素发展至今经历了三代历程，重组免疫毒素(recombinantimmunotoxin)被认为是第三代免疫毒素，它是通过基因工程方法将抗体功能区或生长因子的基因与突变形式的毒蛋白基因融合表达产生。重组免疫毒素具有适于工业化、生产成本低、对实体瘤渗透性高、免疫原性小等优点。
对于重组免疫毒素进行基因工程和蛋白质工程方面的改造称为免疫毒素工程(Engineering of immunotoxins)。对免疫毒素的改造可分为抗体部分和毒素部分两个方面。对免疫毒素进行改造的目的是为了尽量降低免疫原性、增加特异杀伤作用、保证合理的半衰期、减小非特异性毒副作用。
Her2/neu是具有酪氨酸蛋白激酶活性的癌基因，编码一种分子量185KDa的单链跨膜糖蛋白激酶，称之为p185或HER2/neu。这种蛋白与表皮生长因子受体高度同源，属于表皮生长因子家族成员之一。此家族还包括EGFR(HER1/ErbB1)、HER2/neu(c-neu/erbB2)、HER3(ErbB3)及HER4(tyro2/ErbB4)。它们编码的蛋白均具有内在的酪氨酸激酶活性。同属于受体酪氨酸激酶超家族。Her2/neu过度表达在人类多种肿瘤组织中，如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌等，已经成为这些肿瘤的靶分子。也使其成为肿瘤一个亚类发生发展的标志物，靶向HER2/neu的研究是近年来研究的热点。另外临床研究发现HER2/neu过度表达的癌细胞对sTrail的作用不敏感，其通过抵抗二者的细胞毒作用，使肿瘤细胞逃逸宿主防御机制而促进肿瘤发生。
Trail(TNF相关的凋亡诱导配体，TNF-related apoptosis-inducedligand)是近几年发现的一种具有抗肿瘤活性的肿瘤坏死因子家族的新成员，它通过Trail受体介导肿瘤细胞凋亡效应。Trail自从问世以来就在肿瘤治疗领域引起广泛重视，现有的研究证实，Trail对于来自胃、卵巢、结肠、肺、乳腺、肾、前列腺、脑和皮肤的恶性肿瘤中的大多数有细胞生长抑制和细胞杀伤效应，而人体的正常细胞除了肝脏细胞外则对Trail诱导的凋亡耐受。无论是膜形式Trail(memberaneTrail，mTrail)还是可溶性Trail(soluble Trail，sTrail)都具有抗肿瘤活性，目前Trail的可溶形式蛋白已经通过原核和真核两种途径表达出来，体外及体内生物学试验均证明它的特异抗肿瘤活性。
sTrail相关的免疫毒素的研究刚刚起步，目前世界上构建成功的此类毒素只有两例。
发明内容
为了增加过度表达HER2/neu的肿瘤细胞对sTrail的敏感性和提高HER2/neu抗体的肿瘤杀伤效应，申请人构建了一个新的由人源化抗HER2/neu单链抗体(scFvC6.5)和人sTrail组成的免疫毒素scFvC6.5-sTrail，并鉴定了其免疫特异性和生物活性；结果显示重组免疫毒素能够特异识别和杀伤HER2/neu阳性卵巢癌细胞SKOV-3和乳腺癌细胞MCF-7，对HER2/neu阴性黑色素瘤细胞A375没有影响；提示它在抗HER2/neu过度表达的肿瘤靶向治疗中具有潜在的应用价值。
本发明的目的是提供一种特异性强，渗透力高，对HER2/neu过度表达的肿瘤细胞具有靶向杀伤能力的细胞因子类免疫毒素，scFvC6.5-sTrail融合基因和蛋白及制备。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种scFvC6.5-sTrail融合基因，具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列；其编码蛋白具有序列表SEQ ID NO2中的氨基酸序列。
scFvC6.5-sTrail融合基因的制备以人源化单链抗体scFvC6.5和人的可溶性TNF相关的凋亡诱导配体sTrail基因的114-281碱基片断为模板，进行PCR，扩增产物经琼脂糖电泳回收后，经双酶切，插入到表达载体pET28a中，进行酶连接反应，得到pET28a-scFvC6.5-sTrail；scFvC6.5-sTrail融合蛋白的制备pET28a-scFvC6.5-sTrail转化致大肠杆菌BL21(DE3)中，进行表达；SDS-PAGE证明蛋白scFvC6.5-sTrail主要以包含体形式存在于菌体中；利用组氨酸残基与Ni+结合的原理，应用金属螯合柱层析梯度复性，将包含体蛋白进行了变性复性和纯化，得到了纯化的scFvC6.5-sTrail融合蛋白。
所述scFvC6.5-sTrail融合基因的编码蛋白可用于制备对高表达HER2/neu的肿瘤细胞具有强特异性杀伤作用的药物中，可使scFvC6.5-sTrail所诱导的肿瘤细胞凋亡。
本发明具有如下优点1.scFvC6.5-sTrail融合基因经过表达、变性、复性纯化得到免疫毒素scFvC6.5-sTrail；而scFvC6.5-sTrail融合蛋白中的scFvC6.5为人源化抗体，sTrail为来自人本身的细胞因子，避免了实际应用中可能出现的免疫原性。
2.scFvC6.5-sTrail基因为人工制备的一种新的融合基因，属首次制得的基因，该基因的表达可用于抗HER2/neu高表达的肿瘤靶向治疗的研究。体外实验证实该融合蛋白对HER2/neu高表达的肿瘤细胞具有明显杀伤作用，而对HER2/neu阴性的细胞没有杀伤作用，显示出肿瘤杀伤强特异性。该免疫毒素为细胞表面过度表达HER2/neu的肿瘤靶向治疗展示了潜在的应用前景；融合毒素scFvC6.5-sTrail分子量为47KDa，具有渗透实体瘤的能力。
3.本发明提供了一种制备融合毒素scFvC6.5-sTrail的工艺方法，据此方法可以制得分析纯的scFvC6.5-sTrail蛋白；应用本发明，可进一步提供直接用于生产融合毒素scFvC6.5-sTrail的工程菌株。
图1为scFvC6.5-sTrail融合基因在大肠杆菌中表达电泳图其中1为中分子量蛋白标准，2为融合蛋白纯品，3为诱导后细胞周质蛋白，4为诱导后细胞菌体蛋白，5为未诱导的工程菌菌体蛋白(阴性对照)。
具体实施例方式
实施例1一种scFvC6.5-sTrail融合基因，具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列。
CATATGCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGGGGCAGAGTTGAAAAAACCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGCCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTACATGGGGCTCATCTATCCTGGTGACTCTGACACCAAATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGTCGACAAGTCCGTCAGCACTGCCTACTTGCAATGGAGCAGTCTGAAGCCCTCGGACAGCGCCGTGTATTTTTGTGCGAGACATGACGTGGGATATTGCAGTAGTTCCAACTGCGCAAAGTGGCCTGAATACTTCCAGCATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTCACACCAATCGGCCCGCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGTTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTGCGGCCGCAGGTGGAGGCGGATCCGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGCAACACATTGTCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCTGAGCAACTTGCACTTGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAACACAAAGAACGACAAACAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTATCCTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAAGATGCAGAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGGGCCTTTTTAGTTGGCCTCGAG(1)SEQ ID NO1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度1305碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源scFvC6.5cDNA和sTrail cDNA(2)scFvC6.5-sTrail融合基因的制备为了获得pET28a-scFvC6.5-sTrail融合基因，设计并合成了2对引物一对scFvC6.5引物和一对sTrail引物。
scFvC6.5Primer15`-gggtttcatatgcaggtgcagctggtgc-3`，含NdeI酶切位点。
scFvC6.5Primer25`-atttgcggccgcacctaggacggtcagc-3`含NotI酶切位点。
sTrail Primer15`-atttgcggccgcaggtggaggcggatccgtcaggtcatcttcac-3`含NotI酶切位点及Gly4Ser连接肽。
sTrail Primer25`-aattctcgagcagggcaataatcccaaag-3`含XhoI酶切位点。
用上述引物分别PCR扩增scFvC6.5和sTrail基因，条件为scrvC6.5进行PCR条件
变性94℃，30sec；退火58℃，30sec；延伸72℃，1min；35个循环；最后72℃延伸10min。
sTrail进行PCR条件变性94℃，30sec；退火62℃，30sec；延伸72℃，1min；35个循环；最后72℃延伸10min。
PCR扩增产物经琼脂糖电泳回收后，用NdeI和NotI酶切scFvC6.5基因，用NotI和XhoI酶切sTrail基因。将NedI和XhoI酶切后的载体pET28a与scFvC6.5和sTrail酶切片段按照1∶3∶3的比例混合后，加入T4DNA连接酶在16℃过夜进行连接反应。
酶连接反应体系(30μl)
将酶连接后的混合物转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。感受态细胞的制备，CaCl2转化方法，质粒DNA的提取鉴定参考《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯，科学出版社1998年版。
卡那霉素平板筛选，挑取阳性克隆，接种于5mlLB(50μg/ml卡那霉素)培养基，37℃，220rpm培养过夜，小量提取质粒，进行测序。送至上海联合基因生物公司进行测序；对转化子的测序结果表明，DNA序列测定结果显示scFvC6.5-sTrail的DNA序列及读码框完全正确。
(3)重组子pET28a-scFvC6.5-sTrail在大肠杆菌中的表达将上述重组菌扩大培养于500mlLB培养液(50μg/ml卡那霉素)中，37℃，220rpm培养至OD600nm＝0.5。加入IPTG至终浓度为1mM，诱导表达4h。4000g离心20min收集菌体。
(4)融合蛋白scFvC6.5-sTrail的变性、复性及纯化PBS洗涤菌体一次。菌体经50ml 50mM Tris·HCl pH8.3重悬后，超声破碎。12000g离心30min，得到上清和沉淀。对上清和沉淀分别进行SDS-PAGE及Western-blot鉴定，发现scFvC6.5-sTrail蛋白主要以包含体形式存在。依次用2.5M NaCl、0.05％TritonX-100及2M脲素洗涤scFvC6.5-sTrail的包含体后，10,000rpm离心30min，洗涤后的包含体按2mg/ml浓度溶解在变性液(8M脲素，50mMTris·HCl，pH8.3)中，4℃搅拌过夜，0.45μm微膜过滤，准备上柱纯化。
应用IMAC梯度复性法进行产物蛋白的纯化及复性。5mlChelating Sepharose装柱后经Ni离子饱和，用变性液平衡柱体。将10ml变性的包涵体加入柱中，4℃孵育5h。用变性液将基线洗平，然后用200ml的线性梯度逐步由含8M脲素的变性液过渡到复性缓冲液(50mMTris·HCl，pH8.3)中。然后用洗脱液(0.5M咪唑，50mMTris·HCl，pH8.3)将复性后的蛋白洗出柱子。洗脱样品在透析液(含10％甘油的PBS溶液)中透析过夜。保留各洗脱产物，分取10μl，进行SDS-PAGE，以鉴定蛋白纯化情况。其中第一抗体为抗sTrail鼠单克隆抗体抗体，第二抗体为HRP标记的羊抗鼠抗体，底物为Supersignal发光底物。
(5)融合蛋白scFvC6.5-sTrail的SDS-PAGE检测将scFvC6.5-sTrail诱导前后的菌体蛋白与上样6×上样缓冲液30μl体系，混匀后在100℃煮5min，取5ul进行12％SDS-PAGE。考马斯亮蓝染色，结果用紫外凝胶成像系统检测蛋白的表达。
结果比较诱导后工程菌的细胞全蛋白电泳带和诱导前工程菌的细胞全蛋白电泳带，发现在47KDa处的蛋白带明显增粗，包含体纯化后蛋白带就在此处，正符合scFvC6.5-sTrail的分子大小。参见图1，紫外凝胶成像扫描系统显示此表达蛋白占菌体总蛋白的5％左右。纯化蛋白纯度大于95％。折合产率700μg/1L菌液。
(6)ELISA检测scFvC6.5-sTrail对不同程度表达HER2/neu的肿瘤细胞的结合活性将SKOV-3、MCF-7和A-375细胞分别培养至对数期，以每孔5×104接种96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养12h。舍弃上清，4℃使用丙酮固定15min。5％BSA/PBS溶液100μl 37℃封闭2h后，分别加入不同浓度纯化后的scFvC6.5-sTrail 50μl/孔，37℃孵育2h。PBS洗三次，加入鼠抗6×His·Tag抗体(1∶2000)50μl，37℃孵育2h。PBS洗三次，再加入HRP标记的羊抗鼠抗体50μl，37℃孵育1h。PBS洗三次，加入OPD底物5min，加12.5％硫酸50μl/孔中止反应。置酶标仪测492nm吸光度值。加入PBS的一组为阴性对照。每个样品设三个平行孔，结果取三次重复试验的平均值。
ELISA实验表明，免疫毒素scFvC6.5-sTrail结合卵巢癌SKOV-3细胞的活性最高，而且随着剂量的增高而加强，结合乳腺癌MCF-7细胞的能力较弱，几乎不结合黑色素瘤A-375细胞。这说明融合蛋白scFvC6.5-sTrail的结合活性是特异的，能够区分HER2/neu阳性和阴性细胞。
(7)融合蛋白scFvC6.5-sTrail的细胞杀伤活性试验MTT法检测不同浓度scFvC6.5-sTrail对SKOV-3、MCF-7和A-375三种细胞的细胞毒活性将培养至对数期的SKOV-3、MCF-7和A-375细胞，分别以每孔104传人96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养12h。加入不同浓度的scFvC6.5-sTrail50μl/孔，培养12h。加入MTT至终浓度为1mg/ml。孵育2h。吸净培养液。加入50μl DMSO。振荡5min，置于酶标仪中测定A570吸光度值。加入含10％甘油的PBS的一组为阴性对照。每组设三次平行，取三次试验平均值。设空白对照。
MTT法检测50nM下不同时间scFvC6.5-sTrail对SKOV-3、MCF-7和A-375三种细胞的细胞毒活性与上述方法相同，在加入scFvC6.5-sTrail后2、8、12、16、24h，分别加入MTT至终浓度为1mg/ml。测定A570吸光度值。
MTT试验表明scFvC6.5-sTrail对HER2/neu高表达细胞SKOV-3的生长具有显著的抑制作用，并且为剂量依赖性。在一定浓度下，scFvC6.5-sTrail对HER2/neu中度表达的MCF-7细胞也存在明显的细胞毒效应，而对HER2/neu表达阴性的细胞A-375不敏感。
当申请人选择50nM scFvC6.5-sTrail作为固定剂量，观察不同时间(2-24h)对细胞生长的影响时，发现scFvC6.5-sTrail对细胞生长的抑制作用自孵育后第12开始加速，在第24h时，SKOV-3细胞死亡率接近100％，MCF-7细胞死亡率约80％；而HER2/neu表达阴性的细胞A-375没有随着时间的延长产生明显的细胞毒现象，说明scFvC6.5-sTrail对靶细胞的杀伤作用呈现时间依赖性。
SEQUENCE LISTING<110>中国科学院沈阳应用生态研究所<120>scFvC6.5-sTrail融合基因和蛋白及制备<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1305<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1305)<223>
<400>1cat atg cag gtg cag ctg ttg cag tct ggg gca gag ttg aaa aaa ccc48His Met Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro1 5 10 15ggg gag tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc96Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr20 25 30agc tac tgg atc gcc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag144Ser Tyr Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45tac atg ggg ctc atc tat cct ggt gac tct gac acc aaa tac agc ccg192Tyr Met Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro50 55 60tcc ttc caa ggc cag gtc acc atc tca gtc gac aag tcc gtc agc act240Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr65 70 75 80gcc tac ttg caa tgg agc agt ctg aag ccc tcg gac agc gcc gtg tat288Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr85 90 95ttt tgt gcg aga cat gac gtg gga tat tgc agt agt tcc aac tgc gca336Phe Cys Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala100 105 110aag tgg cct gaa tac ttc cag cat tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc384Lys Trp Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr115 120 125gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc432
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly130 135 140gga tcg cag tct gtg ttg acg cag ccg ccc tca gtg tct gcg gcc cca480Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro145 150 155 160gga cag aag gtc acc atc tcc tgc tct gga agc agc tcc aac att ggg528Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly165 170 175aat aat tat gta tcc tgg tac cag cag ctc cca gga aca gcc ccc aaa576Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys180 185 190ctc ctc atc tat ggt cac acc aat cgg ccc gca ggg gtc cct gac cga624Leu Leu Ile Tyr Gly His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg195 200 205ttc tct ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc agt ggg672Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly210 215 220ttc cgg tcc gag gat gag gct gat tat tac tgt gca gca tgg gat gac720Phe Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp225 230 235 240agc ctg agt ggt tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta768Ser Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu245 250 255ggt gcg gcc gca ggt gga ggc gga tcc gtg aga gaa aga ggt cct cag816Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln260 265 270aga gta gca gct cac ata act ggg acc aga gga aga agc aac aca ttg864Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu275 280 285tct tct cca aac tcc aag aat gaa aag gct ctg ggc cgc aaa ata aac912Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn290 295 300tcc tgg gaa tca tca agg agt ggg cat tca ttc ctg agc aac ttg cac960Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His305 310 315 320ttg agg aat ggt gaa ctg gtc atc cat gaa aaa ggg ttt tac tac atc1008Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile325 330 335tat tcc caa aca tac ttt cga ttt cag gag gaa ata aaa gaa aac aca1056Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr340 345 350aag aac gac aaa caa atg gtc caa tat att tac aaa tac aca agt tat1104Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr355 360 365cct gac cct ata ttg ttg atg aaa agt gct aga aat agt tgt tgg tct1152Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser370 375 380aaa gat gca gaa tat gga ctc tat tcc atc tat caa ggg gga ata ttt1200Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe385 390 395 400gag ctt aag gaa aat gac aga att ttt gtt tct gta aca aat gag cac1248Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His405 410 415ttg ata gac atg gac cat gaa gcc agt ttt ttc ggg gcc ttt tta gtt1296Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val420 425 430ggc ctc gag1305Gly Leu Glu435
<210>2<211>435<212>PRT<213>人工序列<400>2His Met Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro1 5 10 15Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr20 25 30Ser Tyr Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45Tyr Met Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro50 55 60Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr65 70 75 80Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr85 90 95Phe Cys Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala100 105 110Lys Trp Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr115 120 125Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly130 135 140Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro145 150 155 160Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly165 170 175Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys180 185 190Leu Leu Ile Tyr Gly His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg195 200 205Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly210 215 220Phe Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp225 230 235 240Ser Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu245 250 255
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1.一种scFvC6.5-sTrail融合基因，其特征在于具有序列表SEQ ID NO1中的碱基序列。
2.一种权利要求1所述scFvC6.5-sTrail融合基因的编码蛋白，其特征在于具有序列表SEQ ID NO2中的氨基酸序列。
3.一种权利要求2所述scFvC6.5-sTrail融合基因的编码蛋白的制备，其特征在于1)制备scFvC6.5-sTrail融合基因以人源化单链抗体scFvC6.5和人的可溶性TNF相关的凋亡诱导配体sTrail基因的114-281碱基片断为模板，进行PCR，扩增产物经琼脂糖电泳回收后，经双酶切，插入到表达载体pET28a中，进行酶连接反应，得到pET28a-scFvC6.5-sTrail；2)制备scFvC6.5-TNF-α融合蛋白将上述的pET28a-scFvC6.5-sTrail转化致大肠杆菌BL21中，进行表达；运用IMAC梯度复性法对表达产物进行变性、复性及纯化，得到scFvC6.5-sTrail分纯产品。
4.一种权利要求2所述scFvC6.5-TNF-α融合基因的编码蛋白的应用，其特征在于用于制备对高表达HER2/neu的肿瘤细胞具有强特异性杀伤作用的药物中。
全文摘要
本发明涉及靶向抗肿瘤药物和基因重组技术，具体地说是scFvC6.5－sTrail融合基因和蛋白及制备，scFvC6.5－sTrail融合基因具有序列表1的碱基序列。scFvC6.5－sTrail融合基因经过表达、变性、复性纯化得到免疫毒素scFvC6.5－sTrail。体外实验证实该融合蛋白对HER2/neu高表达的肿瘤细胞具有明显杀伤作用，而对HER2/neu阴性的细胞没有杀伤作用，显示出肿瘤杀伤强特异性。该免疫毒素为细胞表面过度表达HER2/neu的肿瘤靶向治疗展示了潜在的应用前景。
文档编号C12P21/02GK1865445SQ20051004647
公开日2006年11月22日 申请日期2005年5月20日 优先权日2005年5月20日
发明者吴文芳, 蒋琳, 吕安国 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所