专利名称：一种TrxA表达调控及编码区基因及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因重组和蛋白表达领域，具体说是一种TrxA表达调控及编码区基因及其制备和应用，构建了一种利用TrxA促进外源蛋白可溶性表达的原核表达载体。
背景技术：
大肠杆菌硫氧还蛋白作为一种氧化还原蛋白，具有催化蛋白质二硫键还原的功能，可以帮助蛋白质正确折叠。实验证明将TrxA基因融合表达于外源基因的上游，可以增加外源蛋白的可溶性。但是表达的外源蛋白由于氨基端融合了较大的TrxA蛋白，对其自身的生物学功能将造成一定影响，必须使用特殊的多肽酶(如肠激酶)切下TrxA.且切割效率很低。近年来国内外学者用不同质粒游离共表达TrxA的方法取代TrxA融合蛋白。利用TrxA具有类似分子伴侣的特点，将外源蛋白的表达质粒与TrxA表达质粒共转化同一宿主菌并共表达，显著地增加了外源蛋白表达产物的可溶性。但由于质粒的不相容性，使该方法的使用受到一定限制。而在同一质粒中共表达游离TrxA的方法尚未见报导。
发明内容
本发明的目的是构建一种TrxA表达调控及编码区基因及其制备和应用，获得一种利用TrxA游离共表达促进外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的新型原核表达载体。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为克隆TrxA的表达调控及编码区基因，包含SphI和BglII限制性内切酶位点、T7启动子(T7 promoter)、乳糖操纵子(Lac Operator)、核糖体结合位点(ribosome binding site，tbs)及成熟TrxA蛋白编码区和中止子的融合基因，其具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列；TrxA的调控及编码区基因的制备方法，以表达载体pET-32a基因为模板，采用引物TrxA-F，5’-CGT GCA TGC TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3’TrxA-R，5’-ATG AGA TCT TTA GGC CAG GTT AGC GTC-3’。
通过PCR技术扩增出TrxA的表达调控及编码区基因片段；克隆出的TrxA表达调控及编码区基因碱基序列如下SEQ ID NO1GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGG 40Promoter Lac Operator
CCTCTAGAAA TAATTTTGTT TAACTTTAA 80 ATAT ACATATGAGC GATAAAATTA TTCACCTGAC120RBSCDSTGACGACAGT TTTGACACGG ATGTACTCAA AGCGGACGGG160GCGATCCTCG TCGATTTCTG GGCAGAGTGG TGCGGTCCGT200GCAAAATGAT CGCCCCGATT CTGGATGAAA TCGCTGACGA240ATATCAGGGC AAACTGACCG TTGCAAAACT GAACATCGAT 280CAAAACCCTG GCACTGCGCC GAAATATGGC ATCCGTGGTA320TCCCGACTCT GCTGCTGTTC AAAAACGGTG AAGTGGCGGC360AACCAAAGTG GGTGCACTGT CTAAAGGTCA GTTGAAAGAG400TTCCTCGACG CTAACCTGGC CTAAAGATCT430利用限制性核酸内切酶SphI和BglII的酶切连接技术，将克隆的TrxA表达调控及编码区基因(序列表SEQ ID NO1中碱基序列)整合入表达载体pET-28a克隆表达区上游(替代原pET28-a表达载体401位至598位的碱基序列)；使在同一质粒载体中，利用TrxA与外源蛋白以游离而非融合形式共表达促进外源蛋白可溶性表达。
本发明具有如下优点1.本发明采用在单质粒中共表达TrxA和外源蛋白的方法，克服了质粒不相容性的问题，简化了质粒转化的操作。
2.目前国内外利用TrxA促外源蛋白可溶性表达的方式都为同质粒融合共表达或不同质粒游离共表达；本发明采用使TrxA蛋白与外源蛋白以非融合形式游离共表达的策略(同质粒游离共表达)，使表达的外源蛋白不受TrxA蛋白的影响，也无需表达后的多肽酶切割。
3.本发明为人工构建的一种新型原核表达载体trxA-pET-28a，利用TrxA具有类似分子伴侣的特点，该载体可促进在大肠杆菌中表达的外源蛋白的正确折叠，提高可溶性表达水平，减少不溶性包涵体表达量。
4.对于实施例制备的新型表达载体，本发明利用两个相同的启动子(T7promoter)调控TrxA与外源蛋白的表达，可以仅使用一种诱导物进行诱导，并且使TrxA与外源蛋白的表达同步进行(TrxA表达区在外源蛋白表达区的上游，引入新的酶切位点和中止子)，实现共表达。共表达的TrxA可以明显促进外源蛋白单链抗体ML3.9(scFv-ML)、3-羟基苯甲酸-6-单加氧酶(3HBA)的可溶性表达，并明显减少肠毒素C2(SEC2)、结核杆菌螺旋酶A亚基(GYRA)的包涵体表达。该新型表达载体的构建将有利于基因工程方法制备各种可溶性外源蛋白。
图1为PCR扩增的TrxA表达调控及编码区基因以1.2％琼脂糖凝胶电泳分析结果图，其中1.trxA的PCR扩增产物；2.DL2000 DNA分子量标准；
图2为游离共表达的TrxA促scFv-ML3.9可溶性表达的12％SDS-PAGE电泳分析图，其中1.未诱导的pET-28a-ml阳性克隆；2.诱导的pET-28a-ml阳性克隆全细胞表达；3.诱导的pET-28a-ml阳性克隆可溶性表达；4.诱导的pET-28a-ml阳性克隆包涵体表达；5.未诱导的trxA-pET-28a-ml阳性克隆；6.诱导的trxA-pET-28a-ml阳性克隆全细胞表达；7.诱导的trxA-pET-28a-ml阳性克隆可溶性表达；8.诱导的trxA-pET-28a-ml阳性克隆包涵体表达；9.蛋白分子量标准；图3为游离共表达的TrxA促3HBA可溶性表达的12％SDS-PAGE电泳分析图，其中1.未诱导的pET-28a-3hba阳性克隆；2.诱导的pET-28a-3hba阳性克隆全细胞表达；3.诱导的pET-28a-3hba阳性克隆可溶性表达；4.诱导的pET-28a-3hba阳性克隆包涵体表达；5.未诱导的trxA-pET-28a-3hba阳性克隆；6.诱导的trxA-pET-28a-3hba阳性克隆全细胞表达；7.诱导的trxA-pET-28a-3hba阳性克隆可溶性表达；8.诱导的trxA-pET-28a-3hba阳性克隆包涵体表达；9.蛋白分子量标准；图4为游离共表达的TrxA促SEC2可溶性表达的12％SDS-PAGE电泳分析图，其中1.未诱导的pET-28a-sec2阳性克隆；2.诱导的pET-28a-sec2阳性克隆全细胞表达；3.诱导的pET-28a-sec2阳性克隆可溶性表达；4.诱导的pET-28a-sec2阳性克隆包涵体表达；5.未诱导的trxA-pET-28a-sec2阳性克隆；6.诱导的trxA-pET-28a-sec2阳性克隆全细胞表达；7.诱导的trxA-pET-28a-sec2阳性克隆可溶性表达；8.诱导的trxA-pET-28a-sec2阳性克隆包涵体表达；9.蛋白分子量标准；图5为游离共表达的TrxA促GYRA可溶性表达的12％SDS-PAGE电泳分析图，其中1.未诱导的pET-28a-gyra阳性克隆；2.诱导的pET-28a-gyra阳性克隆全细胞表达；3.诱导的pET-28a-gyra阳性克隆可溶性表达；4.诱导的pET-28a-gyra阳性克隆包涵体表达；5.未诱导的trxA-pET-28a-gyra阳性克隆；6.诱导的trxA-pET-28a-gyra阳性克隆全细胞表达；7.诱导的trxA-pET-28a-gyra阳性克隆可溶性表达；8.诱导的trxA-pET-28a-gyra阳性克隆包涵体表达；9.蛋白分子量标准；具体实施方式
实施例1TrxA的表达调控及编码区基因的制备，其具有序列表SEQ ID NO1中所示的碱基序列(1)SEQ ID NO.1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度430碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性
(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源载体pET32-a质粒DNA(2)TrxA的调控及编码区基因的PCR扩增1)PCR引物设计及反应条件根据TrxA基因序列和pET32-a的DNA序列，设计一组引物正向引物TrxA-F5’-CGT GCA TGC TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3’；反向引物TrxA-R5’-ATG AGA TCT TTA GGC CAG GTT AGC GTC-3’PCR反应体系为10×Pyrobest buffer 5μl、dNTP 250μmol、0.02％BSA 2μl、上下游引物各25pmol、模板pET32-a质粒DNA 0.1μg、PyrobestDNA聚合酶2U，无菌超纯水补齐体积至50μl。
PCR反应条件为第一阶段95℃，5分钟；第二阶段94℃，45秒；55℃，45秒；72℃，35秒；共30个循环；第三阶段72℃，10分钟；2)PCR产物的回收PCR扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析并分离(附图1)，切下大小为430bp的目的带，按杭州维特洁生化技术有限公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收；3)回收后产物的双酶切回收后的PCR产物经限制性核酸内切酶SphI和BglII充分消化，消化产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，再次胶回收。
实施例2新型表达载体trxA-pET-28a的构建(1)pET-28a载体的双酶切将美国Novagen公司pET-28a载体质粒DNA经限制性核酸内切酶SphI和BglII充分消化，消化产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，胶回收纯化5100bp大片段(2)酶切产物的连接及转化将经双酶切的PCR产物片段和pET-28a载体大片段以3∶1的摩尔比例混合，并以T4DNA连接酶16℃连接过夜，构建成表达载体trxA-pET-28a。连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞(转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约JohnWiley&Sons出版社1995年第三版P39-40)，以卡那霉素抗性筛选转化子。
(3)表达载体trxA-pET-28a的验证将挑选的阳性转化子扩培，提取质粒DNA(质粒DNA提取方法按J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆实验指南》美国纽约冷泉港出版社2001年第三版P27-30)，经SphI和BglII双酶切鉴定，并以鉴定正确的重组克隆质粒为模板，用T7启动子和终止子为引物，以Sanger双脱氧末端终止法测序证实。
实施例3
新型表达载体trxA-pET-28a的实际应用及效果评价(1)将外源基因片段连接入新型表达载体trxA-pET-28a将trxA-pET-28a质粒DNA和含有单链抗体ML3.9基因的pET-28a-ml质粒DNA分别用Nco I、Not I双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收770bp的scFv-ml片段及trxA-pET-28a质粒5500bp片段，以T4DNA连接酶16℃连接过夜，构建单链抗体ML3.9与TrxA共表达载体trxA-pET-28a-ml。连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。以卡那霉素抗性筛选转化子，挑选重组克隆扩培，提取质粒DNA，经Nco I、Not I双酶切鉴定正确重组克隆。同样方法以Nhe I、EcoR I双酶切构建3-羟基苯甲酸-6-单加氧酶(3HBA)与TrxA共表达载体trxA-pET-28a-3hba；以EcoRI、XhoI双酶切构建肠毒素C2(SEC2)与TrxA共表达载体trxA-pET-28a-sec2；以EcoRI、XhoI双酶切构建结核杆菌螺旋酶A亚基(GYRA)与TrxA共表达载体trxA-pET-28a-gyra(2)TrxA与外源蛋白的共表达分别接种转化了各重组质粒的BL21(DE3)单菌落于含40μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，过夜活化培养，以1％接种量转接下一级，37℃摇床培养至OD600为0.6，加入终浓度1.0mmol/L的IPTG，30℃诱导表达6小时(3)TrxA促外源蛋白可溶性表达的分析离心收集菌体，用pH7.4的1/10原培养基体积的PBS缓冲液清洗菌体一次并重悬，于0℃超声破碎直至菌液变得清亮，12000r/min离心20分钟，取上清，用1/30原培养基体积的PBS缓冲液重悬沉淀。分别取超声后的总样及离心后得到的上清和沉淀重悬液，以5×上样缓冲液处理(缓冲液配方和处理方法按汪家政，范明《蛋白质技术手册》科学出版社2002第一版P81和P87)，12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色分析表达产物，薄层扫描仪在波长560nm处扫描结果TrxA蛋白、scFvML3.9蛋白、3-HBA蛋白、SEC2蛋白和GYRA蛋白的分子量分别为12kD、36kD、45kD、31kD和96kD，经1.0mmol/L的IPTG的诱导，克隆的trxA基因得到大量表达，且可以和在同一质粒载体中的外源基因游离共表达。
在与TrxA蛋白共表达作用下，scFv-ML3.9蛋白和3-HBA蛋白的可溶性表达量均有显著增加(附图2，3)，SEC2蛋白和GYRA蛋白的包涵体表达显著降低(附图4，5)，可见，TrxA的游离共表达促进了外源蛋白的正确折叠，减少了包涵体的形成，促使蛋白更多地以可溶形式存在。
SEQUENCE LISTING<110>中国科学院沈阳应用生态研究所<120>一种TrxA表达调控及编码区基因及共制备和应用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>430<212>DNA<213>载体pET32-a质粒DNA<220>
<221>CDS<222>(95)..(430)<223>
<400>1gcatgctaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaatt cc cctctagaaa60taattttgtt taactttaag aaggagatat acat atg agc gat aaa att att cac115Met Ser Asp Lys Ile Ile His1 5ctg act gac gac agt ttt gac acg gat gta ctc aaa gcg gac ggg gcg 163Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala10 15 20atc ctc gtc gat ttc tgg gca gag tgg tgc ggt ccg tgc aaa atg atc 211Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile25 30 35gcc ccg att ctg gat gaa atc gct gac gaa tat cag ggc aaa ctg acc 259Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr40 45 50 55gtt gca aaa ctg aac atc gat caa aac cct ggc act gcg ccg aaa tat 307Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr60 65 70ggc atc cgt ggt atc ccg act ctg ctg ctg ttc aaa aac ggt gaa gtg 355Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val75 80 85gcg gca acc aaa gtg ggt gca ctg tct aaa ggt cag ttg aaa gag ttc 403Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe90 95 100ctc gac gct aac ctg gcc taa aga tct 430Leu Asp Ala Asn Leu Ala Arg Ser105 110
<210>2<211>109<212>PRT<213>载体pET32-a质粒DNA<400>2Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp1 5 10 15Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp20 25 30Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp35 40 45Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn50 55 60Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu65 70 75 80Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser85 90 95Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala100 10权利要求
1.一种TrxA表达调控及编码区基因，其特征在于具有序列表SEQ IDNO1中碱基序列。
2.一种TrxA表达调控及编码区基因的制备，其特征在于以表达载体pET-32a基因为模板，采用引物TrxA-F，5’-CGT GCA TGC TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3’；TrxA-R，5’-ATG AGA TCT TTA GGC CAG GTT AGC GTC-3’用PCR技术扩增出具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列的基因片段。
3.一种TrxA表达调控及编码区基因的应用，其特征在于将序列表SEQ ID NO1中碱基序列克隆入pET28-a表达载体401位至598位，构建成促可溶性表达的原核表达载体TrxA-pET28-a。
全文摘要
本发明涉及基因重组和蛋白表达领域，具体说是一种TrxA表达调控及编码区基因及其制备和应用，利用PCR技术克隆大肠杆菌硫氧还蛋白(TrxA)的表达调控及编码区，其具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列；将其克隆至pET－28a启动子上游，构建了一种在单质粒中利用两个相同的启动子游离共表达硫氧还蛋白与目的蛋白的表达系统，以促进外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。结果表明TrxA可与外源蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以非融合形式高效共表达，并促进了表达的外源蛋白的可溶性。
文档编号C12N15/70GK1834246SQ20051004603
公开日2006年9月20日 申请日期2005年3月16日 优先权日2005年3月16日
发明者徐明恺, 张成刚 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所